一种用于心肌损伤精确可靠分析的显微级氯化三苯基四氮唑检测法

摘要

本实验采用的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）检测法引入了一种优化的TTC染色方案，可在显微分辨率下分析心肌损伤，生成高质量图像，从而在细胞水平上对梗死面积和心肌细胞活力进行准确可靠的评估。

摘要

在本实验方案中，我们介绍了一种基于2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）的优化方法，可用于在细胞分辨率水平上对心肌梗死（MI）进行准确且可靠的分析。该方案包括在心肌梗死发生24小时后对梗死心脏进行两步TTC染色：第一步为灌注，即通过主动脉插管将1% TTC溶液逆行灌注至冠状血管系统；第二步为浸染，即将心脏随后在4 °C条件下于TTC溶液中过夜孵育。染色完成后，将心脏包埋于OCT包埋剂中，并以100 µm为间隔进行横向冷冻切片，切片厚度为50 µm。经过Zamboni固定液固定24小时后，在显微镜下可清晰分辨存活心肌组织（深红色）与坏死组织（黄色）之间的锐利边界。值得注意的是，该显微TTC检测法不仅可在急性期（心肌梗死后24小时）检测心肌梗死，还可适用于超过7天的更长时间窗口。由于显微TTC检测可产生多层图像（每颗心脏约80张切片），我们开发了一种稳健的、基于颜色的半自动化算法，能够快速高效地分析大规模图像数据集，并在数分钟内量化整体梗死面积。通过上述改进，本方法显著优化了TTC染色流程，为研究心肌缺血性损伤的实验室提供了一种广泛适用且极具价值的工具。

引言

在过去二十年中，心肌保护一直被视为在心脏遭受严重缺血性损伤后保护心肌细胞的关键策略¹。无论是在实验研究还是临床实践中，心肌损伤的最终范围都是评估心肌保护干预措施有效性的关键指标²。因此，对梗死面积进行可靠且准确的评估具有重要价值且十分必要。

在啮齿类动物模型中，评估死后梗死面积的标准方案主要依赖于线粒体脱氢酶的活性，该酶可将无色化合物2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）在存活细胞中酶促转化为红色沉淀物，而在坏死组织中则保持浅灰色³。尽管基于TTC的染色方法简单且成本较低，但仍存在若干方法学上的挑战和内在局限性。这些问题包括心脏切片在TTC溶液中发生收缩，严重扭曲组织结构，导致切片无法平整展开以进行平面测量；样本处理过程中切片厚度不均；以及图像质量较差，难以准确界定梗死边界。近年来，样本制备过程已引入多种技术改进措施，例如使用丙烯酸心脏模具⁴或对心脏进行半冷冻处理以利于切片³。尽管这些改进显著提高了组织切片的可操作性，传统方法仍依赖于对较厚心脏切片进行宏观成像，常导致图像质量参差不齐且不理想⁵，颜色对比度不足可能使梗死面积测量引入较大主观性⁶。此....

方案

所有实验均经德国北莱茵-威斯特法伦州LANUV批准，并依照ARRIVE指南和《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行。所有必需的仪器和化学品均列于材料表中。

1. 建立Langendorff逆向灌流系统

注意：该系统由一个双联三通旋塞阀组成，该旋塞阀连接至一根主动脉插管，插管由20号钝化针头制成，并带有两个灌注端口，一个用于灌洗液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）端口），另一个用于TTC灌注（TTC端口）。通过切换三通旋塞阀的方向，可交替向心脏输送灌注液。

1. 使用一小段胶带将装置水平固定在150毫米的培养皿上，以防止后续步骤中发生不必要的移动。
2. 调节套管尖端，使其位于底部上方1毫米处，并与心脏平放时的主动脉根部水平对齐。
3. 通过PBS加样口，使用10 mL注射器将系统预先充满冰冷的PBS。
4. 配制新鲜染色液（1% TTC溶于PBS中）；每个心脏至少需要6 mL染色液。
   注意：TTC通常被认为具有危害性，需谨慎操作，因其可能引起轻度皮肤刺激、严重眼刺激，吸入后有害。废弃物和残留物应按照当地主管部门的要求进行处置。
5. 使用3 mL注射器将染色液预先注入TTC加样口。
6. 确保系统内无意外气泡，因为气泡可能导致空气栓塞，干扰后续染色。大多数情况下，气泡....

