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基于质谱的乳酸化蛋白质组分析及乳酸化蛋白的验证

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DOI：

10.3791/68597

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2026年4月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

本文内容

摘要

本方案以食管鳞状细胞癌细胞系为例，介绍蛋白质乳酸化分析的方法。该过程涵盖从细胞培养到候选蛋白验证的蛋白质乳酸化分析，包括基于乳酸化的质谱分析以及通过免疫共沉淀进行验证。

摘要

乳酸化是一种发生在赖氨酸残基上的新型翻译后修饰（PTM），最早于2019年被发现，此后已被证明在多种病理和生理过程中具有重要意义。该修饰存在两种异构体（L-和D-乳酸化），已知可影响靶蛋白的复合物形成、细胞定位或稳定性。本实验方案以TE11食管鳞状细胞癌细胞系为例，介绍了一种从细胞培养到潜在乳酸化靶蛋白验证的乳酸化分析方法。以下方案将详细描述通过L-乳酸赖氨酸（KL-LA）特异性免疫沉淀（IP）富集肽段并进行质谱（MS）分析，以鉴定乳酸化蛋白的具体步骤：（1）蛋白提取，（2）蛋白还原、烷基化和酶解，（3）蛋白纯化及肽段浓缩，（4）使用KL-LA磁珠进行免疫沉淀，以及（5）KL-LA肽段的浓缩。完成上述步骤后，将对质谱原始数据进行分析以鉴定乳酸化位点，并通过免疫沉淀验证这些潜在的乳酸化蛋白。采用该方法可鉴定出100至500个肽段，并可进一步确认感兴趣的乳酸化蛋白。总之，研究乳酸化蛋白有望加深我们对正常及疾病状态下由翻译后修饰驱动的细胞信号通路的理解。

引言

乳酸化是一种利用糖酵解代谢物对赖氨酸残基进行的翻译后修饰（PTM）。L-乳酰辅酶A和乳酰谷胱甘肽分别是L-乳酸化（KL-LA）和D-乳酸化（KD-LA）的底物1,2。L-乳酸化是一个由酶催化的过程，涉及乙酰转移酶等酶类3,4。相反，D-乳酸化则是一种非酶促过程，通过乳酰谷胱甘肽与赖氨酸残基之间的亲核取代反应实现5。作为一种动态修饰，已有研究表明去乙酰化酶如HDAC1-3可作为乳酸化修饰的“擦除”酶6。自2019年被发现以来3，乳酸化在多种病理及生理过程中的作用已引起关注2。该PTM最初通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析观察到组蛋白上出现72.021 Da的质量偏移而被鉴定3。此后，研究人员在组蛋白以外的其他蛋白质上也检测到了乳酸化修饰，并发现其可依据不同生物学背景影响被修饰蛋白的功能多样性、亚细胞定位或稳定性7,8,9,10。

考虑到翻译后修饰（PTMs）通常丰度较低11，且属于动态且短暂的过程12，因此需要通过免疫沉淀（IP）对目标PTM进行富集。随后，质谱（MS）常用于分析经酶解后的肽段中与PTM相关的蛋白质组，例如磷酸化蛋白质组或泛素化谱型分析11。与这些其他PTMs类似，对于乳酸化蛋白质组或富集后的乳酸化肽段，基于质谱的蛋白质组学是鉴定新乳酸化位点的金标准方法。

本方案描述了通过基于质谱的蛋白质组学方法鉴定富含KL-LA的肽段，随后通过免疫沉淀验证乳酸化蛋白质。以食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系为例，我们介绍了一种富集乳酸化蛋白质的方案，用于基于质谱的乳酸化靶蛋白鉴定，并通过免疫沉淀进行后续验证。

方案

由于翻译后修饰（PTMs）是一个动态且短暂的过程，使用抗-KL-LA抗体通过流式细胞术或蛋白质印迹法预先确定乳酸化总体水平最佳时的细胞汇合度至关重要。例如，在食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞系中进行乳酸化组学和免疫沉淀（IP）实验时，优选70%–80%的细胞汇合度，因为此时乳酸化总体水平达到最高。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 细胞培养

  1. 按照前述方法，将细胞在100 mm培养皿中培养至所需汇合度。
    注意：需培养足够数量的细胞，以获得0.5–1 mg蛋白用于乳酸化修饰组分析，或超过2 mg蛋白用于免疫沉淀（IP）。
  2. 用5 mL预冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。
  3. 加入500 μL预冷PBS，使用细胞刮刀收集细胞，并转移至1 mL低吸附微量离心管中。
  4. 在室温（RT）下以2,000 x g 离心5分钟，弃去上清液。细胞沉淀可于-80 °C保存。

