本研究探讨了七氟醚如何通过NMDAR/p-CREB/c-fos通路损害幼年大鼠海马神经元中的记忆保持能力，并降低p-CREB和c-fos的表达。结果显示，七氟醚可导致短期记忆障碍，并下调突触可塑性相关标志物的表达，这些效应在3天后可逆，且与给药频率无关。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
本研究探讨了七氟醚如何通过NMDAR/p-CREB/c-fos通路损害幼年大鼠海马神经元中的记忆保持能力，并降低p-CREB和c-fos的表达。结果显示，七氟醚可导致短期记忆障碍，并下调突触可塑性相关标志物的表达，这些效应在3天后可逆，且与给药频率无关。
由于神经发育的动态性、方法学限制以及情境障碍，研究脑发育过程中的认知功能障碍面临诸多挑战。本研究通过幼年大鼠海马神经元中记忆以及p-CREB和c-fos表达的变化，基于NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路，探讨了一种整合性的方法学策略，用于研究七氟烷所致发育中大脑的认知功能障碍。将64只21日龄SD雄性大鼠（体重<80 g）分为五组：正常对照组（n=8）、60% O2组（n=16）、假训练组（n=8）、单次剂量七氟烷组（n=16）和多次剂量七氟烷组（n=16）。两个七氟烷处理组进一步细分为训练后1天处死（sev1a和sev1b组）和训练后30天处死（sev30a和sev30b组），每亚组n=8；其余各组大鼠均在训练后1小时处死。采用Y迷宫实验评估学习与记忆保持能力。通过免疫组织化学方法检测海马组织中p-CREB和c-fos阳性神经元的数量。与60% O2组（记忆保持率为86.33% ± 17.52%）相比，sev1a和sev1b组大鼠的记忆能力显著下降（sev1a：44.29% ± 11.26%；sev1b：62.42% ± 7.27%；所有P<0.05），而sev1b与sev30b组之间无显著差异（sev30a：84.41% ± 14.15%；sev30b：85.21% ± 11.61%；所有P>0.05）。与60% O2组（c-fos：92.83 ± 7.88；p-CREB：72.22 ± 8.89）相比，sev1a组（c-fos：23.13 ± 3.28；p-CREB：22.88 ± 5.18）和sev30组（c-fos：23.22 ± 3.13；p-CREB：25.58 ± 2.26）海马神经元中p-CREB和c-fos的表达均显著降低（所有P<0.05），而sev30a与sev30b组之间无显著差异（所有P>0.05）。七氟烷对幼年大鼠的记忆维持能力具有短期的负面影响，但该影响不随给药频率增加而加重。七氟烷可降低幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos的表达水平。
由于神经发育的动态性、方法学限制以及环境障碍，研究脑发育过程中的认知功能障碍面临重大挑战。脑发育涉及快速且非线性的变化，使得在关键时期识别功能障碍变得复杂1,2。在资源有限的环境中，照护者文化水平低、语言多样性以及缺乏获取专业工具（如磁共振成像，MRI）的途径等障碍，阻碍了早期筛查1。个体间脑成熟度的差异使得区分病理性偏离与正常发育过程变得困难2,3。例如，唐氏综合征表现为皮层发育异常，但样本量小且组织学数据稀缺，限制了对其机制的理解4。神经发育障碍（如自闭症谱系障碍ASD、注意缺陷多动障碍ADHD）常与焦虑或抑郁共病，干扰了认知评估的准确性5。某些人群严重的沟通障碍限制了标准化测试的应用6。这些特征导致了多项研究设计上的问题。事实上，大多数研究采用横断面设计，无法建模个体随时间的变化。研究过度依赖西方化、受过教育的人群（"WEIRD"样本）7。唐氏综合征研究受限于死后脑组织样本量小，且缺乏适当的年龄匹配对照4<....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究中的所有实验方案均经上海交通大学医学院新华医院伦理委员会审核批准（批准号：XHEC-C-2016-023-2）。
1. 动物实验总体设计与分组
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究利用该研究所获得的数据作为示例，展示了此方法框架所能生成的结果类型，包括具有代表性的免疫染色图像以及来自不同组别的行为学和分子数据。重点在于呈现该方法所产生的典型或预期结果，而非对其生物学意义进行解释。
各组大鼠学习和记忆测试结果
与60% O2组相比，单次剂量七氟烷组（sev1a）和多次剂量七氟烷组（sev1b）大鼠在测试后1小时处死的记忆表现显著下降（所有P < 0.05），而测试后3天处死的大鼠则未见显著差异（所有P > 0.05）（表2）。
大鼠海马中 c-fos 和 p-CREB 蛋白的表达
正常组大鼠海马神经元中 c-fos 的水平低于其他各组，假手术训练组大鼠海马神经元中 p-CREB 的水平低于其他各组。与 60% O2 组相比，sev1a 和 sev1b 组（即训练后 1 小时处死）、假手术训练组.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究探讨了七氟烷通过NMDAR/p-CREB/c-fos信号通路对幼年大鼠海马神经元中p-CREB和c-fos表达的调节作用及其对记忆的影响。结果表明，七氟烷对幼年大鼠的记忆维持能力具有短期（训练后1小时，而非3天后）的负面影响，且该效应不受给药频率（单次给药或连续7天每日给药共七次）的影响。七氟烷显著降低了幼年大鼠在训练后1小时海马神经元中p-CREB和c-fos的表达水平。
本研究探讨了七氟烷与学习和记忆保持之间的关系，旨在为研究学习和记忆的整合方法提供概念验证。Ca2+可通过NMDA受体（NMDARs）或电压依赖性钙通道进入细胞，并通过多种信号通路触发一系列即早基因（IEGs）的转录，例如c-fos和p-CREB13。这些基因随后被翻译为相应的蛋白质产物，作为转录因子进一步调控靶基因的转录，从而参与突触可塑性过程。CREB是其活性受磷酸化调控的转录因子之一，定位于细胞核，在所有类型的脑细胞中均有表达。丝氨酸133位点（p-CREB）的磷酸化在启动多种下游基因转录过程中起关键介导作用
