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方法文章

一种用于心肌损伤精确可靠分析的显微级氯化三苯基四氮唑检测法

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DOI：

10.3791/68596

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2025年11月28日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 3Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 4Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 5Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验采用的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）检测法引入了一种优化的TTC染色方案，可在显微分辨率下分析心肌损伤，生成高质量图像，从而在细胞水平上对梗死面积和心肌细胞活力进行准确可靠的评估。

摘要

在本实验方案中，我们介绍了一种基于2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）的优化方法，可用于在细胞分辨率水平上对心肌梗死（MI）进行准确且可靠的分析。该方案包括在心肌梗死发生24小时后对梗死心脏进行两步TTC染色：第一步为灌注，即通过主动脉插管将1% TTC溶液逆行灌注至冠状血管系统；第二步为浸染，即将心脏随后在4 °C条件下于TTC溶液中过夜孵育。染色完成后，将心脏包埋于OCT包埋剂中，并以100 µm为间隔进行横向冷冻切片，切片厚度为50 µm。经过Zamboni固定液固定24小时后，在显微镜下可清晰分辨存活心肌组织（深红色）与坏死组织（黄色）之间的锐利边界。值得注意的是，该显微TTC检测法不仅可在急性期（心肌梗死后24小时）检测心肌梗死，还可适用于超过7天的更长时间窗口。由于显微TTC检测可产生多层图像（每颗心脏约80张切片），我们开发了一种稳健的、基于颜色的半自动化算法，能够快速高效地分析大规模图像数据集，并在数分钟内量化整体梗死面积。通过上述改进，本方法显著优化了TTC染色流程，为研究心肌缺血性损伤的实验室提供了一种广泛适用且极具价值的工具。

引言

在过去二十年中，心肌保护一直被视为在心脏遭受严重缺血性损伤后保护心肌细胞的关键策略1。无论是在实验研究还是临床实践中，心肌损伤的最终范围都是评估心肌保护干预措施有效性的关键指标2。因此，对梗死面积进行可靠且准确的评估具有重要价值且十分必要。

在啮齿类动物模型中，评估死后梗死面积的标准方案主要依赖于线粒体脱氢酶的活性，该酶可将无色化合物2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）在存活细胞中酶促转化为红色沉淀物，而在坏死组织中则保持浅灰色3。尽管基于TTC的染色方法简单且成本较低，但仍存在若干方法学上的挑战和内在局限性。这些问题包括心脏切片在TTC溶液中发生收缩，严重扭曲组织结构，导致切片无法平整展开以进行平面测量；样本处理过程中切片厚度不均；以及图像质量较差，难以准确界定梗死边界。近年来，样本制备过程已引入多种技术改进措施，例如使用丙烯酸心脏模具4或对心脏进行半冷冻处理以利于切片3。尽管这些改进显著提高了组织切片的可操作性，传统方法仍依赖于对较厚心脏切片进行宏观成像，常导致图像质量参差不齐且不理想5，颜色对比度不足可能使梗死面积测量引入较大主观性6。此外，传统方法需要使用完整心脏组织，从而无法在同一组织样本上进行多种用途的分析，例如对调控蛋白进行免疫共染色以鉴定参与心脏存活的关键信号通路。因此，通常需要大量实验动物才能充分回答不同的研究问题。

为了克服这些局限性5，我们开发了一种适用于TTC染色显微成像的实验方案。该方法结合了"灌注+浸染"染色步骤与心脏组织冷冻切片技术，将组织切成适合光学显微镜成像的薄片。尽管该方法已有近期报道7，但我们认为提供详细的实验操作流程可显著提升其实用性与可及性。此外，由于显微TTC方法可生成包含多个心脏切片层面的高分辨率图像，我们开发了一种稳健的、基于颜色的半自动分析算法，以应对大规模图像数据集分析耗时的问题。本方法可在数分钟内实现梗死区域的快速检测及全心梗死面积的定量分析。

总体而言，本文介绍的实验方案是一种有价值的工具，可帮助研究人员高效、简便且准确地实施该方法。

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方案

所有实验均经德国北莱茵-威斯特法伦州LANUV批准，并依照ARRIVE指南和《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》进行。所有必需的仪器和化学品均列于材料表中。