2. 乳酸化修饰组

注意：操作时应始终佩戴手套，以防止样本污染。务必使用带滤芯的吸头、低吸附微量离心管和质谱级水。
注意：为确保鉴定到的修饰具有可重复性，应始终进行生物学重复实验（根据我们的经验，通常为3-5次）。

  1. 蛋白质提取
    注意：操作过程需在冰上进行。
    1. 配制乳酸化蛋白质组裂解缓冲液（表 1），使用前置于 4 °C 保存。使用前立即加入蛋白酶抑制剂。
    2. 使用适量体积的裂解缓冲液提取蛋白质。
    3. 在冰上进行超声处理，设置为 12 个循环，每个循环 5 秒开启 + 5 秒关闭，强度为 20%–25%。
    4. 在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 10 分钟。将含有蛋白质的澄清上清液转移至新的低吸附微量离心管中。
    5. 根据制造商的说明，使用二辛可宁酸（BCA）试剂盒定量蛋白质。
      ​注意：BCA 试剂盒最多可耐受 3 M 尿素。因此，样品需相应稀释。
    6. 将 500 μg 至 1 mg 的蛋白质转移至新的低吸附微量离心管中。每个样品使用相同量的蛋白质。用乳酸化蛋白质组裂解缓冲液将所有样品补足至相同最终体积。
  2. 还原、烷基化及酶解消化
    1. 加入二硫苏糖醇（DTT），使其终浓度为 5 mM。在 95 °C 下孵育 2 分钟。
    2. 在室温下孵育 30 分钟。
    3. 加入氯乙酰胺（chloroacetamide），使其终浓度为 7.5 mM。避光于室温下孵育 20 分钟。
    4. 加入样品体积（步骤 2.1.6）3 倍量的 1 M (NH4)2CO3，将尿素浓度从 8 M 降至 2 M。
      ​注意：若总体积超过微量离心管的容量，应将其分装至两个微量离心管中。
    5. 每 100 µg 蛋白质加入 1 μg 质谱级胰蛋白酶。在 30 °C 下过夜孵育。随后进行样品纯化。
  3. 纯化与肽段浓缩
    ​注意：在室温下操作。
    1. 通过加入三氟乙酸（TFA）至终浓度为 0.2%，对样品进行酸化。
    2. 使用质谱级水新鲜配制以下溶液：0.1% TFA、1% 甲酸（FA）以及 1% FA/50% 乙腈。
    3. 使用 C18 100 mg 柱进行纯化。
      ​注意：使用该柱时，需使用两个移液枪头：一个用于上样，另一个剪去尖端以推动液体流出。确保柱子始终保持湿润。每个样品使用一根柱子。
    4. 用 1 mL 100% 乙腈（润湿液）润湿柱子并推出液体。重复两次。
    5. 用 1 mL 0.1% TFA 平衡柱子并推出液体。重复两次。
    6. 将 1 mL 酸化后的样品上样至柱子。进行 10 次上样/推出循环。若仍有样品残留，重复操作。
    7. 用 1 mL 0.1% TFA 洗涤柱子并推出液体。重复两次。
    8. 洗脱时，使用 750 μL 1% FA/50% 乙腈进行 10 次上样/推出循环。收集洗脱液至新的低吸附微量离心管中。再用额外的 750 μL 1% FA/50% 乙腈重复一次，共收集 1.5 mL 纯化后的肽段。
      ​注意：应在管壁侧面标记微量离心管，而非管盖，以避免穿刺管盖时污染样品。
    9. 用针头在微量离心管管盖上穿刺 1 至 3 个孔，用于蒸发。
    10. 使用真空浓缩仪，在 60 °C 下浓缩样品直至所需程度（对于最终体积为 1.5 mL 的样品，可能至少需要 4 小时）。随后进行肽段的免疫沉淀。
  4. 使用 KL-LA 磁珠进行免疫沉淀
    1. 配制洗涤缓冲液和乳酸化蛋白质组免疫沉淀缓冲液（表 2）。
    2. 在冰上，向浓缩后的肽段中加入 200 μL 免疫沉淀缓冲液，上下充分混匀直至溶解。仍可能观察到少量沉淀。
    3. 在 4 °C 下以 12,000 x g 离心 10 分钟，去除所有沉淀。
      ​注意：离心后，可使用分光光度计在 205 nm 处测定肽段浓度，作为对照步骤。
