使用七氟醚麻醉评估海马体 p-CREB 和 c-fos 表达的幼年大鼠学习和记忆研究方法论

摘要

本研究调查了七氟醚如何通过NMDAR/p-CREB/c-fos途径损害记忆保留并降低幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos的表达。结果表明，七氟醚会导致短期记忆缺陷并下调突触可塑性标志物，其效果在 3 天后可逆，与给药频率无关。

摘要

由于神经发育的动态性质、方法论限制和背景障碍，研究大脑发育过程中的认知障碍面临挑战。本研究调查了一种综合方法，通过幼年大鼠的 NMDAR/p-CREB/c-fos 信号通路，研究七氟醚基于记忆和海马神经元中 p-CREB 和 c-fos 表达引起的发育中大脑的认知障碍。将64只21日龄SD雄性大鼠（体重<80g）分为5组：正常（n=8）、60%O₂ （n=16）、假训练（n=8）、单剂量七氟醚（n=16）和多剂量七氟醚（n=16）。将两组七氟醚组分为训练后1 d（sev1a和sev1b组）和30 d（sev30a和sev30b组）牺牲（n=8/亚组）;所有其他大鼠在训练后1小时处死。Y迷宫测试用于评估学习和记忆保留。免疫组化法测定海马标本中p-CREB阳性和c-fos阳性神经元数量。与60%_O2 组（记忆保留率分别为86.33%±17.52%）相比，sev1a组和sev1b组大鼠记忆力显著下降（sev1a：44.29%±11.26%;sev1b：62.42%±7.27%，均P<0.05），sev1b组和sev30b组差异无统计学意义（sev30a：84.41%±14.15%;sev30b：85.21%±11.61%;均P>0.05）。与60%_O2 组（c-fos：92.83 ± 7.88;p-CREB：72.22 ± 8.89）相比，sev1a组（c-fos：23.13 ± 3.28;p-CREB：22.88 ± 5.18）和sev30组（c-fos：23.22 ± 3.13;p-CREB：25.58 ± 2.26）（均P<0.05），而sev30a和sev30b组差异均无统计学意义（均P>0.05）。七氟醚对幼年大鼠记忆维持能力有短期负向刺激作用，对给药频率没有影响。七氟醚降低幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos的表达。

引言

由于神经发育的动态性、方法学限制和背景障碍，研究大脑发育过程中的认知障碍面临着重大挑战。大脑发育涉及快速、非线性的变化，使关键窗口期间损伤的识别变得复杂 ^1,2。在资源匮乏的环境中，护理人员识字率、语言多样性以及获得专业工具（例如 MRI）的机会有限等障碍阻碍了早期筛查¹.大脑成熟的个体差异使得很难将病理偏差与典型发育区分开来 ^2,3。唐氏综合症等疾病表现出皮质发育的改变，但样本量小和组织学数据稀缺限制了机制洞察力⁴.神经发育障碍（例如自闭症谱系障碍、多动症）通常与焦虑或抑郁同时发生，混淆认知评估⁵.某些人群的严重沟通缺陷限制了标准化测试的使用⁶.这些功能导致了几个研究设计问题。事实上，大多数研究都使用横断面设计，未能对个体内部随时间的变化进行建模。过度依赖西方受过教育的人群（“奇怪”样本）⁷。唐氏综合症研究的死后大脑样本较少，年龄匹配对照不足⁴.生态瞬时评估工具难以解释影响日常认知表现的上下文变量⁵.

动物和人脑中最重要的功能包括学习和记忆，它们对人类发展和一般生活至关重要⁸。婴儿的大脑处于发育阶段，容易受到药物和麻醉等外部因素的影响 ^9,10。麻醉剂对婴儿记忆功能造成的损害是一个重要的临床研究课题，甚至会因无法进行麻醉而延迟儿科患者的最佳治疗¹¹。麻醉相关的认知功能障碍（或术后认知功能障碍，POCD）可能会对婴儿产生长期影响¹².吸入七氟醚会影响婴儿的记忆功能^13,14，但传统麻醉学认为，婴儿脑损伤主要是由于麻醉期间脑缺氧引起的，尤其是在全身麻醉下¹⁰。因此，只要大脑没有短期或长期缺氧，就应该降低婴儿中枢神经系统损伤的风险¹¹.尽管如此，对 POCD 的理解仍然不理想。需要手术的婴儿需要麻醉，更好地了解所涉及的途径可能有助于设计麻醉策略，以最大限度地降低 POCD 的风险。

