扩充显微镜：使用传统显微镜进行高分辨率荧光成像

摘要

本文介绍了结合冷冻固定与膨胀显微镜方法（Cryo-ExM）的详细方案，实现高分辨率成像和结构保存，适应各种生物样本。生物样本被冷冻，嵌入膨胀聚合物中，进行变性、扩孔和免疫标记，使得用标准光学显微镜实现超分辨率成像。

摘要

膨胀显微镜（ExM）是一种创新的超分辨率荧光显微技术，能够物理放大生物标本，使得利用传统系统如共軛焦显微镜实现超越衍射极限的成像。通过将样品嵌入膨胀水凝胶基质中，ExM允许样品实现各向同性扩展，提升空间分辨率，而无需专用纳米镜设备。先进变体，如超微扩张显微镜（U-ExM），保留了精细的细胞细节，包括细胞器和大分子组装体。

特定细胞结构或细胞器的观察高度依赖于样品固定方法，尤其是使用含醛的化学交联剂和冷甲醇的蛋白质沉淀。最近，将低温固定——一种金标准的固定技术——与U-ExM方法结合，使得对从培养哺乳动物细胞到整个生物体的近乎原生状态的生物样本进行了纳米尺度的观测。扩充显微镜是研究生物结构的强大工具，涵盖从孤立的细胞器到整个组织。结合冷冻固定，它提供了前所未有的细胞结构和动态过程洞察，同时最大限度地减少传统固定方法相关的伪影。这些发展使ExM成为一个多功能的高分辨率、近原生生物成像框架。

本研究提出了结合不同来源样品的冷冻固定与膨胀显微镜结合的详细方案。该方案强调了关键步骤，包括样品固定、聚合物形成、膨胀、免疫染色和成像，为在任何实验室中实施该方法提供了必要的指导。

引言

显微镜在生物学研究中发挥着关键作用，使我们能够在前所未有的尺度上可视化生物系统中的超微结构和组织结构，从整个生物体到单个分子。显微镜领域涵盖两种不同系统：电子显微镜（EM），高度分辨但特异性标记能力有限;以及光学显微镜，允许对亚细胞结构进行精确和具体的可视化，但由于光的绕射极限，分辨率有限。尽管超分辨率荧光显微镜（SRM）已成为细胞亚衍射分辨率荧光成像的强大方法，但可视化大分子组装体（如整个生物体）的超微结构细节^{仍然具有挑战}性。此外，SRM技术实现10至120纳米分辨率，依赖先进显微镜和图像重建算法，需要专业知识和专用显微镜，限制了其仅限于许多生物学实验室的普及。一种新兴的超分辨率方法——扩展显微镜（ExM）克服了这些局限性。ExM由爱德华·S·博伊登实验室十年前开发，是一种创新的光子显微技术，现被视为超高分辨率显微镜，无需专用显微镜即可成像².ExM不依赖复杂的成像技术，而是将生物样品嵌入于各向同性膨胀的膨胀聚合物中。这种物理膨胀使样本量增加了四倍或更多，提高了分辨率，使得使用传统光学显微镜进行观测成为可能。ExM协议最初在脑切片中开发，后来不断发展以提升分辨率并简化程序。该技术已被成功应用于多种生物样本，包括真核细胞、单细胞生物、寄生虫、组织和整个生物体，展示了其多功能性 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14^，15。

目前，主要存在两类协议：扩孔前^2,16和扩增后^17,18，分别指生物样品染色的时刻，即扩容程序之前或之后。本文将特别聚焦于扩增后方案，即在样本变性和扩增后进行免疫标记。

在该方案中，生物样本被冷冻或化学固定并与化学剂孵育，从而实现蛋白质与未来聚合物的锚定。然后，样品被嵌入由丙烯酰胺/双丙烯酰胺（常用于电泳凝胶）和丙烯酸钠（可促进膨胀）组成的膨胀聚合物中。加水会触发凝胶膨胀，蛋白质间距离与凝胶的膨胀成正比增加。然后利用特定抗体直接在凝胶内标记感兴趣的蛋白质（见图1）。