1. 建立Langendorff逆向灌流系统

注意：该系统由一个双联三通旋塞阀组成，该旋塞阀连接至一根主动脉插管，插管由20号钝化针头制成，并带有两个灌注端口，一个用于灌洗液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）端口），另一个用于TTC灌注（TTC端口）。通过切换三通旋塞阀的方向，可交替向心脏输送灌注液。

  1. 使用一小段胶带将装置水平固定在150毫米的培养皿上，以防止后续步骤中发生不必要的移动。
  2. 调节套管尖端，使其位于底部上方1毫米处，并与心脏平放时的主动脉根部水平对齐。
  3. 通过PBS加样口，使用10 mL注射器将系统预先充满冰冷的PBS。
  4. 配制新鲜染色液（1% TTC溶于PBS中）；每个心脏至少需要6 mL染色液。
    注意：TTC通常被认为具有危害性，需谨慎操作，因其可能引起轻度皮肤刺激、严重眼刺激，吸入后有害。废弃物和残留物应按照当地主管部门的要求进行处置。
  5. 使用3 mL注射器将染色液预先注入TTC加样口。
  6. 确保系统内无意外气泡，因为气泡可能导致空气栓塞，干扰后续染色。大多数情况下，气泡在系统中可见；若存在气泡，可在垂直放置套管时，轻轻敲击三通旋塞，同时抽出并重新注入PBS以去除气泡。
  7. 使用6-0丝线打一个松散的半结，并将其套在套管的远端，用于后续固定主动脉根部。

2. 心脏样本制备

注意：本研究使用 C57BL/6J 小鼠（20–25 g）。实验性心肌梗死（MI）通过外科手术结扎左前降支动脉（LAD）30–60 分钟诱导，具体方法如下所述。MI 诱导方法已有文献报道8，本文不再详述。除非另有说明，心脏样本均在 MI 后 24 小时采集。

  1. 取出心肌梗死小鼠，置于深度异氟烷麻醉（3%，v/v）下，通过颈椎脱位法实施安乐死。
    注意：所有安乐死操作必须按照当地法规进行适当记录和报告，包括安乐死的原因及所使用的方法。
  2. 将已实施安乐死的动物转移至手术台，并用胶带固定四肢。
  3. 使用显微解剖镊和剪刀去除从中腹部至前肢中部区域的毛皮。
  4. 在膈肌下方稍作位置，于腹壁肌肉层做一条长约2 cm的横向切口，以便后续进行胸腔切开术。
  5. 用精细剪刀剪开膈肌，暴露心脏，然后在皮肤、肌肉和肋骨上做双侧切口，打开胸腔。
  6. 双侧向后剪除膈肌，并通过抬起胸骨充分暴露心脏。
  7. 立即向心脏表面倾倒20 mL冰冻PBS，以停止心跳。
  8. 连同周围组织（肺和食管）一起切除心脏，并将组织块转移至盛有冰冻PBS的50 mL烧杯中，约1分钟，使心跳完全停止。
  9. 将心脏转移至150 mm培养皿中，在双目显微镜下使用精细镊子和剪刀去除主动脉根部周围的结缔组织。
  10. 轻柔移除胸腺，暴露升主动脉。
  11. 通过解剖结缔组织，修整主动脉根部。
  12. 用精细镊子夹起主动脉残端，并将其套入已连接灌注装置的套管上，该装置预先充满PBS和TTC染色液。插入过程中使用精细镊子稳定主动脉根部管壁。
  13. 使用套管上预先打好的松结固定主动脉。在用PBS逆行灌注时，仔细检查套管和心脏。随着进入心脏的PBS体积增加，心室膨胀可直观确认心脏灌注充盈情况。
  14. 保留心外组织（肺和食管）于原位，以维持心脏处于自然且合适的位置。