一项涉及接受非心脏手术的老年患者的研究显示，近25%的患者在术后1周内出现POCD，3个月后比例下降至10%以下，而对照组的POCD率分别为3.4%和2.8%¹⁵。该研究还表明，大多数 POCD 病例是可逆的，只有少数患者经历长期或永久性 POCD¹⁵。在中枢神经系统中，谷氨酸是最常见的兴奋性氨基酸¹⁶。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）对于诱导和维持长期增强（LTP）和长期抑郁（LTD）至关重要¹⁷。对小鼠的研究表明，兴奋性突触可塑性直接影响大脑功能发育¹⁸，其中 NMDAR 激活和钙流入尤为重要^19,20。增强的NMDAR活性对诱导突触生长和可塑性具有重要意义^19,20。因此，NMDAR拮抗剂（例如七氟醚）对NMDAR的较高程度阻断应导致较低的学习和记忆能力²¹。虽然七氟醚对成人大脑学习和记忆的影响尚未得出明确的结论^22,23，但七氟醚通常用于儿科手术中的麻醉¹⁴。作为NMDAR的非竞争性拮抗剂，七氟醚可以显着影响大脑的学习和记忆功能11,13,14,23,24。然而，除了NMDAR之外，其他途径和蛋白质也参与学习和记忆，涉及磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）和即刻早期基因c-fos的记忆调节机制正变得越来越清晰25,26,27，但仍需要更好地了解婴儿和儿童的最佳麻醉输送。

基于这些理论框架，本研究研究了一种综合方法，可用于研究七氟醚通过NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路在海马神经元中记忆和p-CREB和c-fos表达引起的发育中大脑的认知障碍。这些结果可能有助于提高我们对全身麻醉后POCD和记忆障碍的理解。这项研究使用了 21 天龄的大鼠，因为它们刚刚断奶，体重和生理状态高度均匀，与人类青春期早期相对应。由于它们在这个关键发育时期的神经可塑性和脆弱性增强，它们可以有效地模拟手术或麻醉对未成熟大脑造成的认知障碍^28,29。这使得它们特别适合研究与小儿手术相关的神经认知风险并探索潜在的干预策略。Y 迷宫是评估学习和记忆的常用方法³⁰。免疫组织化学通常用于研究神经元和各种神经元蛋白。

方案

本研究的所有方案均经上海交通大学医学院附属新华医院伦理委员会审查批准（批准号XHEC-C-2016-023-2）。

1. 动物实验概述和分组

1. 获得64只21日龄雄性SD大鼠（体重低于80g）。
2. 将大鼠分为五组：正常组（n = 8），60%O₂ 组（n = 16），假训练组（n = 8），单剂量七氟醚组（n = 16）和多剂量七氟烷组（n = 16）（见 表1）。
3. 将老鼠饲养在 20-24 °C、湿度为 50%-60% 和自然光的动物设施中。
4. 提供足够的食物和水。
5. 确保所有协议都经过伦理委员会的审查和批准。
6. 准备吸入室（参见 补充图S1，详见第2.1节）。
7. 正常组
   1. 将大鼠暴露在60%的空气中2小时（详见第2.2节）。
   2. 在暴露后 1 天进行 Y 迷宫测试（详见第 4 节）。
   3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。
8. 60% O₂ 组
   1. 将大鼠暴露在60%的空气中2小时（详见第2.2节）。
   2. 在暴露后 30 天进行 Y 迷宫测试（详见第 4 节）。
   3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。
9. 假培训组
   1. 将大鼠暴露在60%的空气中2小时（详见第2.2节）。
   2. 在暴露后 1 天进行 Y 迷宫测试，无需结构化训练（灯光和电击区位置随机变化），用于控制光和电刺激对学习和记忆的影响（详见第 4 节）。
   3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。
10. 单剂量七氟醚组（sev1a组）
    1. 将大鼠暴露于60%空气+ 3%七氟醚中2小时（详见第2.2节）。
    2. 在暴露后 1 天进行 Y 迷宫测试（详见第 4 节）。
    3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。
11. 单剂量七氟醚组（sev30a组）
    1. 将大鼠暴露于60%空气+ 3%七氟醚中2小时（详见第2.2节）。
    2. 在暴露后 30 天进行 Y 迷宫测试（详见第 4 节）。
    3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。
12. 重复给药七氟烷组（sev1b组）
    1. 将大鼠暴露于60%空气+ 3%七氟醚中，每天2小时，连续7天（详见第2.2节）。
    2. 在暴露后 1 天进行 Y 迷宫测试（详见第 4 节）。
    3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。
13. 重复给药七氟醚组（sev30b组）
    1. 将大鼠暴露于60%空气+ 3%七氟醚中，每天2小时，连续7天（详见第2.2节）。
    2. 在暴露后 30 天进行 Y 迷宫测试（详见第 4 节）。
    3. 行为测试后收集组织（详见第 5 节）。