上述所有成像技术，包括电子显微镜、光子显微镜、超分辨率显微镜和ExM，都需要生物样品固定。基于醛的固定在蛋白质间形成交联，在光子显微镜或电子显微镜治疗过程中维持细胞组织。然而，固定也可能导致细胞内的伪影和形态变化，这些变化在经典光学显微镜中可能较为细微，但随着SRM的发展和发展，这些变化变得越来越明显，促使科学家重新考虑固定方法的后果¹⁹。绕过固定相关伪影的一种方法是使用活显微镜，这使得细胞结构在近乎原生状态时能够动态可视化。然而，活体显微镜存在若干缺点，尤其是需要转基因表达，这可能影响细胞生理，并改变蛋白质行为，相较于内源显微镜。此外，活体显微镜通常分辨率低于固定显微镜，且标记选项有限，因为荧光标签必须在活体条件下无毒且稳定，限制了可用的标记物。电子显微镜领域因其高分辨率，极大地促进了在保持其原生状态的同时固定亚细胞或大分子结构的最佳方法的发展。几十年前，Dubochet、Frank和Henderson实验室开发了低温固定技术，涉及在玻璃态水中快速固定细胞，并证明这是保存本地^超微结构的唯一^方法。虽然纯化分子可以通过冷冻电子显微镜直接在玻璃冰中观察，但细胞需要嵌入树脂中并切片才能观察。为了进一步稳定样品到最原始的状态，样品会进行冷冻取代。在这个过程中，当冰分子恢复液态时，会立即被丙酮取代，丙酮的扩散系数高于水。在去除水分的过程中，感兴趣的分子可能会聚集并坍缩，类似于化学交联固定。为限制这种聚集，在低温下进行冻结取代，通过增加细胞内粘度来减少聚集。这种受控方法限制了大型集合体的形成，并使细胞超微结构更接近其原生状态。

2022年，随着越来越多的证据表明化学固定会产生伪影，加上膨胀显微镜的进步，Guichard/Hamel实验室开发了一种将冷冻固定与膨胀显微镜结合的方法，称为“Cryo-ExM”²³。该方法利用了两种技术的优势，最大限度地保留了生物结构，几乎没有变形。样品通过高压冷冻或手动钻入冷冻方式进行，这两种方法都需要电子显微镜实验室或岩心设施中常见的专用设备。

本文概述了一项逐步的方案，用于执行冷冻固定，随后进行扩充显微镜，并展示了两种实验模型的代表性结果：人类培养细胞和单细胞寄生虫布 鲁氏锥虫（ 致病原）。我们将强调冷冻固定相较于传统固定方法带来的改进，并重点介绍该技术中最常见的陷阱和固定伪影。

方案

注意：本协议中使用的试剂列于材料表中。该方案经过细微修改，用于观察不同生物样本中的各种细胞过程（包括酵母^24,25，弓形虫²⁶，近亲动物²⁷，绿藻^28,29，微生物真核生物³⁰，以及小鼠²³和人类样本23,31,32,33）).本文未提及为适应这些不同样本而调整方案的修改，因为这些内容可从原始文献中检索。在这里，RPE1细胞和布鲁氏锥虫被用作哺乳动物细胞和寄生虫的代理。该方案强调生物样本的固定和扩容步骤;因此，本文未提供关于样本培养的信息。

1. 存液制备

1. 聚赖氨酸溶液
   1. 将聚-L或聚-D-赖氨酸溴化氢（材料表）重新悬浮于水中，得到1 mg/mL的聚赖氨酸储备溶液。将这种高汤溶液保存在-20°C，并进一步稀释于0.2 mg/mL的水中，用于涂层封面（见表1，材料表）。
2. 锚定解
   1. 在化学罩下通过混合38微升甲醛（36.5%-38%; 材料表）50微升丙烯酰胺（40%，材料 表）加入912微升PBS中，得到1毫升溶液。
3. 无APS（起始剂）的凝胶溶液
   1. 混合溶液中加入500微升38%丙烯酸钠（19%最终溶液）、250微升40%丙烯酰胺（10%最终丙烯酰胺）、50微升2%双丙烯酰胺（0.1%最终）、50微升TEMED（0.5%最终）和100微升10xPBS（1x最终）。容量适宜最多2个凝胶（80-90微升），并在-20°C下保存至少12小时后再使用（长期保存见表1 ）。
      注意：请注意，用于制备凝胶溶液混合物的体积计算得最终体积为1 mL，但实际溶液体积为950微升，因为APS代表总体积的1/20是即时添加的。凝胶溶液¹⁷ 的原始储存时间被延长，因为我们观察到它可以在-20°C下保存长达一个月而不影响凝胶的固态性和膨胀效率。
4. TEMED和APS
   1. APS 10% w/v：将APS粉末稀释于水中，分量后保存于-20°C。
   2. TEMED 10% v/v：将TEMED稀释于水中，分开后保存于-20°C。
5. 丙烯酸钠（SA） 38%
   1. 从纯化SA（AKscient或Sigma）中制备38%水杨酸; 材料表）
      1. 将38克丙烯酸钠悬浮在100毫升水中，持续搅拌（重要）。逐步加入水杨以避免骨料，并在4°C下搅拌过夜以确保完全重新浮出。确保溶液半透明且无色或略带黄色。分额，保存于4°C，保存最长一年。
   2. 从丙烯酸中制备38%水杨酸（Sigma; 材料表）
      1. 在化学罩下用氢氧化钠中和丙烯酸，制备90毫升38%丙烯酸钠。
      2. 搅拌时将29毫升水与25毫升丙烯酸混合。
         注意：从这一步开始，反应必须在冰上进行，且pH和温度保持恒定控制，因为反应是放热的。
      3. 用巴斯德吸液器滴滴10N NaOH。
         注意：确保温度不超过25°C（如果超过，请停止添加NaOH，等待温度冷却）。
      4. 继续中和直到pH值达到7-8，并在冰上搅拌1小时。
         注意：如果pH值突然超过10，加入丙烯酸直到pH降至7-8。
      5. 将溶液存放在密闭容器中过夜。如果溶液沉淀，则以1000×克 离心机离心10分钟。收集上清液，分量后储存在-20°C。
6. 变性解
   1. TrisBase 1 M：将121.14克TrisBase稀释于1升水中，用盐酸调整pH至9，储存在RT中。
   2. 变性缓冲液：将200 mM十二烷基硫酸钠（SDS）、200 mM NaCl、50 mM TrisBase 混合于水中。对于200毫升溶液，搅拌时加入10毫升Tris-BASE 1 M（pH 9）于124.9毫升ddH₂O中，加入57.1毫升SDS（20%/700 mM高汤）和8 mL NaCl（5 M高汤）。存储在RT（表1）。

