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方法文章

建立辣椒蓟马（Scirtothrips dorsalis Hood）人工饲养系统用于昆虫病原真菌毒力筛选

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DOI：

10.3791/68600

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2025年7月18日

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

本文内容

摘要

建立了一种用于大规模饲养辣椒蓟马的离体叶片生物测定方案，该方法采用含琼脂玻璃容器中的改良离体叶片法，可确保高存活率和发育同步化。该系统能够高效筛选昆虫病原真菌对2nd龄幼虫的毒力，并为实验室、温室及田间评价提供稳定的蓟马种源。

摘要

辣椒蓟马（Scirtothrips dorsalis Hood）是中国台湾观赏植物和农作物的重要经济害虫。昆虫病原真菌（EPF）可作为环境友好的生物防治剂用于控制蓟马。在田间应用前，筛选EPF菌株对辣椒蓟马的毒力至关重要。然而，由于目前关于辣椒蓟马饲养方法的数据有限，大规模实验室筛选面临挑战。为解决这一问题，我们建立了一种改良的实验室饲养方法，用于大量繁殖S. dorsalis。

该方法采用一种使用含琼脂玻璃容器的离体叶片饲养系统，适用于评估球孢白僵菌对辣椒蓟马的防治效果。这种优化的离体叶片生物测定系统可用于评估球孢白僵菌（EPF）对辣椒蓟马的杀虫效力。该系统能够大量产生处于相同发育阶段的蓟马，适用于毒力筛选。试验结果表明，在接种后7天（d.p.i.），Cordyceps cateniannulata（Cc-NCHU-213）菌株对辣椒蓟马2龄幼虫表现出最高的毒力（53.6%）。此外，嵌入琼脂的叶片 圆片在7天以上仍保持新鲜，使蓟马在整个观察期间得以存活（对照组处理存活率达90%），表明该饲养系统的稳定性。本实验方案展示了一种稳定的饲养系统，可用于大规模繁殖以及评估EPF菌株对辣椒蓟马的毒力，且可能适用于其他种类蓟马，有助于筛选潜在的EPF菌株，以用于田间蓟马的防控。

引言

辣椒蓟马（Scirtothrips dorsalis Hood；缨翅目：蓟马科）是一种多食性害虫，可危害超过40个植物科中的100多种植物，包括蔬菜、观赏植物和果树作物1。该虫原产于热带和亚热带的亚洲-东南亚地区，包括印度、日本和中国台湾2。据我们所知，辣椒蓟马在中国台湾是危害芒果、茶、蓝莓和莲等农业及观赏作物的重要害虫。在过去二十年中，由于全球化的加剧和农业贸易的开放，辣椒蓟马已在多个国家成为具有重大经济影响的害虫。此外，其强大的繁殖能力和对新入侵地区的高度适应性也促进了该害虫的扩散1,3。

辣椒蓟马主要取食嫩叶、嫩梢、花瓣和未成熟果实，导致组织坏死甚至死亡3。此外，它们还可传播多种植物病害，包括花生芽坏死病毒（GBNV）、花生黄化斑驳病毒（GCFSV）、花生黄斑病毒（GYSV）4以及烟草条斑病毒（TSV）5。因此，辣椒蓟马的取食活动会显著降低受害作物的产量和经济价值。对辣椒蓟马的有效防控依赖于综合害虫管理策略，该策略结合了农业、生物和化学防治手段1。在中国台湾，有机种植者通常使用非化学物质，如窄谱油和印楝油，或采用生物防治方法，包括释放捕食性螨类和小花蝽（根据个人观察）。然而，根据农户反馈，在开花和结果期施用这些油剂可能干扰授粉过程并损害花粉，从而导致产量和经济价值下降。因此，开发针对辣椒蓟马的有效替代防控措施对有机种植者至关重要。

昆虫病原真菌（EPF）是一类能够杀死昆虫的真菌，已被证明是一种有效且可持续的害虫管理技术6,7,8。多项研究已证实EPF对辣椒蓟马具有良好的防治效果。商品化的EPF菌株Beauveria bassiana GHA（BotaniGard_ES）和Metarhizium brunneum F52（Met-52 EC）在玫瑰植株上对辣椒蓟马表现出显著的防控作用 9,10。在辣椒植株上，Cordyceps javanica（= Isaria fumosorosea）也可有效降低辣椒蓟马 的种群数量11。其他EPF菌种，如Lecanicillium lecanii和Purpureocillium lilacinum，已在包括辣椒和茶树在内的不同作物上对辣椒蓟马进行过测试，并显示出对该害虫的有效控制能力12,13。

