使用荧光染料标记干细胞以实现光学成像的无创检测

摘要

本视频展示了使用荧光染料标记人类胚胎干细胞和间充质干细胞的技术。该技术可用于通过光学成像对移植的干细胞进行体内示踪，并通过荧光显微镜进行组织病理学相关性分析。

摘要

光学成像（OI）是一种简便、快速且经济的工具，可用于体内监测基于干细胞的新疗法。该技术基于将干细胞在体外用荧光染料标记，随后通过静脉注射标记细胞，并可视化其在特定靶器官或病变部位的聚集情况。本文技术展示我们如何通过简单孵育脂溶性荧光染料DiD（C67H103ClN2O3S）标记人源间充质干细胞（hMSC），以及如何使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的荧光染料吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）标记人源胚胎干细胞（hESC）。染料的摄取机制是通过脂溶性染料在磷脂双分子细胞膜上的黏附与扩散实现。通常情况下，与含血清培养基中孵育相比，在无血清培养基中孵育细胞可提高标记效率。此外，添加转染试剂硫酸鱼精蛋白（Protamine Sulfate）可显著增强对比剂的摄取。

方案

使用荧光染料 DiD 标记间充质干细胞

1. 开始标记间充质干细胞的操作时，先用胰酶消化并计数细胞，以获得具有确定细胞数量的细胞悬液。
2. 将细胞从培养箱中取出，吸弃含有待标记细胞的培养瓶中的旧培养基。
3. 用10 ml不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS洗涤细胞，随后吸弃PBS。Mg²⁺和Ca²⁺会抑制胰酶活性，因此需使用不含这两种离子的PBS。
4. 加入预热的0.05%胰酶溶液，对于T75培养瓶使用5 ml，确保胰酶完全覆盖瓶内表面。
5. 将培养瓶置于37°C培养箱中孵育约5分钟。
6. 在显微镜下确认细胞是否已脱落。若细胞仍贴壁，可轻敲培养瓶数次，并继续孵育更长时间，直至胰酶消化完成。
7. 此时需加入含10%胎牛血清（FCS）的培养基以中和胰酶活性。加入的培养基体积应与所用胰酶体积相等。
8. 轻轻吹打数次，确保所有细胞重新悬浮于培养基中。
9. 将细胞悬液转移至无菌的15 ml带盖聚丙烯离心管中。
10. 以400 rcf离心5分钟。
11. 小心吸弃上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
12. 用DMEM重悬细胞，并进行细胞计数。
13. 将待标记的细胞以每毫升1×10⁶个细胞的密度悬浮于无血清培养基（DMEM）中。
14. 以上为细胞悬液的全部制备步骤，现在可开始标记过程。
15. 首先，每毫升细胞悬液中加入5 µL DiD对比剂。
16. 然后通过轻柔吹打混匀溶液。
17. 将细胞与标记液在37°C条件下于6孔低吸附培养板中孵育20分钟。
18. 简单孵育完成后，需将细胞悬液转移至15 ml带盖聚丙烯离心管中。
19. 以400 rcf离心5分钟。
20. 吸弃标记液，注意不要扰动细胞沉淀。
21. 用PBS洗涤细胞，吹打混匀，确保充分打散细胞沉淀。
22. 重复上述最后两步操作两次，共完成3次洗涤。
23. 对细胞进行计数，并进行台盼蓝染色检测以评估细胞活力。这些为常规细胞培养操作，此处不再详述。
24. 您的细胞现已准备好用于光学成像仪成像。