2. 冷冻固定与扩张手术

1. 样品制备与低温固定
   注意：该方案针对12毫米盖片种植/装填样本进行了优化。请修改解答的音量以获得其他支持。
   1. 样品制备
      1. 在适应生物样本的条件下培养样本，可以直接在12毫米的盖层（哺乳动物附着细胞）上，也可以悬浮（T. brucei）。
      2. 将样本放入预涂聚赖氨酸的盖片（T. brucei）上：短暂，将12毫米盖玻片在聚赖氨酸（0.2 mg/mL）中在37°C下孵育1小时，迅速清洗并自然风干。
      3. 在室温下离心300 克 离心10分钟。在PBS中再悬浮，补充10%培养基，并在冷冻固定前5-10分钟装载盖片。
   2. 插槽装置（图2A-C）
      注意：作丙酮时，请戴手套和穿实验服，在化学面罩下工作。作液氮和液态乙烷时请穿白大褂和护目镜。
      1. 在化学罩下，用注射器和针头将1毫升超干丙酮注入5毫升管子（1个盖套/管子），以避免空气污染。
         注意：为了更好地保存生物膜，需要添加对甲醛（PFA）/戊二醛（GA）（0.1/0.02%）。根据盖套管直径调整管子（12毫米>盖套管无法装入5毫升管子）。
      2. 用耐寒的塑料或金属架将管子冻结在液氮中，保持它们直立。
      3. 用干冰填满半个聚苯乙烯箱（30厘米 x 30厘米/厚墙）。
      4. 将Vitrobot型杜瓦装满液氮，直到停止蒸发，等待10-15分钟以稳定温度。蜘蛛的使用有助于系统冷却（图2B，星号）。必要时再续杯。
      5. 取出蜘蛛，注入液态乙烷。
      6. 等10分钟让乙烷达到平衡。
         注意：如有需要，实验期间请用液态乙烷补充吸管系统（此时不要再使用Spider）。从气态到液态乙烷的转变非常困难。使用适当的压力对于液态乙烷的形成至关重要。高压时金属腔室内气体持续溢流防止液体形成，低压则在金属腔室和填充管内形成固态乙烷。避免结冰对实验至关重要。保持填充尖端位于液气界面，有助于防止固体乙烷形成。
   3. 下沉（图2A-C）
      注意：作液氮和液态乙烷时请佩戴实验服和护目镜。
      1. 拿个12毫米的盖套，用细镊子。
      2. 用薄纸吸收多余的介质。
      3. 用镊子夹住盖套一半，夹紧环适合低温活塞。
      4. 将夹住盖套的镊子插入低温活塞的支架中。用Whatman纸吸走剩余的介质。
      5. 启动低温活塞，将盖片插入金属腔室的乙烷溶液中。
      6. 迅速将盖玻片转移到装有冷冻丙酮的管子里（1个盖套/管）。
         注意：采集样本和插入时不要使用同一支镊子，以避免与培养基污染。如果使用12毫米>盖套（15或18毫米直径的盖套套，适合携带器，但可能更难插入）请格外小心。在此过程中，可以在浸泡后将盖玻片浸入液氮中，以便转移至埃彭多夫，同时保持样品冷冻状态。由于丙酮在-96°C下结冰，必须将盖片覆盖在冷冻丙酮上以实现冷冻替代。
   4. 冷冻替代与再水化
      注意：在冷冻替换过程中作样品时，请在底层作。温度上升会在管内产生压力，可能导致管内爆炸。
      1. 将试管放入干燥冰中，保持倾斜角度（约45°）。
      2. 在轨道震动器上搅拌过夜。将密封箱放在摇杯上，温度在4°C或RT下，温度从-180°C升至-80°C。
      3. 将大部分干冰从箱子中取出（只留少量在盒底），通过快速开关管道释放压力，并在轨道摇动器上搅拌45分钟，使温度从-80°C升至-20°C继续上升。
      4. 将盖片转移到12孔板（或任何方便的容器）上，板内含有预冷的纯乙醇（100%）溶液。培养5分钟，逐步补充水分，步骤如下：EtOH 100%（5分钟）- EtOH 95%（3分钟）- EtOH 95%（3分钟）- EtOH 70%（3分钟）- EtOH 50%（3分钟）- EtOH 25%（3分钟）- H₂₀₀% 100%。
      5. 将封片转印在PBS中，并在显微镜下对准（用尖端刮擦表面），使其全部朝上。