一些先前研究在评估杀虫真菌（EPFs）对温室或田间蓟马的防治效果时，未事先筛选最有效的EPF菌种/菌株，从而限制了其防治效果。对EPFs进行细致筛选可显著提升害虫管理效能。许多研究在笼内利用完整植株饲养蓟马以开展生物测定实验11,14。尽管完整植株饲养系统为蓟马提供了更接近自然的环境，但在管理不同发育阶段时存在挑战，因为蓟马在各发育阶段表现出明显不同的行为。这种变异性可能使针对特定实验目的选择目标阶段变得复杂。此外，完整植株饲养系统中的土壤条件可能影响辣椒蓟马的化蛹与羽化过程，从而减少可用于后续生物测定的个体数量15，限制了进一步实验的资源供给。同时，整株植物饲养系统需要更大的空间，并需持续照料植物，因为受胁迫的植物可能改变蓟马的行为，且该系统通常更耗时耗资源。目前关于利用非活体植物材料（如离体植物组织或人工饲料）建立蓟马饲养系统用于实验室生物测定的报道较少，且这些方法的细节往往不明确或被省略12,16。

本研究旨在建立一种简单、经济且可持续的实验室条件下辣椒蓟马大规模饲养体系。在本方案中，对叶片圆片饲养法7进行了改良，以提供一种更高效且可控的蓟马大规模饲养方法，通过严格控制环境条件，可精确选择用于生物测定的发育阶段。此外，还建立了一套稳定且可重复的生物测定系统，用于评估昆虫病原真菌（EPF）菌株的毒力，指标包括50%致死时间（LT50）和50%中位致死浓度（LC50），分别指在特定剂量下导致50%辣椒蓟马死亡所需的估计时间，以及真菌悬浮液引起50%死亡率所需的浓度。通过应用该方法，可准确鉴定野外采集的蓟马，并维持稳定的实验室种群，从而利用更简便且可重复性更高的方法测试不同真菌菌株的防治效果。