3. TTC 染色

  1. 固定插管后，用湿润的组织纸覆盖心脏。
  2. 使用预先连接的、装有冰冻 PBS 的 10 mL 注射器，以 2–3 mL/min 的速度冲洗心脏 3 分钟，直至冠状静脉流出液变澄清。此步骤可确保心脏及冠状动脉内仅残留极少量血液。操作过程中应避免灌注压力过高，以免导致梗死区域心室破裂。
  3. 在双目显微镜下检查心脏，确认主动脉根部无渗漏，并且在灌注压力下心脏能正常膨胀。
  4. 将三通旋塞转向 TTC 溶液方向，通过 TTC 注入口在 30 秒内缓慢注入 1 mL 染色液。
  5. 5 分钟后再次注入 1 mL TTC 溶液，并在再过 5 分钟后（即首次 TTC 灌注后 10 分钟）重复此步骤一次。整个过程共需 3 mL TTC 溶液，分三次灌注，总时长为 15 分钟。
  6. 在双目显微镜下观察心脏表面，此时应已能清晰区分存活心肌（深红色）与坏死组织（浅灰色）。
  7. 使用精细剪刀去除所有非心脏组织，将染色后的心脏转移至含有 3 mL TTC 溶液的 15 mL 锥形管中。
  8. 将锥形管置于 4 °C 过夜，进行浸没式二次染色。

4. 组织块制备

  1. 将心脏从锥形管中取出，并用纸巾小心擦干。此时，存活心肌的染色更加明显，而非灌注心肌（心外膜及可能的心内膜区域）也呈现淡红色染色。
  2. 使用1 mL注射器将最佳切割温度（OCT）包埋剂填充至钝头弯形20号套管中。
  3. 用精细剪刀切除三尖瓣，并将套管插入右心室。
  4. 向心腔内注入OCT包埋剂（约50–80 µL），当观察到回流时停止灌注。
  5. 暴露二尖瓣，并将套管经左心房和二尖瓣插入左心室。
  6. 轻柔地向心腔内灌注OCT包埋剂（约80 µL），当观察到主动脉有流出时停止灌注。
  7. 准备一个由铝箔制成的小型圆柱形胶囊（直径1 cm），并加入300 µL OCT包埋剂。
  8. 将心脏小心放入胶囊中，保持心尖朝下的位置，并调整为垂直方向。从顶部俯视时，心尖不应过度偏向任何一侧。
  9. 将胶囊浸入预冷至-30 °C至-40 °C的2-甲基丁烷溶液中。
  10. 让样本在溶液中停留5–10分钟，直至完全凝固形成组织块。
  11. 标记组织块，并于-80 °C保存，以备后续组织学分析。

5. 冷冻切片与固定

  1. 使用OCT包埋剂将组织块固定在冷冻切片机的样品夹头上。
  2. 将样品夹头放入冷冻切片机中，并将温度设置为约 -24 °C。
  3. 切片至可见组织块的尖端。
  4. 将切片厚度设为 50 µm，并每隔一片收集一次，使相邻收集切片之间的间隔为 100 µm。
    注意：避免冷冻切片过程中出现组织折叠。通过用OCT包埋剂填充空的脑室腔隙可显著减少此类问题（见步骤4.4–4.6）。
  5. 将切片按顺序排列在玻璃载玻片上，每张载玻片放置八片。每颗心脏预计共需80个切片，即10张载玻片。
  6. 用吹风机以最低档位、室温气流（无需加热）吹干载玻片，时间约为10分钟。
  7. 将载玻片浸入盛有Zamboni固定液（含2% 甲醛和0.4% 苦味酸，w/v）的染色缸中。
    警告：Zamboni固定液可能引起皮肤过敏反应，并可能具有致遗传缺陷和致癌风险。废弃物和残留物应按照当地主管部门的规定进行处理。
  8. 在4 °C下固定心脏组织过夜。长时间固定可确保心脏组织表面在固定过程中不产生气泡。
  9. 固定完成后，将载玻片从固定液中取出，并用PBS冲洗三次。
  10. 用封片剂封片，并加盖盖玻片。此步骤完成后，心脏切片即可用于图像采集。
  11. 将样本置于载玻片盒中，于室温保存。
    ​注意：由于甲臜沉淀物不溶于水，染色结果可长期保存多年而不褪色。