2. 七氟醚吸入

1. 腔室的准备（见 补充图S1）
   1. 将盒子左侧的孔连接到 60% O₂/40% N₂。
   2. 将氧气供应连接到七氟醚蒸发器。
   3. 将盒子右侧的孔连接到麻醉机的气体分析仪。
   4. 将腔室顶部的孔连接到废气上。
   5. 将石灰放在腔室底部的网眼下方，然后加入棉绒。
   6. 将装置放入通风橱中。
   7. 在腔室下方放置一个加热垫。
2. 吸入
   1. 打开氧气供应和七氟醚蒸发器。
   2. 将氧气流量调整为 2 L/min。
   3. 当七氟醚浓度达到3.0%时，保持流量30分钟以稳定室内气氛。
   4. 将一只老鼠放在腔室的棉质一侧。
   5. 根据分组将大鼠留在那里（参见步骤1.2）。
   6. 监测肤色、呼吸频率、心率和脉搏血氧饱和度。
   7. 把老鼠移走。
   8. 让老鼠自然苏醒。
   9. 将老鼠放回笼子里。

3. 实验试剂和仪器

1. 试剂制备
   1. 制备 250 mL 市售七氟醚用于麻醉给药。
   2. 通过将储备抗体1：350稀释来制备p-CREB抗体工作溶液。
   3. 通过将储备抗体稀释1：200来制备c-fos抗体工作溶液。
   4. 组装试剂盒进行免疫组织化学染色。
   5. 制备4%多聚甲醛。
      1. 将40g可溶性多聚甲醛（PFA）溶解在装有500mL高纯水的玻璃容器中，连续加热并磁力搅拌至60-65°C，直至形成乳状悬浮液。
      2. 加入 1.0 mol/L NaOH 滴，直到溶液变清 （pH = 7.0）。
      3. 加入约 500 mL PBS 并在冰浴或冷水浴中充分混合。
      4. 再次检查 pH 值，过滤，并制成高达 1000 mL 的体积。
      5. 储存在 4 °C 以备将来使用。
2. 设备设置
   1. 将Y迷宫放置在行为测试区域（见 补充图S2）。
   2. 使用集成成像系统校准显微镜以进行组织学分析。
3. 安装带有新刀片的切片机以进行组织切片。
4. 使用标准组织处理方案对脱水机进行编程。
5. 根据机器制造商的说明，准备带有顺序染色浴的染色机。
6. 设置灌注装置。
   1. 使用两个塑料包装的生理盐水瓶，从底部开口排出生理盐水，并用PBS和4%多聚甲醛固定剂填充。
   2. 将瓶子挂起来，将它们与输液器连接起来，并在输液器的粗针端连接一个三通旋塞阀。