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方案

注意：完整的实验流程图见图1。

1. 辣椒蓟马田间采集与种群维持

  1. 采集辣椒蓟马
    1. 在受感染的蓝莓农场中，目视检查蓝莓植株叶片的正反面以及花朵内部是否存在辣椒蓟马的侵染。
    2. 记录每个样本的详细信息（例如植物部位和虫害严重程度），并向农民确认生产方式，如常规种植或有机种植，包括是否使用矿物油和天敌生物防治。
    3. 剪下受辣椒蓟马侵害的叶片和花朵，转移至塑料拉链袋中材料表），然后封好拉链袋并保留一些空气，以保持蓟马存活。在3小时内将样品带回实验室。
      注意：当野外采集时间超过3小时时，需将样品放入冷藏箱中。
    4. 准备一个玻璃培养容器（高35 mm，内径45 mm），在容器底部放置三层圆形滤纸（直径40 mm），然后加入8–10滴（400–500 µL）过滤水图1 和 材料表).
    5. 从芒果园中采集一片幼嫩的红色芒果叶（图1）。用清水清洗叶片，并在光学显微镜下检查材料清单在准备玻璃饲养容器前，检查昆虫卵或其他昆虫污染情况。使用皮革打孔器切割芒果叶。材料表) 制成一个圆形薄片（40 mm），并将其置于湿润的纸巾上。
      注意：与仅季节性生长的蓝莓嫩叶相比，芒果叶是喂养蓟马更稳定的资源。
    6. 在10倍放大倍数的光学显微镜下观察辣椒蓟马，使用细毛笔转移10头成虫（五只雄性和五只雌性）材料表) 加入玻璃培养容器中。
    7. 用两层帕拉菲姆膜（parafilm）密封每个玻璃培养容器（材料清单）并使用#00昆虫针扎约40个小孔以供通风（材料表).
    8. 将玻璃培养容器置于25 ± 1 °C、相对湿度约70%的培养箱中，光照周期为明暗交替（L:D）= 12 h : 12 h材料表).
    9. 48小时后用毛笔移除成虫。
      注意：根据我们的观察，雌性蓟马在转移到玻璃饲养容器后约 2 天开始产卵。
    10. 在体视显微镜下观察产卵的叶片组织，以进一步确认产卵情况图1 和 材料表将一片新鲜的芒果叶片置于带有卵的叶片上，并在滤纸条上滴加8–10滴过滤水以维持湿度。
  2. 维持辣椒蓟马种群
    注意：卵孵化成1st 约5-7天后的龄期幼虫。
    1. 直接转移含有1的叶片st 将龄期幼虫转移至新的玻璃饲养容器中。
      注意：使用画笔轻轻转移 1st 将龄期幼虫转移至新的玻璃饲养容器中，避免芒果叶上腐烂及意外真菌生长造成的污染。根据我们的观察，一只成年雌虫平均每天产卵6枚。
    2. 每日观察辣椒蓟马的活动情况。每隔4天，在纸巾上添加8-10滴过滤水。每隔4天在容器内更换一片新鲜的芒果叶片圆片，更换时间应在老叶片干枯之前。
      注意：1st 三龄幼虫在约7至10天内羽化为成虫，具体时间取决于温度和湿度等环境因素。
    3. 每日观察辣椒蓟马种群，直至蓟马发育为成虫，并重复步骤1.1.4的操作，以进行长期种群维持。
  3. 大规模饲养辣椒蓟马
    1. 从维持的种群中采集雌性成虫，并根据上述步骤准备玻璃饲养容器。
    2. 将10只雌性成虫转移至容器中，并按照步骤1.1.4至1.1.10的操作步骤获取带有卵的叶片。
      注意：一只成年雌性平均每天产卵6枚。
    3. 轻柔转移约120 1st 使用毛笔将龄期幼虫转移至新的玻璃饲养容器中。
    4. 每日观察辣椒蓟马的活动情况。每隔4天，在纸巾上添加8-10滴过滤水。每隔4天在容器中更换一次新鲜的芒果叶片圆片，确保在旧叶干枯前完成更换。
    5. 收集1st 孵化后5-7天的龄期幼虫；收集2nd 7-10天后收集龄期幼虫；约14天后收集成虫用于生物测定（图2).
      注意：观察辣椒蓟马不同发育阶段的形态特征，以区分其各虫期，用于后续实验图2).

2. 辣椒蓟马的分子鉴定

注意：从田间采集的蓟马必须通过线粒体细胞色素氧化酶I（COI）基因片段进行分子鉴定，以确定其物种分类，该基因是辣椒蓟马常用的鉴定标记17,18。

  1. 提取辣椒蓟马基因组DNA
    1. 取一只成虫辣椒蓟马置于1.5 mL离心管中（材料表）。
    2. 使用研磨杵匀浆辣椒蓟马，然后根据试剂盒说明书，使用商品化试剂盒提取基因组DNA（材料表）。
  2. PCR扩增与DNA测序
    1. 使用PCR Master Mix（2×）和COI引物对（正向引物LCO 1490和反向引物HCO 2198）扩增目标辣椒蓟马DNA片段，该引物对可扩增线粒体COI基因的部分序列（材料表）。
      1. 配制20 µL PCR反应体系，包含2 µL蓟马基因组DNA模板、正向和反向引物各1 µL、2× PCR Master Mix 10 µL以及ddH2O 6 µL（材料表）。
      2. 使用PCR仪进行扩增，反应程序如下：94 °C预变性2 min，随后进行35个循环（94 °C变性30 s、52 °C退火1 min、72 °C延伸1 min），最后72 °C终延伸10 min（材料表）。
    2. 通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，以验证扩增结果（图3）。
    3. 切下目标条带（预期扩增片段大小为658 bp），并根据说明书使用凝胶/PCR产物纯化试剂盒纯化辣椒蓟马的COI PCR扩增产物。将纯化后的产物送至商业测序服务机构进行测序（材料表）。
  3. 序列分析
    1. 使用指定软件评估测序序列质量（材料表）。
    2. 打开FASTA或TXT文件，手动删除5′端和3′端低质量的碱基序列。
    3. 在NCBI数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中使用默认参数进行BLAST比对，以确认物种身份。