使用荧光染料ICG标记人类胚胎干细胞

1. 开始标记人类胚胎干细胞的实验操作前，准备造影剂吲哚菁绿（Indocyanine Green），将其与转染试剂鱼精蛋白（Protamine）混合。
2. 称取1 mg吲哚菁绿（Indocyanine Green）粉末。将ICG粉末溶于100 µL二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）中。
3. 加入400 µL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM + 10%胎牛血清），充分混匀。此步骤终浓度为2 mg/mL的吲哚菁绿。
4. 加入转染试剂鱼精蛋白。鱼精蛋白可作为对比剂的载体，使其更高效地进入细胞。
5. 将5 µL浓度为10 mg/mL的硫酸鱼精蛋白与300 µL ICG及300 µL无血清DMEM培养基混合。
6. 轻轻摇动新的转染溶液5分钟，以使复合物形成。
7. 标记溶液已配制完成。
8. 吸出hESC 10 mm培养皿中的旧培养基。
9. 加入5 ml预热的无血清DMEM。
10. 将先前配制的鱼精蛋白/ICG溶液加入细胞中。将培养皿置于37°C培养箱中，开始1小时的孵育。
11. 孵育完成后，从培养箱中取出培养皿，并吸除标记液。
12. 用 5 ml PBS 冲洗培养皿以洗涤细胞。
13. 吸除 PBS，加入 5 ml 0.25% 胰蛋白酶。将培养皿置于 37°C 培养 5 分钟，以完成消化。期间可轻轻晃动培养皿，有助于消化过程。
14. 轻轻吹打，以分散残留的菌落。
15. 通过向培养皿中加入等量的KSR来中和胰蛋白酶。
16. 将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在400 rcf下离心5分钟。
17. 用完全培养基重悬细胞。
18. 如果此时仍然存在团块， 胰酶消化后再次离心。
19. 一旦一个 获得无团块的细胞悬液后，吸除旧培养基，将细胞沉淀重悬于10 ml预热的完全ESC培养基中。
20. 此时，需要将小鼠饲养层细胞与人胚胎干细胞（hESCs）分离，以确保后续成像仅针对干细胞。
21. 将细胞溶液转移至经明胶包被的10 cm培养皿中。
22. 将培养皿放入37°C培养箱中，静置45分钟。 在此期间，请勿扰动培养皿。  现在，饲养层细胞会贴附于培养皿，而干细胞则不会。
23. 将溶液从培养皿中转移出来，现在我们得到了标记的人类胚胎干细胞单细胞溶液。
24. 现在可以对细胞进行计数，并进行台盼蓝染色检测。
25. 该 细胞已准备好进行成像！

 

讨论

光学成像（OI）是一种相对较新的成像技术，基于荧光信号的检测。OI 的灵敏度与放射性示踪剂成像技术相当，但不会带来任何辐射暴露风险。OI 提供了一种有效的方法，可对细胞进行无创且重复的追踪，从而深入了解细胞向靶部位的迁移过程。该技术的一个主要局限性在于荧光探针在体内的组织穿透深度有限。因此，位于皮肤表面以下约 5–10 cm 以上的深层组织中的示踪剂积聚可能无法被检测到。目前的临床应用仅限于浅表成像技术，如内窥镜成像、心血管成像和视网膜成像（Funovics 等，2003），但随着对活体细胞追踪所带来广阔前景的认识不断加深，这一研究领域将持续拓展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
吲哚菁绿（IR-125）	试剂	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	试剂	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM高糖	试剂	Sigma-Aldrich	D5648
明胶	试剂	Sigma-Aldrich	G1890	用 PBS 稀释至终浓度为 0.1%
PBS，不含 Mg 和 Ca	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	14190-144
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	Invitrogen	25300-120
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	Invitrogen	25200-114
FCS，其特征为	试剂	Hyclone	SH30071.03
细胞滤网（40 μm 尼龙	试剂	BD 生物科学	352340
DiD	试剂	分子探针，Life Technologies	V-22887
敲除DMEM	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	10829018
无血清替代物	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	10828028
β-巯基乙醇–乙醇	试剂	Sigma-Aldrich	7522
非必需氨基酸	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	11140050
FGF-2	试剂	R&D Systems	233-FB-025
谷氨酰胺 200 mM	试剂	GIBCO，隶属于 Life Technologies	25030081
青霉素/链霉素	试剂	GIBCO，Life Technologies 公司	15140-122
硫酸鱼精蛋白	试剂	美国制药合作伙伴公司