4. Y迷宫和学习/记忆测试

1. 组装 Y 迷宫
   1. 使用三个标记为 I、II 和 III 的矩形臂设置 Y 迷宫，并通过三角形连接连接（见 补充图 S2）。
   2. 在迷宫底部放置一个间距为 1 厘米的电网格。
   3. 在迷宫墙壁上贴上2厘米的细铜条，模拟危险区域，安装刺激信号灯。
2. 定义危险和安全区域
   1. 以 16,000 V/m 的电压对区域 I、II 和 III 进行通电，以指示危险区域（通电时信号灯亮起）。
   2. 用红灯标记未带电区域以指示安全区域。
   3. 将手臂之间的连接处定义为大鼠可能受到电击的非安全区域。
3. 培训程序
   1. 在实验开始时，将大鼠所在的区域视为安全区域。
   2. 2-4分钟后，向安全区域通电，鼓励大鼠向安全区域移动。
   3. 如果老鼠从安全区移动到危险区，它会在电击下返回安全区，表现出被动回避反应。
4. 制定主动回避反应
   1. 多次训练后，在不电击的情况下打开安全区域的灯。
   2. 观察大鼠向照明安全区域的运动，形成明暗辨别条件反射（主动回避反应）。
5. 将 Y 迷宫放置在光线昏暗且安静的地方，以尽量减少外部干扰。
6. 每天上午 9：00-11：00 和下午 2：00-4：00 之间进行培训。
7. 实验前让大鼠在迷宫内自由移动5分钟，帮助它们适应迷宫环境。
8. 调整刺激参数
   1. 测试时调整刺激电压（16,000 V/m），以确保大鼠在受到电击后10秒内逃脱。
   2. 保持安全区域信号灯亮起 15 秒，然后将其关闭。
   3. 间隔 45 秒后开始下一轮冲击实验。
9. 信号灯序列和正确响应
   1. 设置信号灯在一个周期内打开的顺序，即 I → II → III → I。
   2. 将正确反应定义为大鼠在受到电击后 10 秒内从起始区域直接逃到照明安全区。
10. 如果大鼠在连续 10 次试验中有 8 次做出正确的逃逸反应，则认为它已经达到了学习标准。
11. 将任何逃逸到没有光的手臂记录为错误反应。
12. 多次培训和测试课程
    1. 执行多个训练和测试会话以评估学习和记忆。
    2. 记录固定次数的试验中正确和错误的回答次数。
    3. 更改起始区域以增加任务复杂性。
13. 每隔一段时间（例如，训练后24或48小时）评估记忆保留，以评估大鼠的记忆保留能力。