3. 昆虫病原真菌的制备

注意：本研究中使用的EPF菌株列于表1中。

  1. 从真菌资源库中复苏真菌分离株
    1. 从-80 °C冰箱中取出保存的真菌分生孢子储备液（分生孢子悬浮于30%甘油中），并解冻。
    2. 在超净工作台中，使用细胞涂布器将约10 µL的分生孢子悬浮液转移至直径5.5 cm的1/4 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板上，并均匀涂布。该培养基的制备方法为：将0.75 g沙氏葡萄糖肉汤和1.5 g琼脂溶于100 mL双蒸水（ddH2O）中（材料表）。
    3. 用封口膜密封培养皿（材料表），并将平板置于25 °C黑暗培养箱中培养10–14天。
    4. 取活跃生长的真菌菌丝，划线接种至新的1/4 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）平板进行继代培养。将真菌置于25 °C黑暗条件下培养10–14天，以促进分生孢子发育，之后进行收获。
      注：后续生物测定建议使用约10天龄的真菌培养物。不建议使用超过14天的培养物进行毒力测试，因其分生孢子活力可能下降。
  2. 分生孢子悬浮液的制备
    1. 向培养10–14天的1/4 SDA真菌培养物表面加入2–3 mL 0.03% Tween 80，用无菌接种环轻轻刮取分生孢子（材料表）。
    2. 将真菌悬浮液转移至洁净的15 mL离心管中。
    3. 在最大转速下涡旋振荡使悬浮液充分均质化，随后经滤纸过滤以去除菌丝碎片，获得纯化的分生孢子悬浮液。
    4. 使用 血细胞计数板（材料表）在光学显微镜下计数分生孢子数量，并将悬浮液稀释至108 个分生孢子/mL。
    5. 将分生孢子悬浮液转移至经紫外光灭菌的微型喷雾器中，用于后续生物测定。
      注：每次转移前需充分涡旋振荡分生孢子悬浮液，防止沉降。使用前应在超净工作台内将微型喷雾器暴露于紫外线下照射30分钟以完成灭菌。

4. 针对辣椒蓟马的毒力筛选

  1. 2的制备nd 龄幼虫
    1. 收集2nd 按照步骤1.3.1-1.3.5处理龄期幼虫，以用于后续实验。
      注意：区分这两个nd 二龄幼虫通过其黄色体色和较宽的腹部与一龄幼虫相区分（图2).
  2. 接种容器的准备
    注意：根据目标作物选择叶片种类。本研究中，从受侵染的蓝莓‘Biloxi’田间采集了辣椒蓟马V. corymbosum L. × V. darrowii 因此，针对烟蓟马的EPF生物测定将在蓝莓叶片上进行。
    1. 从蓝莓种植园采集幼嫩的蓝莓叶片，并清洗叶片以去除表面灰尘及可能存在的节肢动物。
    2. 将叶片风干或用纸巾擦去水分；然后在体视显微镜下检查蓝莓叶片表面是否存在其他节肢动物或卵。若存在节肢动物，需将其移除。
    3. 使用皮革打孔器切割一个直径为2.8 cm的叶片圆片（材料表），用1%次氯酸钠溶液对叶片进行表面消毒，并用无菌水冲洗2次，以去除叶片上残留的次氯酸钠。
      注意：在琼脂凝固前准备好叶盘，以确保叶盘能正确嵌入水琼脂中。
    4. 将2.5%的水琼脂溶液（每100 mL ddH₂O中含2.5 g琼脂）进行高压灭菌2O）进行灭菌。
    5. 在超净工作台内，于琼脂凝固前，将3 mL 2.5%水琼脂倒入小型玻璃容器（高35 mm，内径30 mm）中。待琼脂冷却至约40 °C，达到半固态。
    6. 将叶圆片（近轴面朝上）轻轻放置于琼脂表面，使其略微嵌入琼脂，仅露出极少部分。待水琼脂完全凝固后，玻璃容器即可用于生物测定实验。
  3. EPF 接种与观察
    1. 使用前将分生孢子悬浮液充分涡旋振荡。用微量喷雾器，从玻璃容器内约10 cm的距离处，将0.1 mL该悬浮液（步骤3.2.4制备）均匀喷洒于每片叶盘表面。
      注意：实验前请先测试喷雾区域。确保喷雾均匀地在整片叶盘上形成一层薄膜。若叶片上出现水滴积聚形成积水，应减少接种量以避免过度湿润。
    2. 在无菌条件下（例如，在超净工作台中），将分生孢子悬液在叶片上风干30分钟。
    3. 转移 10 中的 2nd 用细毛刷将龄期幼虫转移至每个容器中，并用两层封口膜密封玻璃培养容器。
    4. 使用#00昆虫针制作约30个小孔（材料表用于通风。
    5. 将容器接种后置于25 ± °C、相对湿度约70%、光照周期为L:D = 12 h:12 h的培养箱中培养。
    6. 在立体显微镜下以10倍放大倍数每日观察并记录辣椒蓟马在7天内的死亡率。
    7. 将死亡的幼虫保留在玻璃容器中，用于观察真菌感染情况，以确认杀虫真菌（EPF）感染。