    4. 用 200 μL 冰冷的 1× PBS 洗涤 KL-LA 琼脂糖偶联磁珠 3 次，每次在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 1 分钟，并在每次洗涤后弃去上清液。
      ​注意：若本方案起始蛋白量为 1 mg，使用预先分装于 0.5 mL 低吸附管中的 20 μL KL-LA 琼脂糖偶联磁珠，以便操作。
    5. 将含有重悬肽段的澄清上清液转移至含有预洗磁珠的 0.5 mL 微量离心管中。用石蜡膜密封管口，防止泄漏。
    6. 在 4 °C 下轻轻翻转孵育过夜。
      ​注意：步骤 2.4.7–2.4.12 均在 4 °C 下进行。
    7. 在 2,000 x g 下离心 1 分钟使磁珠沉淀，弃去上清液。
    8. 加入 200 μL 乳酸化蛋白质组免疫沉淀缓冲液，翻转混匀洗涤 15 秒。在 2,000 x g 下离心 30 秒，弃去上清液。
    9. 重复步骤 2.4.8 一次。
    10. 加入 200 μL 洗涤缓冲液，翻转混匀洗涤 15 秒。在 2,000 x g 下离心 30 秒，弃去上清液。
    11. 重复步骤 2.4.10 两次。
    12. 加入 200 μL 质谱级水，翻转混匀洗涤 30 秒。在 2,000 x g 下离心 1 分钟，弃去上清液。
      ​注意：乳酸化蛋白质组方案的后续步骤在室温下进行。
    13. 在室温下，用 100 µL 洗脱缓冲液（新鲜配制的 0.1% TFA）轻轻翻转孵育 1 分钟，洗脱结合的肽段。在 2,000 x g 下离心 2 分钟。
    14. 重复步骤 2.4.13 两次，并合并洗脱液。随后进行样品纯化。
  5. KL-LA 肽段的浓缩与纯化
    1. 使用质谱级水新鲜配制以下溶液：0.1% TFA、1% FA 和 1% FA/50% 乙腈。
      ​注意：在开始纯化前，应在 1.5 mL 微量离心管中配制适量溶液（步骤 2.5.3：300 μL 100% 乙腈，步骤 2.5.4：300 μL 0.1% TFA，步骤 2.5.6：300 μL 0.1% TFA，步骤 2.5.7：300 μL 1% FA/50%）。
    2. 使用 100 μL C18 吸头进行纯化。
      ​注意：100 μL C18 吸头的使用方式与传统移液枪头相同。操作过程中保持手指按压，各步骤之间切勿松开活塞，以保持柱子湿润并防止引入空气。
    3. 吸取 100 μL 100% 乙腈（润湿液），小心推出但不完全排空。重复两次。
    4. 通过吸取 100 μL 0.1% TFA 并小心推出，对柱子进行平衡。重复两次。
    5. 将 100 μL KL-LA 肽段样品上样至柱子。在新的低吸附微量离心管中进行 10 次上样/推出循环。若仍有样品残留，重复操作。
    6. 通过吸取 100 μL 0.1% TFA 并推出，洗涤柱子。重复两次。
    7. 洗脱时，在新的低吸附微量离心管中使用 100 μL 1% FA/50% 乙腈进行 10 次上样/推出循环。重复两次，并合并洗脱液。
      ​注意：肽段与 C18 吸头结合可能导致吸头无法一次性吸取 100 μL。重复此步骤，直至微量离心管中无残留液体（步骤 2.5.7 中共 300 μL）。
    8. 用针头在微量离心管管盖上穿刺 1 至 3 个孔，用于蒸发。
      ​注意：应在管壁侧面标记微量离心管，而非管盖，以避免穿刺时污染样品。
    9. 使用真空浓缩仪，在 60 °C 下浓缩样品直至液体完全蒸发（总体积为 300 μL 时，可能至少需要 2 小时）。
    10. 用 30 μL 1% FA 重悬浓缩后的肽段。
    11. 根据质谱平台的操作指南，使用分光光度计在 205 nm 处测定肽段浓度，以确定其浓度。
    12. 转移至玻璃小瓶中，4 °C 保存直至进行质谱分析。