         注意：EtOH 100%和95%在-20°C下储存，EtOH 70%和EtOH 50%在4°C，EtOH 25%和ddH_2O在RT中储存，以持续升温直到RT。对于膜标记，丙酮和再水溶液中需要添加PFA/GA（0.1%/0.02%），除ddH_2O外。
2. 扩展
   1. 蛋白质锚定
      1. 在PBS中制备新鲜1.4%甲醛/2%丙烯酰胺（FA/AA）溶液。
      2. 将盖片放入4/12英寸的孔板中，槽内填充0.5/1毫升AA/FA。
      3. 在37°C下潜伏3-5小时，勿搅拌。
         注意：甲醛将游离胺基团的蛋白质与丙烯酰胺连接起来。过量的丙烯酰胺有助于限制甲醛通常诱导的蛋白质交联，并将蛋白质锚定在未来的扩长聚合物上。根据生物样本的不同，可能需要蛋白质锚定步骤延长至一夜。无论如何，更长时间的孵化不会影响后续步骤。在自由井中注水或置于潮湿的室内以避免蒸发。
   2. 胶化
      1. 冰上解冻、APS（10%）和凝胶溶液（丙烯酸钠19%，丙烯酰胺10%，双丙烯酰胺0.1%，TEMED 0.5%，稀释于10xPBS）后10分钟。
      2. 准备一个湿润的腔室，薄薄一层湿纸和防腐剂，然后在4°C下储存10分钟。
      3. 将潮湿的腔室冰敷。
      4. 把蛋白固定液中的封套取出，用纸巾（两张）取出多余的溶液。
      5. 将APS（最终浓度0.5%）加入凝胶溶液中，形成漩涡2-3秒，并在湿气室的对压膜上滴2滴35微升。
      6. 用盖片覆盖每一滴，盖膜是面向凝胶溶液的细胞。
      7. 在冰上孵育5分钟，让凝胶渗透。
      8. 在37°C下孵育30-60分钟。
   3. 变性
      1. 用直径0.4厘米的活检冲孔工具冲刺凝胶，并在6孔板上搅拌10至15分钟，该平板内填充1毫升变性缓冲液，直到凝胶从盖片上脱落。
      2. 将凝胶转移到充满新鲜变性缓冲液的1.5毫升微离心管中。
      3. 在95°C下孵育1小时30分。
      4. 将凝胶转移到ddH_2O中10分钟，重复3次以正确清洗变性缓冲液。
      5. 用毫米纸或卡尺测量凝胶以评估凝胶膨胀因子。
      6. 将凝胶转移到PBS进行免疫染色。
      7. 或者，将凝胶以PBS-叠氮化物0.02%在4°C下短时间储存（见表1），或在-20°C储存较长时间（见表1）。长时间储存时，凝胶需在多个水浴中孵育：甘油50%溶液搅拌2-3小时，置于-20°C的足够溶液中，溶液体积需根据凝胶大小调整。
         注意：如愿，凝胶可保持完整（图2D，E）（步骤2.2.3.1）。最多可收集5个穿孔点（相当于一整颗凝胶）于一管中（步骤2.2.3.2）。必须遵守变性温度和时间（步骤2.2.3.3）。高温可能导致管子打开，导致变性缓冲液蒸发和/或凝胶排出。一定要使用安全锁管或用盖子。变性后必须在蒸馏水中清洗胶体，因为PBS会引发SDS沉淀，影响洗涤效率。这一步会触发凝胶的轻微扩张，但对后续步骤（步骤2.2.3.4）没有影响。甘油可以稀释在PBS中，以节省体积，以防大凝胶。对于0.4毫米冲孔器，凝胶理想情况下储存在一个12孔板中，板内装有3毫升水：甘油。

3. 免疫染色与最终扩增

1. 更换PBS浴槽，再进行15分钟的孵化。
2. 把整块凝胶切成4等份。
3. 将凝胶片段/穿孔器转移到适配载体（图2D、E），并与稀释于PBS-BSA 2%中的原级抗体一起培养3小时至过夜并搅拌（详见 表2和 表3 ）。
4. 用PBS+Tween 0.1%的水洗凝胶3次，RT10分钟并搅拌。
5. 将凝胶培养成二级抗体，Hoechst浸泡于PBS-BSA 2%中，培养3小时至过夜并搅拌（详见 表2 和 表3 ）。
6. 用PBS+Tween 0.1%的水洗3次，RT10分钟并搅拌。
7. 可选：通过在PBS中培养含有NHS酯（详见 表2 ）的凝胶，在RT搅拌下孵育1小时30分钟，然后在PBS+Tween 0.1%中洗涤3次，浸泡10分钟，对整个蛋白质组进行全盘标记。
8. 将凝胶转移到适配载体中，并通过蒸馏水（ddH₂O）培养凝胶展开。
   注意：抗体清洗液所用洗涤剂的浓度和类型（Tween、Triton-X100、皂苷）可以适配生物样本。多次更换水对于消除盐分的痕迹至关重要，因为盐分会阻碍完全膨胀。