5. 免疫组化

1. 麻醉大鼠
   1. 训练后1小时腹腔注射10%水合氯醛（0.4mL / 100g）以麻醉大鼠。根据当地法规处理水合氯醛溶液。
   2. 进行开胸手术以完全暴露心脏³¹.
2. 用生理溶液灌注麻醉的大鼠
   1. 将含有PBS的针头沿主动脉方向插入左心室，用止血钳固定针头，立即切开小鼠的右耳廓以释放静脉血。
   2. 快速注射PBS，直到流出物清澈，肝脏和肺部呈白色。
   3. 随后快速然后缓慢输注 500 mL 10% 福尔马林溶液，直到动物身体变硬，达到福尔马林固定。
   4. 根据当地法规处理福尔马林溶液。
3. 去除大脑
   1. 快速打开头骨³².
   2. 通过轻轻地将整个大脑从头骨中提起并在底部切开血管和脊髓来切除整个大脑，而不损伤半球（如 补充图S3所示）。
4. 解剖海马体
   1. 解剖双侧海马体。
      1. 在小鼠的枕孔处，用剪刀剪断整个大脑。
      2. 小心地将剪刀斜插入枕骨大孔以切割顶骨。
      3. 用止血钳撬开顶骨的两侧。
      4. 用剪刀剪断一侧的视神经，向下探查至颅底。
   2. 将海马体置于 10% 福尔马林溶液中 12 小时。
   3. 将标本浸入含有蔗糖梯度（10%，20%，30%）的福尔马林中。
   4. 在 4°C 下保持过夜，直到标本组织沉到底部。
5. 嵌入和切片标本
   1. 将标本嵌入石蜡中。根据当地法规处理福尔马林溶液。
   2. 将嵌入的样品切片至4μm。
6. 对切片进行脱蜡和再水化
   1. 将切片浸泡在 50 mL 二甲苯中 3 次进行脱蜡，每次 15 分钟。
   2. 依次浸入 50 mL 100%、90%、70% 和 50% 乙醇中各 10 分钟。
   3. 用 50 mL 0.01 mM PBS 冲洗 3 次，每次 3 分钟。
7. 抗原修复
   1. 将切片置于 50 mL 柠檬酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0）中。
   2. 在不锈钢压力锅中将各部分加热至 120 °C。 将切片放在机架上，完全浸入缓冲液中。密封炊具，加热，在高压下保持3分钟。
   3. 将炊具从火上移开，在室温下自然冷却，然后打开盖子。
   4. 在PBS（pH 7.2）中冲洗切片2分钟，重复3次。
   5. 应用约 100-200 μL 3% H₂O₂ 覆盖载玻片上的 sectgion，并在室温下孵育 5-10 分钟以消除内源性过氧化物酶活性。
   6. 用PBS冲洗2分钟，3次。
8. 一抗孵育
   1. 向切片中加入 200 μL 一抗（在 0.01 mol/L PBS 中以 1：150 稀释）。
   2. 在4°C下孵育过夜。
9. 二抗孵育
   1. 在PBS中冲洗切片3分钟，3次。
   2. 用大约 100-200 μL 聚合物辅助剂孵育切片以覆盖载玻片上的切片，并在 37°C 下孵育 20 分钟。
   3. 在0.1 mol / L PBS中冲洗切片2分钟，3次。
   4. 加入约100-200μL聚过氧化物酶抗小鼠/兔IgG，并在37°C下孵育20分钟。
   5. 在PBS中冲洗切片3分钟，3次。
10. 显色
    1. 加入大约 100-200 μL 二氨基联苯胺 （DAB） 溶液（足以覆盖载玻片上的部分）以显色。
    2. 让它反应大约 3 分钟。
11. 复染和安装
    1. 通过滴加约 100-200 μL 苏木精以完全覆盖每张载片上的切片来进行复染。
12. 脱水并安装切片
    1. 在50mL的50%，70%，90%和100%乙醇中脱水切片10分钟，然后50mL二甲苯10分钟。
    2. 使用标准程序清理和安装这些部分。
13. 显微镜检查
    1. 计算每组海马体中p-CREB-和c-fos阳性神经元的数量^33,34。
    2. 在显微镜下以 400 倍放大倍率检查切片。
    3. 根据每只动物三个部分的计数，记录每个切片中阳性神经元的平均数量，没有重叠。
       注意：所有数据均编译在计算机电子表格中。所有分析均使用统计软件进行。结果以均值±均值标准误差 （SEM） 表示，并使用单因素方差分析与 SNK-q 和 Dunnett T3 事后检验³⁵ 进行分析。SNK-q检验通常用于探索性研究，适用于多个样本均值之间的成对比较。它不依赖于预定义的假设，使其成为比较所有组均值³⁶ 的理想选择。Dunnett T3 检验通常用于具有预定义假设的验证性研究。它适用于将多个治疗组与对照组进行比较或用于比较具有特殊专业意义的方法^35,37。当方差分析检验的 P 值≤ 0.05 时，进行成对事后检验以确定哪些组与其他组有显着差异。双侧 P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。

结果

使用本研究的数据作为说明性示例，我们展示了可以使用该方法框架生成的结果类型，包括具有代表性的免疫染色图像以及来自不同组的行为和分子数据。重点是介绍这种方法产生的典型或预期结果，而不是提供对其生物学意义的解释。

各组大鼠的学习记忆测试结果
将实验组与60% O₂ 组进行比较。单剂量七氟醚组（sev1a）和多剂量七氟醚组（sev1b）大鼠的记忆力，即试验后1 h处死的大鼠表现出显著下降（均 P < 0.05），而试验后3 d处死的大鼠无显著差异（均 P > 0.05）（表2）。

c-fos和p-CREB蛋白在大鼠海马体中的表达
正常组大鼠海马神经元c-fos水平低于其他组，假训练组大鼠海马神经元p-CREB水平低于其他组。与60%O₂ 组相比，sev1a和sev1b组（即训练后1 h处死）、假训练组和正常组（均 P

讨论

本研究探讨了七氟醚如何通过NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路影响记忆并调节幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos的表达。结果表明，七氟醚对幼年大鼠记忆维持能力有短期（训练后1 h，而不是3 d后）的负向刺激作用，不受给药频率（单次给药或7 d共7剂）的影响。七氟醚在训练后1 h显著降低幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos的表达。