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明不存在任何竞争利益。
叶江和李国辉设计了本研究。叶江和江蕾收集并分析了数据，起草了手稿。叶江和李国辉对手稿进行了修改。所有作者均审阅并批准了提交的最终稿。 本工作得到了上海市浦江人才计划（项目编号：23PJD057）对李国辉的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 实验动物 | |||
| Sprague-Dawley (SD) 大鼠 | Charles River Laboratories (中国北京) | N/A | 21日龄，雄性 |
| 标准大鼠饲料 | Keao Xieli Feed (中国北京) | N/A | 标准实验室动物饮食 |
| 化学试剂与试剂 | |||
| 水合氯醛 | Sinopharm Chemical Reagent (中国上海) | 80113818 | 终末灌注用麻醉剂 |
| 柠檬酸盐缓冲液 (10x) | ZSGB-BIO (中国北京) | ZLI-9064 | 抗原修复液，pH 6.0 |
| 乙醇 (100%) | Sinopharm Chemical Reagent (中国上海) | 100092683 | 组织学脱水剂 |
| 苏木精染色液 | Baso Diagnostics Inc. (中国珠海) | BA-4041 | 免疫组化复染剂 |
| 过氧化氢 (H2O2) | Sinopharm Chemical Reagent (中国上海) | 10011218 | 3% 溶液，用于阻断内源性过氧化物酶 |
| 中性树胶 | Solarbio (中国北京) | G8590 | 载玻片封片介质 |
| 氮气 (N2) | Shanghai Medical Gas Co. (中国上海) | N/A | 高纯度，用于混合气体 |
| 氧气 (O2) | Shanghai Medical Gas Co. (中国上海) | N/A | 医用级，用于混合气体 |
| 石蜡 | Leica Biosystems (Nussloch, Germany) | 39601006 | 组织包埋介质 |
| 多聚甲醛 (PFA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 158127 | 组织灌注与固定的固定剂 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco (Waltham, MA, USA) | 70011044 | 10x 储存液，pH 7.4 |
| 七氟烷 | AbbVie Inc. (North Chicago, IL, USA) | N/A | 吸入性麻醉剂 |
| 钠石灰 | W. R. Grace and Co. (Columbia, MD, USA) | 22-01-0010 | 吸入室用 CO2 吸收剂 |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent (中国上海) | 10019818 | 用于调节 PFA 溶液的 pH |
| 蔗糖 | Sangon Biotech (中国上海) | A502693 | 用于脑组织的冷冻保护 |
| 二甲苯 | Sinopharm Chemical Reagent (中国上海) | 10023418 | 组织学透明剂 |
| 抗体与试剂盒 | |||
| c-Fos 抗体 | Abcam (Cambridge, UK) | ab190289 | 兔抗小鼠，一抗 |
| DAB 显色试剂盒 | ZSGB-BIO (中国北京) | ZLI-9018 | HRP 显色底物 |
| p-CREB (Ser133) 抗体 | Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) | 9198 | 兔抗小鼠，一抗 |
| 聚合物 HRP 检测试剂盒 | ZSGB-BIO (中国北京) | PV-9000 | 免疫组化二抗及检测系统 |
| 设备 | |||
| 麻醉机 | RWD Life Science (中国深圳) | R500 | 用于控制混合气体输送 |
| 自动组织处理仪 | Leica Biosystems (Nussloch, Germany) | ASP6025 | 用于自动脱水与透明 |
| 冷冻切片机/切片机 | Leica Biosystems (Nussloch, Germany) | CM1950 | 用于冷冻/包埋脑组织切片 |
| 显微镜系统 | Olympus (Tokyo, Japan) | BX53 | 用于免疫组化切片成像 |
| 灌注泵 | Longer Precision Pump Co. (中国保定) | BT100-2J | 用于心脏灌注的蠕动泵 |
| 七氟烷蒸发器 | RWD Life Science (中国深圳) | R510PS | 用于精确控制七氟烷浓度 |
| Y迷宫装置 | Med Associates Inc. (St. Albans, VT, USA) | MED-VFC-S-Y | 带电栅与灯光，用于主动回避实验 |
| 软件 | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA, USA) | 版本 9 | 统计分析与数据可视化 |
| ImageJ | National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA) | 版本 1.53 | 用于细胞计数的图像分析软件 |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation (Redmond, WA, USA) | Office 365 | 用于数据整理的电子表格软件 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。