3. 质谱分析与生物信息学

注意：样品在舍布鲁克大学蛋白质组学核心设施使用质谱仪（MS）进行分析（采用数据依赖性采集串联平行累积-连续碎裂模式（DDA-PASEF））。

  1. 质谱分析
    1. 对于每个样品，将 375 ng 肽段注入高效液相色谱（HPLC）系统。
    2. 以 4 µL/min 的恒定流速将肽段加载至捕获柱上。
    3. 使用分析型 C18 柱，在 0.1% 甲酸（FA）中以 5%–37% 乙腈进行 2 小时梯度洗脱，流速为 400 nL/min，实现肽段分离。
    4. 采用以下参数进行电喷雾电离：毛细管电压：1500 V，干燥气体流速：3.0 L/min，干燥温度：180 °C，TIMS 进口压力：2.6 mBar。
    5. 在 100–1700 m/z 范围内，使用 DDA 自动 MS/MS 模式采集质谱数据。
      ​注：仪器设置为检测电荷态 0 至 5+。采用双陷俘离子迁移谱（TIMS）构型， ramp 时间为 100 ms，每次采集循环包含 10 次并行累积-串行碎裂（PASEF）扫描，形成 1.17 s 的工作周期。动态排除时间为 0.4 分钟。
    6. 使用碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，能量在线性范围内从 20–59 eV 递增，离子迁移范围为 0.6–1.6 Vs/cm²。
      ​注：目标强度设为 20,000，强度阈值为 2,500。应用标准滤波多边形，优先选择在 m/z-离子迁移率平面上沿对角扫描线分布的 +2、+3 和 +4 电荷肽段前体离子。
  2. 数据预处理：MaxQuant 分析
    ​注：以下步骤使用 MaxQuant v.2.6.713 软件识别乳酸化肽段。
    1. 在屏幕右上角，点击 Configuration 选项卡，确认乳酸化修饰已添加为修饰类型。
    2. 若未添加，请访问 Unimod.org 数据库14，以访客身份登录并搜索乳酸化（编号 #2114）。
    3. 点击 Add 按钮，在 Name 栏中输入 Lactylation (K)，通过点击 Change 按钮输入 Unimod 中列出的化学组成。
    4. 核对获得的单一同位素质量，点击 OK。
    5. 在屏幕左上角蓝色区域，点击 Save changes 按钮。
    6. 在左上角区域点击 Raw data，加载原始数据文件，并使用 No fractions 按钮自动命名。
    7. 根据计算机可用核心数，在左下角设置线程数量。
    8. 在 Group specific 选项卡中，点击蓝色的 Modifications。
    9. 通过点击箭头按钮，将乳酸化添加至“可变修饰”右侧方框中。
    10. 点击 Label-free quantification，输入 LFQ，并将归一化类型更改为“无”。
    11. 点击 Digestion，确保“Trypsin/P”已添加至右侧方框中。
    12. 将 Max. missed cleavages 增加至 4，因为乳酸化可能影响胰蛋白酶消化效率。
    13. 点击 Instrument，将 Main search peptide tolerance 更改为 20，考虑到乳酸化并非常见翻译后修饰（PTM）。
    14. 在左上角区域点击 Global parameters，添加此前从 UniProt 或 Ensembl 下载的对应物种的 Fasta 文件。
    15. 点击 Identifier rule 并点击 Test，确保 Fasta 文件可被正确读取。
    16. 点击蓝色的 Protein quantification，将乳酸化添加至右侧方框中。
    17. 点击蓝色的 Identification，将 FDR 更改为 0.05，并确保勾选 Second peptides 和 Match between runs。
    18. 点击蓝色的 Label-free quantification，勾选 iBAQ 和 Top3 选项。
    19. 在右上角区域点击 Performance。
    20. 在底部区域点击蓝色的 Start 按钮。
  3. 乳酸化蛋白的鉴定
    注：MaxQuant 分析完成后，将生成多个输出文件，例如：
    •  Lactylation (K)Sites：主要关注文件——包含特定位点乳酸化赖氨酸残基的精确肽段序列信息（蛋白鉴定、乳酸化在序列中的定位、强度值、置信度）。
    •  Lactylation parameters：包含 MaxQuant 分析过程中使用的所有设置和阈值信息。
    •  Lactylation peptides：已鉴定的修饰与未修饰肽段。
    •  Lactylation protein groups：已鉴定的蛋白组及其与检测到的乳酸化修饰的关联。
    ​这些文件的使用取决于具体研究问题。下一步描述如何鉴定乳酸化位点。
    1. 在 Excel 中打开 Lactylation (K)Sites 文件。
    2. 在底部复制 Lactylation (K)Sites 工作表，以保留原始数据。
    3. 对 Reverse 和 Potential contaminant 列按 A 到 Z 排序，若某些行存在数值，则删除这些行。
    4. 在新工作表中仅保留必要列，包括：(1) Protein: UniProt14 主登录号，(2) Positions within proteins：乳酸化位点的预测位置（需按后续方法确认），(3) Protein names，(4) Gene names，(5) Number of Lactylation (K) detected on the corresponding peptide，(6) Lactylation (K) Probabilities（乳酸化位点的概率为 1），(7) Intensity（对应肽段所有个体强度的总和）。
    5. 补充任何缺失的 Protein names 或 Gene names 值。
    6. 仅保留“Proteins”列中的第一个登录号。所得表格代表所有检测到的乳酸化肽段及其最可能对应的蛋白。
      ​注：由于乳酸化并非丰度较高的翻译后修饰，预期可鉴定出 100 至 500 条乳酸化肽段。由于不同重复间检测到的肽段可能不同，可设定至少在两个生物学重复中检测到的肽段作为筛选阈值。
    7. 为确认修饰残基的位置，使用 NIH 提供的 BLAST15 或 UniProt 提供的 Align16 等序列比对工具，输入“Lactylation (K) Probabilities”列中的肽段序列（删除所有概率值）以及来自 UniProt 数据库17 的蛋白序列。
      注：由于单个蛋白序列中可能鉴定出多个乳酸化位点，可同时比对这些位点，这也有助于识别位于蛋白序列相同位置但出现在不同肽段上的重复位点。
    8. 数据分析取决于具体研究问题，但在进行任何统计分析之前，必须考虑归一化、中心化、缩放和对数转换等数据处理步骤18。
    9. 为验证质谱分析鉴定出的乳酸化蛋白，需进行免疫共沉淀实验。