本研究调查了七氟醚与学习和记忆保留之间的关系，作为研究学习和记忆的综合方法的概念证明。Ca²⁺可以通过NMDA受体（NMDARs）或电压依赖性钙通道进入细胞，随后通过多种信号通路触发各种即刻早期基因（IEG）的转录，例如c-fos和p-CREB¹³。这些基因随后被翻译成相应的蛋白质产物，作为转录因子进一步调控靶基因的转录，从而参与突触可塑性的过程。CREB是转录因子之一，其活性受磷酸化调节。它位于细胞核中，并在所有类型的脑细胞中表达。Ser-133残基（p-CREB）的磷酸化是启动各种下游基因转录...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验动物
Sprague-Dawley （SD） 大鼠	Charles River Laboratories（中国北京）	不适用	21 日龄，雄性
标准鼠粮	Keao Xieli Feed（中国北京）	不适用	标准实验动物日粮
化学品和试剂
水合氯醛	国药化学试剂（中国上海）	80113818	终末灌注麻醉剂
柠檬酸盐缓冲液 （10x）	ZSGB-BIO （中国北京）	ZLI-9064型	抗原修复溶液，pH 6.0
乙醇 （100%）	国药化学试剂（中国上海）	100092683	用于组织学的脱水剂
苏木精染色液	Baso Diagnostics Inc.（中国珠海）	BA-4041型	IHC 复染剂
过氧化氢 （H2O2）	国药化学试剂（中国上海）	10011218	用于阻断内源性过氧化物酶的 3% 溶液
中性香脂	Solarbio（中国北京）	G8590型	载玻片的封片介质
氮 （N2）	上海医用气体有限公司（中国上海）	不适用	高纯度，用于气体混合物
氧气 （O2）	上海医用气体有限公司（中国上海）	不适用	医用级， 用于混合气体
石蜡	徕卡生物系统公司（德国努斯洛赫）	39601006	组织包埋培养基
多聚甲醛 （PFA）	Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）	158127	用于组织灌注和固定的固定剂
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Gibco（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）	70011044	10x 储备液，pH 7.4
七氟醚	艾伯维公司（美国伊利诺伊州北芝加哥）	不适用	吸入麻醉剂
苏打石灰	W. R. Grace and Co.（美国马里兰州哥伦比亚）	22-01-0010	吸入室用CO2吸收剂
氢氧化钠 （NaOH）	国药化学试剂（中国上海）	10019818	用于PFA溶液的pH调节
蔗糖	山工生物科技（中国上海）	A502693	用于脑组织的冷冻保护
二甲苯	国药化学试剂（中国上海）	10023418	组织学透明剂
抗体和试剂盒
c-Fos抗体	Abcam（英国剑桥）	编号：AB190289	兔抗小鼠，一抗
DAB 显色剂盒	ZSGB-BIO （中国北京）	ZLI-9018	用于 HRP 显色的底物
p-CREB （Ser133） 抗体	细胞信号传导技术（美国马萨诸塞州丹佛斯）	9198	兔抗小鼠，一抗
聚合物 HRP 检测试剂盒	ZSGB-BIO （中国北京）	光伏-9000	IHC二抗和检测系统
设备
麻醉机	RWD Life Science（中国深圳）	R500	用于受控气体混合物输送
自动化组织处理器	徕卡生物系统公司（德国努斯洛赫）	ASP6025	用于自动脱水和清除
低温恒温器/切片机	徕卡生物系统公司（德国努斯洛赫）	CM1950	用于冷冻/包埋脑组织的切片
显微镜系统	奥林巴斯（日本东京）	BX53型	用于 IHC 载玻片的成像
灌注泵	Longer Precision Pump Co.（中国保定）	BT100-2J	用于经心灌注的蠕动泵
七氟醚蒸发器	RWD Life Science（中国深圳）	R510PS	用于精确控制七氟醚浓度
Y-Maze 装置	Med Associates Inc.（美国佛蒙特州圣奥尔本斯）	MED-VFC-S-Y	带有电网和主动避让灯
软件
GraphPad 棱镜	GraphPad 软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）	版本 9	统计分析和数据可视化
图像J	美国国立卫生研究院（美国马里兰州贝塞斯达）	版本 1.53	用于细胞计数的图像分析软件
Microsoft Excel	Microsoft Corporation（美国华盛顿州雷德蒙德）	办公室 365	用于数据编译的电子表格软件