4. 安装与成像

1. 用聚赖氨酸涂覆（见第1.1节），方法是用约200微升聚赖氨酸覆盖盖层，在RT下孵育1小时，并在ddH_2O中洗涤3次以去除多余聚赖氨酸。让封面片晾干，保存在4°C直到使用。
2. 将膨胀凝胶放置在成像腔内未涂层的盖片上，用荧光显微镜检查样品的取向。
3. 定向后，在无绒纸上干燥胶片去除多余水分，并安装在聚赖氨酸涂层的盖片上（详见步骤1.1）。
4. 用倒置显微镜观察样本。

结果

本文重点介绍了结合冷冻固定与扩充显微镜对两种不同样本的成果：培养的哺乳动物细胞和 布鲁氏寄 生虫。两样样品均在4%PFA中冷冻固定或化学固定，随后展开并进行免疫染色。请注意，其他化学固定可能更适合特定细胞器（如甲醇或戊二醛），仅选用PFA作为一种常见的化学固定方式，以便与低温固定进行比较。

对人类RPE1（视网膜色素上皮细胞）进行了αβ-微管蛋白、ATP5a和Hoechst染色，分别用于观察微管、线粒体和细胞核。此外，凝胶在扩孔前与荧光NHS酯一起孵育，该染料与游离胺基反应，从而染色整个细胞蛋白质组。我们可以观察到冷冻固定相较于化学固定的多个优势，正如已经证明^的那样。最显著的特点是冷冻固定完美保存了线粒体网络，这两者通过NHS酯和针对ATP合成酶亚基α（ATP5a）的特异性抗体可见（见图3A，B）。此外，由于ATP5a定位于线粒体内膜，我们可以通过冷冻固定技术解析线粒体晶（见图3B）。相反，PFA固定无法保留线粒体网络，因此在此条件下线粒体嵴不可见（见图3C）。我们还在这两种条件下对微管进行了染色，并证明了冷冻固定能更好地保存如细胞质或星体微管等动态微管（见图3B-E）。然而，如中心粒和纤毛中的稳定微管，这些非膜细胞器由9折微管三重组/双联体组成，在PFA固定细胞中保存得相当，甚至更好（见图3B'，C'）。需要注意的是，作为保持细胞蛋白完整性的冷冻固定，可能不太适用于如中心粒/纤毛等非常致密的结构。这一观察也适用于刚性结构，如核孔，化学固定会触发细胞质蛋白的冲刷，从而更好地观察核孔结构^23,32。最后，我们可以证明冷冻固定还能规避化学固定的交联效应，而化学固定作用会对膨胀能力产生负面影响，如有丝分裂纺锤体所示，冷冻固定状态下的膨胀几乎是PFA的两倍（见图3D，E）。

对布鲁氏锥虫细胞进行了染色，用于TDH³⁴（图4A-D），以观察独特的线粒体，并为BiP³⁵（图4E，F）染色以突出内质网。此外，凝胶还用荧光NHS酯染色。在人体细胞中观察到，冷冻固定结合扩增能更好地保存整体细胞结构（见图4B，E），尤其是这两种膜结构，相较于PFA固定（见图4C，D，F）。布鲁氏锥虫的微管细胞骨架比人类细胞更为刚性和稳定性;因此，PFA与冷冻固定之间未观察到显著差异。此外，U-ExM技术的分辨率极限使我们无法区分单个微管（未显示）。

总体而言，冷冻固定解决了经典化学固定的局限性，如膜细胞器（线粒体、内质网）和动态细胞骨架元素（胞质或星体微管）的保存。此外，由于低温固定不在蛋白质之间产生任何交联，它完全保留了膨胀能力，尤其是在刚性和致密结构上。

控制冷冻固定和膨胀的质量对于保护生物样本的细胞超微结构至关重要。若干错误可能导致定点不良，并在生物样本中产生伪影。这里，我们将重点介绍冷冻固定中最常见的缺点及固定不良后果。冷冻固定最明显的伪影是生物样品内部出现裂纹（图5A），这在冷冻电子显微镜中也很常见。虽然这些裂纹不会改变细胞器的固有超结构，如 图5A （插入）所示，针对线粒体和微管，但可能导致对裂纹生物学意义的误解，需谨慎考虑。作问题与裂纹的出现或数量之间没有具体关联。