4. 免疫沉淀（IP）

  1. 蛋白质提取
    注意：操作过程中保持冰上进行。
    1. 配制免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液（表3），使用前保存于4 °C。使用前立即加入蛋白酶抑制剂。
      ​注意：样品制备可使用保存于-80 °C的细胞沉淀。若使用新鲜细胞，请按步骤4.1.2和4.1.3操作。否则，将细胞沉淀用与步骤4.1.2中所述相同体积的免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液重悬，并继续进行步骤4.1.4。
    2. 加入1 mL免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液，在4 °C孵育10分钟。
    3. 使用细胞刮刀收集细胞，并将裂解液转移至1.5 mL微量离心管中。
    4. 在4 °C下轻轻颠倒旋转孵育30分钟。
    5. 在4 °C下以16,000 x g离心10分钟。
    6. 将澄清的上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    7. 根据试剂盒说明书，使用BCA法测定蛋白浓度。
  2. 磁珠预清除及KL-LA 抗体孵育
    注意：操作过程中保持冰上进行。每个实验条件需准备一个对照IP管（使用与KL-LA抗体同种属的IgG）和一个用于KL-LA免疫沉淀的管。
    1. 将1 mg蛋白转移至新的1.5 mL微量离心管中。使用免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液将所有样品补至相同终体积。
      ​注意：本实验方案可使用磁珠或琼脂糖珠。后续步骤中使用的是磁珠。
    2. 将所需体积的磁珠转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    3. 为预洗涤磁珠，将磁珠置于磁力架上30秒或直至溶液澄清。弃去上清液。用500 µL免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，每次洗涤后弃去上清液。最后加入与初始磁珠体积相等的免疫沉淀缓冲液。
    4. 将蛋白样品与10–15 µL预洗涤磁珠在4 °C下轻轻颠倒旋转孵育20分钟。
      ​注意：每1 mg蛋白使用10–15 µL磁珠。此步骤可减少免疫沉淀过程中非特异性蛋白与磁珠的结合。
    5. 将磁珠置于磁力架上30秒或直至溶液澄清。将澄清的上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。
    6. 在一管中加入1.5 µL抗KL-LA抗体，另一管中加入相应量的IgG。
      ​注意：本实验方案起始蛋白量为1 mg时，使用1.5 µg抗体。
    7. 在4 °C下轻轻颠倒旋转孵育过夜。
  3. KL-LA免疫沉淀
    ​注意：操作过程中保持冰上进行。
    1. 配制免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液（表3），使用前保存于4 °C。使用前立即加入蛋白酶抑制剂。
    2. 按照步骤4.2.3所述方法预洗涤磁珠。
      ​注意：本实验方案起始蛋白量为1 mg时，使用40 µL磁珠。
    3. 将样品与40 µL预洗涤磁珠在4 °C下轻轻颠倒旋转孵育4小时。
    4. 将磁珠置于磁力架上30秒或直至溶液澄清。收集第一份澄清上清液。用500 µL免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，每次洗涤后弃去上清液。
      ​注意：第一份上清液可用于蛋白定量并进行蛋白质印迹（WB），有助于评估免疫沉淀的效率。
    5. 用20 µL 2x Laemmli缓冲液和5% β-巯基乙醇重悬磁珠。
    6. 在95 °C孵育5分钟后上样至SDS-PAGE凝胶。或者，变性后的样品可在-20 °C保存数周。
  4. WB检测
    1. 将IP管置于磁力架上30秒，待磁珠吸附后收集样品并上样至SDS-PAGE凝胶。
    2. 使用针对目标蛋白的抗体和/或抗KL-La抗体，在5%牛血清白蛋白（BSA）中进行蛋白质印迹，以确认乳酸化蛋白的富集。二抗在5% BSA中按1:5000稀释。
    3. 采用基于HRP的化学发光法检测条带。