6. 成像与处理

  1. 使用1.25倍物镜设置光学显微镜，并运行CellSens软件进行成像。
  2. 将心脏切片置于视野中央。
  3. 根据需要调整相机的曝光时间、焦距和白平衡。
  4. 采集每张切片的图像，并将同一心脏的所有图像保存至专用文件夹中。
  5. 将R脚本（补充文件1）复制到RStudio平台，并运行基于R语言的自动化算法以评估心肌梗死（MI）。该算法计算每张切片的平面梗死面积，并进一步计算整个心脏的总梗死体积。
  6. 将数据集导出为Excel文件，并根据需要进行数据分析。
  7. 将每颗心脏的所有图像导入ImageJ平台，用于后续三维重建。
  8. 通过ImageJ平台的弹出菜单，按一致且连续的顺序堆叠所有图像。
  9. 使用表面图功能创建三维结构。
  10. 打开体积查看器窗口，并调整所有参数以实现三维投影。
    注意：免疫组织化学9的方法以及传统TTC染色的视频4,5已有先前报道，本论文中未予包含。

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结果

进行显微TTC染色的关键步骤如图1所示。经过两轮TTC染色后，心脏表面呈现出明显的穿孔状图案。以100-µm间隔对整个心脏进行连续切片，共获得约80个组织切片，结扎部位位于第60个切片附近。在每个切片中，存活心肌细胞（viaCM）呈现深红色染色，而由苦味酸标记的黄色坏死组织（necCM）与之形成清晰对比，边界分明（图2A）。对所有切片进行三维重建，进一步可视化了viaCM和necCM在心脏内的空间分布及体积（图2B）。与传统染色方法相比，显微染色方案提供了更清晰、更锐利的边界以及更高的存活组织与梗死组织信号比（图2C）。在样本处理过程中，用OCT填充心室腔可防止心脏收缩变形，使心脏保持生理形态，且未影响梗死面积的定量分析或引起结构损伤，完整的心内膜层即为佐证（图2D

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讨论

心肌梗死（MI）由持续的心肌缺血引起，仍是全球主要的健康问题，因为缺血性损伤常会损害心脏有效血液循环所必需的收缩功能。在过去的几十年中，人们已投入大量努力，致力于寻找能够增强心脏对缺血应激耐受性的干预措施或化合物1。尽管已探索了多种替代性替代终点指标，例如酶释放11、缺血后功能恢复情况，或培养细胞中的细胞存活性指标1213，但只有对组织坏死程度的直接定量才能明确证实抗梗死干预措施的有效性6。因此，一种能够在完整心脏中可靠且早期检测心肌细胞存活性及心肌梗死的方法，对于推动该领域的研究至关重要14。

在此背景下，四氮唑染色已成为检测心肌梗死（MI）最常用的方法。该技术基于活组织中存在的脱氢酶及辅因子所催化的酶促反应，可将无色的四氮唑盐（TTC）还原为深红色的甲臜色素1...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由 FoKo 23/2013 和杜塞尔多夫心血管研究所（CARID）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.25倍物镜OlympusPlanApo 1.25X/0.04成像
10 mL 注射器B.Braun4617100V逆行灌注
2,3,5-三苯基氯化四氮唑Milipore1.08380.0100化学品
20 G 套管针BD305895逆行灌注
3  mL 注射器B.Braun4617022V逆行灌注
三通阀B.Braun16494C逆行灌注
Aquamount BDH362262H冷冻切片
天平OhausN/A称量化学品
双目解剖显微镜LeicaMZ6插管
C57BL/6JJanvierN/A实验动物
相机OlympusUC30成像
盖玻片EprediaBB02400500A113MN20冷冻切片
冷冻切片机LeicaM850冷冻切片
双蒸水MiliporeN/A溶解化学品
精细解剖剪AESCULAPBC702R手术器械
精细显微解剖镊 AESCULAPFM001R手术器械
玻璃载玻片Engelbrecht11102冷冻切片
ImageJNIH1.54g图像处理
异氟烷Piramal14150097146754化学品
异丙醇Roth 0733.1化学品
光学显微镜OlympusBX61成像
显微解剖镊 F.S.T11152-10手术器械
OCT 包埋剂Sakura4583化学品
培养皿Thermo Scientific172931逆行灌注
磷酸盐缓冲液Roth9143.1化学品
RstudioPosit Software2024.09.0图像处理
丝线缝合线F.S.T18020-60逆行灌注
软件OlympusCellSens V3.2成像
不锈钢解剖剪AESCULAPBC257R手术器械
Zamboni 固定液Morphisto12773.0050化学品

参考文献

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