一个表明固定不良的具体特征是细胞质中出现“气泡状结构”，表明存在冰晶。这些结构在NHS酯染色中尤为明显（见图5B）。它们通常伴随着细胞骨架元素的有限保存，如波浪形微管（图5B），以及膜细胞器（ 图5B中的线粒体）保存极差。这些特征显示了固定的重要问题，可能由（i）乙烷体积和/或温度不当引起（步骤2.2.4-2.2.6）、（ii）生物样本非渐进加热（步骤2.3和2.4）以及（iii）冷冻替代溶液中存在杂质（步骤2.2.1）。 图5C展示了代表性38%丙烯酸钠溶液的预期特征（无色且半透明[1]）或略黄且半透明[2]），或不可用于膨胀（黄色/橙色且浑浊[3]）的预期特征。

图1 冷冻ExM工作流程。 （A）活细胞（人类细胞或 布鲁氏锥）通过浸泡在-180°C的液态乙烷中冷冻固定，并在冷冻丙酮中置于干冰上孵育。冷冻取代通过在干冰上培养，从-180°C持续缓慢升温到-80°C，触发丙酮液化（-96°C），然后在-80°C到-20°C之间进行无干冰孵育。通过连续浸泡乙醇与新月形浓度的蒸馏水，同时将温度从-20°C持续升高至室温来实现。（B） 再水化样品进行扩孔过程如下：样品在丙烯酰胺-甲醛（AA/FA）混合物中以37°C孵育，使蛋白质能够锚定在由丙烯酰胺、双丙烯酰胺和丙烯酸钠（AA/BIS/SA）组成的膨胀聚合物上，后者赋予凝胶膨胀特性。样品在95°C的NaCl/SDS中孵育，进行蛋白质间相互作用的不稳定和温和变性。这一步对于各向同性展开至关重要。随后用常规的一级和二级抗体对样本进行免疫染色，最后在蒸馏水中扩增。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2。冷冻潜入和扩张的设置。 （A）冷冻活塞进入启动位置（上面板）和向下位置（下面板）。箭头表示按下按钮以激活跳入。（B）冷冻潜入装置，准备下沉，显示适合低温固定的液氮水平（N₂），由包围杜瓦的泡沫高度指示（红色箭头）。可移除的蜘蛛用星号表示。（C）从持盖玻片（左上）、盖玻片在液态乙烷杜瓦中的位置（左下）以及冷冻替代收集管（右）的冷冻浸泡关键步骤示意。（D）人体样本免疫染色的“凝胶冲孔”方法示意。在盖片上（1）上用特定活检冲头（P）切割聚合凝胶冲头，形成直径0.4厘米的凝胶冲孔（2），可在右侧面板硅胶板中染色以减少抗体含量。（E）人体和 布鲁氏锥虫 样本中“凝胶切割”免疫染色方法的示意图。聚合和变性凝胶（1）被切割成4等份（2），使其可在12孔板中与抗体一起培养。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。人体细胞中冷冻固定与PFA固定的比较。（A）冷冻固定和扩展的RPE1细胞旋转盘图像，染色为αβ-微管蛋白（青）、线粒体ATP合成酶5a亚基（ATP5a，黄色）和NHS酯（红/灰），显示膜基细胞器和细胞骨架元件（包括中心粒和纤毛）的良好保存。比例条：10微米（B，C）旋转盘图像，描绘冷冻固定（B）和PFA固定（C）RPE1细胞，染色含αβ-管蛋白（青）、线粒体ATP5a（黄色）和Hoechst（品红色），强调初级纤毛（箭头，B'，C'）和线粒体（B“，C”）。如果冷冻固定和PFA固定在中心粒和初级纤毛上均等保存，那么冷冻固定在线粒体结构保存方面远远超过PFA（B“、C”——红色箭头表示线粒体嵴，仅在冷冻固定条件下可见）。比例条分别为1、1和2.5微米。（D，E）冷冻固定（D）和PFA固定（E）有丝分裂RPE1细胞的旋转盘图，染色为αβ-微管蛋白黄/灰色）、线粒体ATP5a（品红）和Hoechst（BOP蓝色），显示冷冻固定能更好地扩展有丝分裂纺锤体（红色箭头），并更好地保存有丝分裂纺锤体微管（红色箭头）。有丝分裂纺锤体长度的测量值：冷冻固定分别为12微米和PFA固定为7微米。比例杆：10微米。请点击此处查看该图的放大版本。

图4。布鲁氏锥虫冷冻固定与PFA固定的比较。（A，B） 冷冻固定和扩展的布鲁氏锥体前环细胞的共焦点图像，染色为线粒体苏氨酸脱氢酶（TDH，黄色）和NHS酯（红/灰色），显示了独特线粒体的良好保存及细胞整体结构。比例条：5微米（C，D）为PFA固定和扩展的布氏锥虫前环细胞的共焦点图像，染色为TDH（黄色）和NHS酯（红/灰色）。比较线粒体结构的保存和网络，冷冻固定优于PFA固定。比例条：5微米（E，F）冷冻固定（E）和PFA固定（F）及扩展的布氏锥虫前环细胞的对焦图像，染色内质网标记BiP和NHS-酯（灰色），显示冷冻固定有助于内质网的更好扩展和保护。比例杆：5微米。请点击此处查看该图的放大版本。