结果

以食管鳞状细胞癌TE11细胞系为例，将其培养至80%融合度。根据图1所示工作流程及本方案中所述的MaxQuant分析方法，测定其乳酸化修饰组。在这些细胞中，共鉴定出137条可能被乳酸化修饰的肽段，对应82种独特的蛋白质，因为同一蛋白质上可能鉴定出多个修饰位点（图2A）。需注意，此数据未考虑唯一肽段的数量。在食管鳞状细胞癌细胞系的此类实验中，通常可鉴定出100至500条肽段。

已鉴定出的乳酸化蛋白涉及多种生物学过程，例如染色质重塑或染色质组装，这些过程在文献中已有报道，被发现富含乳酸化蛋白（图2B）。最早被鉴定出的乳酸化蛋白中包括组蛋白，本研究数据中也检测到了此类蛋白，例如组蛋白H1.2（表4）。同一种蛋白质上的多个不同赖氨酸残基均可发生乳酸化修饰。例如，在组蛋白H1.2上鉴定出两个乳酸化位点：赖氨酸（K）168（可能性较高）和191。在第一条肽段（表4，第2行）中观察到，K168残基被乳酸化修饰的概率为0.733（满分1），而K169残基的修饰概率仅为0.267。HNRNPA1是一个需要通过序列比对来确定确切修饰位点的肽段的典型示例。

为了基于乳酸化蛋白质组结果（表4）验证HNRNPA1的乳酸化修饰，进行了针对该翻译后修饰的免疫共沉淀（IP）实验。首先，为确定哪种磁珠类型与抗KL-LA抗体具有最佳相互作用，比较了G型磁珠与A/G型磁珠。使用KL-LA抗体进行免疫共沉淀后，再以KL-LA为靶标进行蛋白质印迹（WB）检测，结果显示，与上样输入（input）相比，两种磁珠均明显富集了KL-LA修饰的蛋白质（图3），该结果符合预期。这些数据表明，本实验方案在富集乳酸化修饰蛋白质方面具有高效性和稳健性。两种磁珠之间的富集效果未观察到显著差异。为进一步验证质谱（MS）鉴定出的靶蛋白，可进行特异性免疫共沉淀实验。例如，针对质谱鉴定出的HNRNPA1乳酸化修饰（表4），进行了验证。在KL-LA免疫共沉淀后进行HNRNPA1的蛋白质印迹检测，观察到一条对应于HNRNPA1的特异性条带，表明HNRNPA1确实存在乳酸化修饰（图4）。尽管G型磁珠和A/G型磁珠均能成功免疫沉淀目标蛋白，但使用A/G型磁珠时HNRNPA1的信号更强，提示其具有更高的亲和力或回收效率。

蛋白质处理示意图：提取、消化、液相色谱-串联质谱检测、乳酸化肽段分析。
图1：乳酸化蛋白质组分析流程概览。 缩写：IP = 免疫沉淀；KL-LA = L-乳酸化赖氨酸；LC-MS/MS = 液相色谱-串联质谱法。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质和肽段鉴定柱状图；基因本体（GO）生物学过程参与分析结果。
图 2：TE11 细胞乳酸化蛋白质组中部分鉴定出的蛋白质的代表性结果。 （A）鉴定出的蛋白质和肽段总数。同一种蛋白质上可鉴定出多个乳酸化位点。（B）利用 STRING 数据库获得的 TE11 细胞中乳酸化蛋白质富集度最高的前 5 个生物学过程。P 值采用 Benjamini-Hochberg 方法对多重检验进行校正。每个柱状图中的数值表示在该基因本体（GO）类别中，网络内鉴定为乳酸化蛋白质的数量占该类别总蛋白质数量的比例。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质纯化 Western blot；G珠与A/G珠比较；已标记分子量。
图3：使用G珠或A/G珠对KL-LA进行免疫沉淀，并在TE11细胞中通过WB检测Pan-KL-LA。 Pan-KL-LA的检测作为关键对照，用于确认对该PTM进行免疫沉淀的有效性和特异性。本实验确保IP成功富集了携带KL-LA修饰的蛋白质。(*)表示抗体的重链和轻链，在IP: IgG泳道（对照IP）中清晰可见（N = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

Western blot 蛋白质分析、实验、HNRNPA1 检测、免疫沉淀、分子量
图 4：使用 G 或 A/G 磁珠对 KL-LA 进行免疫沉淀并通过 WB 检测 HNRNPA1。 在 TE11 细胞中，使用 G 或 A/G 磁珠进行 KL-LA 特异性免疫沉淀后通过 WB 检测到 HNRNPA1，证实其存在乳酸化修饰（N = 3）。请点击此处查看该图的放大版本。

