本视频展示了使用荧光染料标记人类胚胎干细胞和间充质干细胞的技术。该技术可用于通过光学成像对移植的干细胞进行体内示踪，并通过荧光显微镜进行组织病理学相关性分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
光学成像（OI）是一种简便、快速且经济的工具，可用于体内监测基于干细胞的新疗法。该技术基于将干细胞在体外用荧光染料标记，随后通过静脉注射标记细胞，并可视化其在特定靶器官或病变部位的聚集情况。本文技术展示我们如何通过简单孵育脂溶性荧光染料DiD（C67H103ClN2O3S）标记人源间充质干细胞（hMSC），以及如何使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的荧光染料吲哚菁绿（Indocyanine Green, ICG）标记人源胚胎干细胞（hESC）。染料的摄取机制是通过脂溶性染料在磷脂双分子细胞膜上的黏附与扩散实现。通常情况下，与含血清培养基中孵育相比，在无血清培养基中孵育细胞可提高标记效率。此外，添加转染试剂硫酸鱼精蛋白（Protamine Sulfate）可显著增强对比剂的摄取。
方案
使用荧光染料 DiD 标记间充质干细胞
- 开始标记间充质干细胞的操作时，先用胰酶消化并计数细胞，以获得具有确定细胞数量的细胞悬液。
- 将细胞从培养箱中取出，吸弃含有待标记细胞的培养瓶中的旧培养基。
- 用10 ml不含Mg²⁺和Ca²⁺的PBS洗涤细胞，随后吸弃PBS。Mg²⁺和Ca²⁺会抑制胰酶活性，因此需使用不含这两种离子的PBS。
- 加入预热的0.05%胰酶溶液，对于T75培养瓶使用5 ml，确保胰酶完全覆盖瓶内表面。
- 将培养瓶置于37°C培养箱中孵育约5分钟。
- 在显微镜下确认细胞是否已脱落。若细胞仍贴壁，可轻敲培养瓶数次，并继续孵育更长时间，直至胰酶消化完成。
- 此时需加入含10%胎牛血清（FCS）的培养基以中和胰酶活性。加入的培养基体积应与所用胰酶体积相等。
- 轻轻吹打数次，确保所有细胞重新悬浮于培养基中。
- 将细胞悬液转移至无菌的15 ml带盖聚丙烯离心管中。
- 以400 rcf离心5分钟。
- 小心吸弃上清液，注意不要扰动管底的细胞沉淀。
- 用DMEM重悬细胞，并进行细胞计数。
- 将待标记的细胞以每毫升1×10⁶个细胞的密度悬浮于无血清培养基（DMEM）中。
- 以上为细胞悬液的全部制备步骤，现在可开始标记过程。
- 首先，每毫升细胞悬液中加入5 µL DiD对比剂。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
光学成像（OI）是一种相对较新的成像技术，基于荧光信号的检测。OI 的灵敏度与放射性示踪剂成像技术相当，但不会带来任何辐射暴露风险。OI 提供了一种有效的方法，可对细胞进行无创且重复的追踪，从而深入了解细胞向靶部位的迁移过程。该技术的一个主要局限性在于荧光探针在体内的组织穿透深度有限。因此，位于皮肤表面以下约 5–10 cm 以上的深层组织中的示踪剂积聚可能无法被检测到。目前的临床应用仅限于浅表成像技术，如内窥镜成像、心血管成像和视网膜成像（Funovics 等，2003），但随着对活体细胞追踪所带来广阔前景的认识不断加深，这一研究领域将持续拓展。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本项目获得了加州再生医学研究所Leon J. Thal种子基金的资助。Tobias Henning获得了德国研究基金会（DFG，HE 4578/1-2）的研究奖学金支持。我们衷心感谢Juanito Meneses在人类胚胎干细胞培养方面提供的建议。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 吲哚菁绿（IR-125） | 试剂 | Fisher Scientific | AC41254-1000 | |
| DMSO | 试剂 | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| D-MEM高糖 | 试剂 | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| 明胶 | 试剂 | Sigma-Aldrich | G1890 | 用 PBS 稀释至终浓度为 0.1% |
| PBS，不含 Mg 和 Ca | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | Invitrogen | 25300-120 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | 试剂 | Invitrogen | 25200-114 | |
| FCS，其特征为 | 试剂 | Hyclone | SH30071.03 | |
| 细胞滤网（40 μm 尼龙 | 试剂 | BD 生物科学 | 352340 | |
| DiD | 试剂 | 分子探针，Life Technologies | V-22887 | |
| 敲除DMEM | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10829018 | |
| 无血清替代物 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 10828028 | |
| β-巯基乙醇–乙醇 | 试剂 | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| 非必需氨基酸 | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | 试剂 | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| 谷氨酰胺 200 mM | 试剂 | GIBCO，隶属于 Life Technologies | 25030081 | |
| 青霉素/链霉素 | 试剂 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 15140-122 | |
| 硫酸鱼精蛋白 | 试剂 | 美国制药合作伙伴公司 |
参考文献
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
- Simon, G. H., Daldrup-Link, H. ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