图5。冷冻凝视问题。（A，B）冷冻固定和扩展后的RPE1旋转盘图像，染色为αβ-微管蛋白（青色）、线粒体ATP合成酶亚基5a（ATP5a，黄色）和NHS酯（红色），显示了冷冻固定的经典效应：裂纹（A，箭头）和气泡（B，箭头）。虽然裂纹不会影响细胞器的超微结构（A），但细胞质（B）中存在气泡表明固定不良，显著改变亚细胞器（线粒体和微管、嵌套）的保存。比例杆：5微米和2微米（内套）。（C）展示不同丙烯酸钠溶液的图片，突出预期38%丙烯酸钠的可用特性（无色且半透明（1）或略微发黄且半透明（2），或不可用于膨胀（黄色/橙色且浑浊（3））。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：溶液储存条件 请点击此处下载此表。

表2：抗体列表 请点击此处下载此表。

表3：免疫染色状况 请点击此处下载此表。

讨论

本文提出了一个详细的方案，将冷冻固定与扩容显微镜（Cryo-ExM）结合，提供了一种稳健的方法，用于可视化亚细胞区室，同时避免常见于化学固定的伪影，如结构变形和抗原流失。通过保持细胞结构近乎原生状态，Cryo-ExM消除了大量固定优化的需求，从而实现更准确的蛋白质定位。

虽然该方案通常简单明了，但若干关键步骤需要特别注意以确保成功效果。低温浸入步骤尤其敏感，因为它既需要特定材料（见 材料表），又需要一定的灵巧度，尤其是在处理液态乙烷填充时，这可能是一个潜在的陷阱。先验冷冻固定技术的知识是有利的;我们建议在首次采用此方法时咨询冷冻电子显微专家或电子显微镜设施经理。在膨胀阶段，必须严格遵守变性条件，因为偏差会影响样品保存和膨胀效率。最后，保持所有试剂的适当储存条件（见 表1）对于确保可重复性和长期成像质量一致至关重要。

本文强调了Cryo-ExM协议的几个关键优势。值得注意的是，冷冻固定最大限度地减少了可溶性蛋白质的流失，这是传统固定方法常见的限制，同时更好地保持膜完整性，从而提升了细胞成像的真实性。该技术的一个主要优势在于其与标准广角和共聚焦显微镜的兼容性。与许多需要专业且通常昂贵设备的超高分辨率方法不同，ExM可以用传统荧光显微镜实现。ExM的另一个显著优势是其多功能性。该技术已成功应用于多种生物样本——从单个细胞到复杂组织——展示了其在不同研究领域的广泛应用。本文特别强调该方案与两种截然不同的模型系统：布鲁氏锥虫和人类细胞的兼容性，但请注意，更大或更复杂的样本需要高压冷冻固定，因为手动钻入不足以保存整个样本 24,25,30.扩充显微镜彻底改变了此前难以或无法分辨的纳米级细胞结构可视化能力，推动了细胞生物学、发育生物学和神经科学等领域的^突破。特别是，该方法在寄生虫学领域具有变革性，而传统光学显微镜常常不足。对于许多寄生虫来说，超微结构扩展显微镜（U-ExM）已被证明是游戏规则的改变者，使得对复杂细胞器如顶端体、锥形和细胞骨架元素进行前所未有的清晰度成像，清晰度达到^6,37,38。这些进展展示了U-ExM揭示此前难以接近的结构细节的能力，开启了细胞生物学、神经科学和寄生虫生物学的新发现途径，并助力寻找潜在治疗靶点。此外，ExM与常用的免疫荧光抗体保持兼容性，便于将其整合进现有工作流程。在大多数情况下，用于荧光显微镜或西方印迹的抗体对扩充样品表现出有效作用，无需专用试剂。这种可及性使Cryo-ExM成为许多生物研究实验室的理想选择，提供高分辨率成像，且通常伴随着先进成像系统通常带来的成本和复杂性。