溶液终浓度
尿素8 M
碳酸氢铵1 M
HEPES20 mM

表1：乳酸化蛋白质组裂解缓冲液。使用质谱级水配制，并将pH值调节至8。

溶液 - 乳酸化组洗脱缓冲液终浓度
NaCl100 mM
EDTA1 mM
Tris-HCl20 mM
用于乳酸化组免疫沉淀缓冲液的添加物终浓度
NP-400.5%

表2：乳酸化蛋白质组洗涤缓冲液和免疫沉淀缓冲液。 使用质谱级水配制，并将两种溶液的pH值均调节至8。

溶液终浓度
氯化钠100 mM
氟化钠50 mM
Tris-HCl (pH 7.5)50 mM
β-甘油磷酸钠40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
甘油5%
Triton X-1001%
需新鲜添加：
蛋白酶抑制剂混合物（100X）1X
PMSF1 mM
正钒酸钠0.2 mM

表3：免疫沉淀裂解/洗涤缓冲液。该缓冲液必须不含变性剂，因为变性剂可能会破坏蛋白质上翻译后修饰的稳定性。

蛋白质中的位置蛋白质蛋白质名称基因名称乳酸化修饰位点数 (K)乳酸化修饰 (K) 概率强度
168P16403组蛋白 H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403组蛋白 H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0α-2-巨球蛋白样蛋白 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5;5;5C9JMM0染色盒蛋白同源物 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10;10;10C9JMM0染色盒蛋白同源物 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112;141O76095-2蛋白 JTBJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350;298;298;297;285;245;
253;169;48;100;95;93;79;
23;93;92;79;28;74;50;73;
51;57;56;48;61;66;66;73		P09651异质性细胞核核糖核蛋白 A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

表4：食管鳞状细胞癌细胞系TE11中乳酸化肽段的代表性结果。 本表格基于MaxQuant分析获得。

讨论

本方案描述了如何通过免疫沉淀KL-LA修饰的蛋白质，结合质谱（MS）技术，发现新的乳酸化蛋白质及其乳酸化位点。该乳酸化蛋白质组学方案使用偶联磁珠进行，但也可根据研究问题选择使用KL-LA抗体，甚至KD-LA抗体。若使用抗体而非偶联磁珠，选择多克隆抗体有助于形成更稳定的复合物，因其可结合多个表位；然而，该方法可能引入实验变异性。使用偶联磁珠的一个优势在于可防止抗体从固相载体上脱落（即渗漏），从而避免污染质谱样品。此外，该方法相比使用未偶联抗体更为省时高效。

此外，需要注意的是，此类分析中鉴定出的肽段数量可能受多种因素影响1。首先，抗体特异性在确保正确捕获目标蛋白方面起着关键作用。添加使用琼脂糖珠进行预清除的步骤，可能有助于去除非特异性相互作用。另一方面，目前尚不清楚乳酸化是否会影响胰蛋白酶的消化效率，因为胰蛋白酶通常在精氨酸残基的C端进行切割，但更重要的是在赖氨酸残基处切割。如果乳酸化确实影响胰蛋白酶活性，则可能导致肽段覆盖度降低。因此，可考虑选用其他类型的蛋白酶。在本实验方案中，已将“最大漏切位点数（Max. missed cleavages）”参数调高，以弥补这一局限性。最后，还应考虑样品制备与操作过程中的因素，例如佩戴手套以避免皮肤角蛋白对样品造成污染，以及翻译后修饰的稳定性问题，因为PTM的 turnover 是一个动态且有时快速的过程6。

与导致低丰度翻译后修饰（如乳酸化）检测率较低的广谱质谱（MS）方法不同，基于质谱的蛋白质组学通过富集KL-LA肽段可实现对翻译后修饰位点的详细分析，例如鉴定新发现的乳酸化位点及乳酸化蛋白19。Western blot可提供细胞中乳酸化修饰的整体模式信息，但无法揭示特定蛋白的乳酸化情况。因此，免疫沉淀（IP）是常用于验证质谱检测到的翻译后修饰的常规方法20。邻近连接实验（PLA）是另一种可用于验证蛋白质组学鉴定出的潜在靶标蛋白乳酸化的技术21。该技术还可提示修饰蛋白的亚细胞定位，但特异性相对较低。采用针对乳酸化的特异性免疫沉淀方法适用于广泛的翻译后修饰筛选，但根据具体的研究问题，进行特定蛋白的免疫沉淀也可能具有重要意义。

在定量总蛋白提取物中特定乳酸化蛋白的比例时，仅进行免疫沉淀（IP）是不够的。虽然使用KL-LA磁珠进行IP能够富集乳酸化蛋白，但由于其仅限于富集目标蛋白，无法准确量化乳酸化比例。因此，需要借助质谱分析，以获得更详细的分析结果，实现对乳酸化程度的精确定量。因此，可先利用针对目标蛋白的抗体对该潜在乳酸化蛋白进行免疫沉淀，再结合质谱分析，从而确定总蛋白样品中乳酸化蛋白所占的百分比；而免疫沉淀本身也是一种有效的方法，可用于验证质谱鉴定出的乳酸化蛋白是否确实发生了乳酸化修饰。