结果

进行显微TTC染色的关键步骤如图1所示。经过两轮TTC染色后，心脏表面呈现出明显的穿孔状图案。以100-µm间隔对整个心脏进行连续切片，共获得约80个组织切片，结扎部位位于第60^个切片附近。在每个切片中，存活心肌细胞（viaCM）呈现深红色染色，而由苦味酸标记的黄色坏死组织（necCM）与之形成清晰对比，边界分明（图2A）。对所有切片进行三维重建，进一步可视化了viaCM和necCM在心脏内的空间分布及体积（图2B）。与传统染色方法相比，显微染色方案提供了更清晰、更锐利的边界以及更高的存活组织与梗死组织信号比（图2C）。在样本处理过程中，用OCT填充心室腔可防止心脏收缩变形，使心脏保持生理形态，且未影响梗死面积的定量分析或引起结构损伤，完整的心内膜层即为佐证（图2D

讨论

心肌梗死（MI）由持续的心肌缺血引起，仍是全球主要的健康问题，因为缺血性损伤常会损害心脏有效血液循环所必需的收缩功能。在过去的几十年中，人们已投入大量努力，致力于寻找能够增强心脏对缺血应激耐受性的干预措施或化合物¹。尽管已探索了多种替代性替代终点指标，例如酶释放¹¹、缺血后功能恢复情况，或培养细胞中的细胞存活性指标¹²¹³，但只有对组织坏死程度的直接定量才能明确证实抗梗死干预措施的有效性⁶。因此，一种能够在完整心脏中可靠且早期检测心肌细胞存活性及心肌梗死的方法，对于推动该领域的研究至关重要¹⁴。

在此背景下，四氮唑染色已成为检测心肌梗死（MI）最常用的方法。该技术基于活组织中存在的脱氢酶及辅因子所催化的酶促反应，可将无色的四氮唑盐（TTC）还原为深红色的甲臜色素^1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.25倍物镜	Olympus	PlanApo 1.25X/0.04	成像
10 mL 注射器	B.Braun	4617100V	逆行灌注
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Milipore	1.08380.0100	化学品
20 G 套管针	BD	305895	逆行灌注
3  mL 注射器	B.Braun	4617022V	逆行灌注
三通阀	B.Braun	16494C	逆行灌注
Aquamount	BDH	362262H	冷冻切片
天平	Ohaus	N/A	称量化学品
双目解剖显微镜	Leica	MZ6	插管
C57BL/6J	Janvier	N/A	实验动物
相机	Olympus	UC30	成像
盖玻片	Epredia	BB02400500A113MN20	冷冻切片
冷冻切片机	Leica	M850	冷冻切片
双蒸水	Milipore	N/A	溶解化学品
精细解剖剪	AESCULAP	BC702R	手术器械
精细显微解剖镊	AESCULAP	FM001R	手术器械
玻璃载玻片	Engelbrecht	11102	冷冻切片
ImageJ	NIH	1.54g	图像处理
异氟烷	Piramal	14150097146754	化学品
异丙醇	Roth	0733.1	化学品
光学显微镜	Olympus	BX61	成像
显微解剖镊	F.S.T	11152-10	手术器械
OCT 包埋剂	Sakura	4583	化学品
培养皿	Thermo Scientific	172931	逆行灌注
磷酸盐缓冲液	Roth	9143.1	化学品
Rstudio	Posit Software	2024.09.0	图像处理
丝线缝合线	F.S.T	18020-60	逆行灌注
软件	Olympus	CellSens V3.2	成像
不锈钢解剖剪	AESCULAP	BC257R	手术器械
Zamboni 固定液	Morphisto	12773.0050	化学品