尽管有其优势，ExM仍存在一定局限性。一个主要缺点是抗体消耗量大，这可能成本高昂或带来问题，尤其是对于少量自制抗体来说。以下是我们提出这一方案策略以减少用于免疫染色的抗体体积的原因（见图2D，E）。膨胀过程还会增加样品厚度，这可能影响由于标准显微镜物镜工作距离限制，观察更深层结构的能力。这一限制在研究更大、较厚的样品时尤其具有挑战性，因为传统显微镜可能无法有效成像更深的区域。此外，组织膨胀有时会引入机械变形，需要仔细验证和修正步骤以确保空间表现的准确性。最后，经典ExM严格依赖于样本固定，这种固定可能因生物样本或观察的亚细胞结构而异。虽然中心粒和纤毛足够稳定，可以在不进行预固定的情况下扩展，但细胞器需要不同类型的化学固定（PFA、甲醇、戊二醛），这可能导致伪影，并阻碍多个细胞结构的同时观察。最后，由于ExM兼容多种超分辨率成像技术，如结构化照明显微镜（SIM）³⁹、受激发射耗尽显微镜（STED）⁴⁰、直接随机光学重建显微镜（dSTORM）⁴¹以及最近的光片显微镜⁴²，本研究所述的方法为高精度研究细胞结构提供了多功能工具。一项最新研究将冷冻固定与迭代扩展显微镜结合^{，进一步突破}分辨率极限，同时尽可能保持细胞的自然状态，这得益于冷冻固定。

通过使这些先进成像技术能够捕捉细胞的原生状态，Cryo-ExM为未来研究复杂细胞过程的前所未有清晰度铺平了道路。该方法还为相关光与电子显微镜（CLEM）开辟了新可能性，进一步提升其在多模态成像方面的潜力。

总之，ExM代表了一种强大的超分辨率成像工具，适用于各种生物样本。其与标准显微镜的兼容性、样品类型多样性以及相对简单的实现方式，使其成为许多实验室的理想选择。随着技术的持续进步，我们预计分辨率、抗体使用和样本处理将进一步提升，提升其能力，使其在广泛的生物学应用中更加易用。尤其是Cryo-ExM，是一项有前景的进步，它提供了一种能够以极其细致的细节研究细胞结构的方法，同时保持其原生完整性，最终推动了现代显微镜的边界。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5ML金属管架	多米尼克·杜彻	QB-E5	冻结替换步骤
620 手动低温活塞	罗斯特	https://rhost-em.com/	冷冻固定步骤
丙酮 99.8% AcroSeal	阿克罗斯有机	猫。编号67-64-1	冻结替换步骤
丙烯酰胺40%（AA）	西格玛-奥尔德里奇	A4058	扩展过程 （锚定声）
丙烯酸	西格玛-奥尔德里奇	8.00181	膨胀过程（聚合物）
过硫酸铵（APS）	赛莫飞舍尔	17874	膨胀过程（聚合物）
活检冲孔	多米尼克·杜彻	PUK-40	变性前切割凝胶时需要的;
BSA	西格玛-奥尔德里奇	P1379	免疫染色
细胞室Attofluor	Invitrogen	A7816	适应24毫米盖片用于成像的成像室
细胞腔室	生活形象服役	10900	适应18毫米盖片的成像舱
表皮12毫米及100毫米;	多米尼克·杜彻	100040	生长细胞/附着布鲁氏锥虫
表皮24毫米及小径;	多米尼克·杜彻	900547	影像学及nbsp;
18毫米的盖板	VWR	631-0153	影像学及nbsp;
乙烷汞;	林德·加兹	88888DE	用于冷冻固定
甲醛36.5–38%（自由）	西格玛-奥尔德里奇	F8775	扩展过程 （锚定声）
谷胱甘肽 25%（佐治亚）	西格玛-奥尔德里奇	G5882	冻结替换步骤
甘油	欧罗美德通	EU3550	长期凝胶储存
液氮	林德·加兹	2200975	用于低温固定（冷却系统）所需
微管清锁5毫升	多米尼克·杜彻	390932A	冻结替代所需的
针 18G	多米尼克·杜彻	050123B	需要收集乙酮
N，N-甲基二丙烯酰胺 2%（BIS）	西格玛-奥尔德里奇	M1533，SIGMA	膨胀过程（聚合物）
对甲醛16%（PFA）	急救医疗服务	猫。编号15710	冻结替换步骤
聚-D-赖氨酸	西格玛-奥尔德里奇	P1024	样品/成像用涂层盖片及nbsp;
聚-L-赖氨酸	西格玛-奥尔德里奇	P1274	样品/成像用涂层盖片及nbsp;
加压重整器	林德·加兹	CPLH0SJ-林224	压力重导器允许乙烷干扰（低温固定）
Seringe Terumo 10 ml	多米尼克·杜彻	50132	需要收集乙酮
硅胶弹性体套件	道琼斯	4001834	用于制备硅离子阱板（免疫染色）的套件及nbsp;
丙烯酸钠 97-99%（水杨酸盐）	西格玛-奥尔德里奇	408220	膨胀过程（聚合物）
AK科学	R624	膨胀过程（聚合物）
十二烷基硫酸钠	欧罗美德快报	EU0660	膨胀过程（变性）
四甲基乙胺（TEMED）	赛莫飞舍尔	17919	膨胀过程（聚合物）
管材	热力科学	8060-0060	用于乙烷干扰（低温固定）的管路
Tween-20	欧罗美德快报	1005-7	免疫染色
镊子Dumont n°5	精细科学工具	11255-20	翻页作及nbsp;