在使用非偶联抗体的免疫沉淀（IP）实验中，优化磁珠与抗体的比例对于有效捕获乳酸化蛋白至关重要。实际上，这两者之间的平衡直接影响免疫沉淀的特异性和效率。抗体过量可能导致非特异性结合，从而增加背景噪音并降低检测的整体准确性；而抗体不足则会导致目标蛋白富集效率低下，造成信号减弱和灵敏度下降。这些技术因素对于获得乳酸化蛋白研究中可靠且精确的结果至关重要。

总之，该方案可用于监测稳态失调（如癌症8,10）后乳酸化谱的变化，这些变化可能影响药物反应。该方法甚至可用于生物标志物的鉴定。由于适用于多种细胞系、组织类型以及患者活检样本，该技术有望加深对疾病或正常状态下由翻译后修饰驱动的细胞信号通路的理解。

致谢

我们衷心感谢Giroux实验室所有成员参与科学讨论。感谢舍布鲁克大学医学院和健康科学学院蛋白质组学与质谱平台提供的服务与指导。VG获得加拿大自然科学与工程研究理事会（RJPIN-2019-06185）和加拿大卫生研究院（178171）的资助。VG现任加拿大胃肠道干细胞生物学二级研究主席。MH获得舍布鲁克大学消化系统炎症与肿瘤研究中心、舍布鲁克大学-德塞夫基金会、舍布鲁克大学健康研究中心（CRCHUS）、胃肠病学与肝脏病学新一代研究人员培训计划（TRIANGLE）以及FRQ的奖学金支持。FMB为魁北克健康研究基金会（FRQS）杰出学者（366044）。VG和FMB均为由FRQS资助的"舍布鲁克市立医院研究中心"成员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 uL Zip Tip C18 Pierce87784
Acclaim PepMap100 C18Dionex Corporation1649460,3mm 内径 × 5mm
乙腈（质谱级）FisherA955-4
碳酸氢铵Sigma-AldrichA6141-500
抗HNRNPA1单克隆抗体Novus Biologicals NB100-672
抗L-乳酰赖氨酸（KL-La）单克隆抗体PTM-BioPTM1401RM
抗小鼠IgG HRP标记抗体CST7076S
抗兔IgG HRP标记抗体CST7074S
Azure 280BiosystemsAZI280-01
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher ScientificP123227
牛血清白蛋白（BSA）Wisent800-095-EG
Captive Spray nanoESI电离源Bruker Daltonics
氯乙酰胺Sigma-AldrichC0267
Clarity Max Western ECL显影底物Bio-Rad1705062
二硫苏糖醇（DTT）Thermo Fisher ScientificR0861
免疫沉淀用Dynabeads Protein G磁珠Thermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-AldrichE9884
甲酸（FA；质谱级）Thermo Fisher ScientificA117-50
甘油Fisher ScientificBP229-1
HEPES（1M）Wisent330-050-EL
Hypersep C18 100mg柱Fisher60108-302
KL-LA琼脂糖偶联磁珠PTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X（SDS，溴酚蓝）Wisent, J.T.Baker800-100-CG, D293-01
低吸附微量离心管 0.5 mLSarstedt72.704.600
低吸附微量离心管 1.5 mLThermo Fisher ScientificP190410
微量离心管 1.7 mLAxygenMCT-175-C
NanoElute高效液相色谱系统Bruker Daltonics1.9 µm粒径，75 µm内径 × 25 cm
正常兔IgG多克隆抗体Millipore Sigma12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
磷酸盐缓冲液（PBS）Wisent311-425-CL
PMSFThermo Fisher Scientific36978
蛋白酶抑制剂混合物（PIC）Sigma-AldrichP8340-5
Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G磁性微珠Thermo Fisher Scientific09-981-920
氯化钠Sigma-AldrichS9888-500
氟化钠Sigma-AldrichS1504
正钒酸钠Sigma-AldrichS6508
TimsTOF pro质谱仪 Bruker Daltonics
三氟乙酸（TFA）Thermo Fisher ScientificA116-50
Tris-HClWisent600-125-IK
吐温X-100Sigma-AldrichX100
胰蛋白酶（质谱级）Pierce90058
尿素Thermo Fisher ScientificU15-500
Vaccufuge plusEppendorf22820168
水（质谱级）VWR10803-890A
β-甘油磷酸Sigma-AldrichG5422
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148

参考文献

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