5. 所选虫生真菌分离株的生物测定

注意：可选择毒力最强的EPF分离株，或选择多个高毒力的分离株，用于对辣椒蓟马进行剂量依赖性生物测定。采用三种不同的分生孢子浓度（范围从106 到108 个分生孢子/mL），以评估剂量与致病性之间的关系。

  1. 分生孢子悬液的制备
    1. 按照步骤 3.1 回收所选的 EPF 分离株。
    2. 制备三种浓度的分生孢子悬液（106, 107，和108 孢子/mL），具体操作见步骤 3.2。
  2. 2的制备nd 龄幼虫
    1. 按照步骤4.1收集二龄幼虫，以获得新羽化的成虫。
  3. 接种容器的准备
    1. 按照步骤4.2准备接种容器，其中含有嵌入水琼脂中的蓝莓叶片圆片。
  4. EPF 接种与观察
    1. 按照步骤4.3所述，用三种浓度的分生孢子悬浮液进行EPF接种。

6. 统计分析

  1. 死亡率的计算
    1. 在进行单因素方差分析（ANOVA）以评估不同真菌处理间差异之前，先对每种真菌菌株的死亡率数据进行反正弦转换（显著性水平设定为 p < 0.05）。
    2. 采用Tukey诚实显著性差异（HSD）检验对处理均值进行事后比较。
  2. 半数致死时间（LT50）和半数致死浓度（LC50）的计算
    1. 使用Probit回归分析计算半数致死时间（LT50）和半数致死浓度（LC50）的数值。
    2. 在软件界面中创建并填写名为 "total"、"response" 和 "duration"（用于LT50）或 "concentration"（用于LC50）的变量，填入观测数据。
      注：若在观察期间内累积死亡率未超过50%，则无法可靠估计LT50 和/或LC50 的值。
    3. 通过导航至 Analyze | Regression | Probit 执行Probit分析。将 "total" 设为测试昆虫的总数，"response" 设为死亡昆虫的数量，"duration" 或 "concentration" 设为协变量。点击 Options，将 Significance level for use of heterogeneity factor 设置为 0.05，以设定异质性因子的显著性水平为0.05。

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结果

本研究展示的实验流程图表明，从田间采集开始，到筛选昆虫病原真菌（EPF）菌株的毒力，均可建立稳定的辣椒蓟马人工饲养体系（图1）。尽管形态学观察可将辣椒蓟马与其他花蓟马区分开来，但利用部分COI序列作为分子标记，包括PCR扩增片段大小和COI测序，可进一步确认田间采集的蓟马确为辣椒蓟马（图3）。离体叶片饲养系统可提供更可控的环境条件（如温度和湿度），并为蓟马繁殖后代提供充足的食物来源，从而确保饲养容器中辣椒蓟马种群的稳定。在毒力筛选生物测定中，对照处理组蓟马的存活率达到90%（图4），也表明该离体叶片饲养系统可用于多种蓟马及其偏好寄主植物的人工饲养。此外需注意，较大体型的蓟马种类可能需要更大的叶片圆片，以提供充足的食物资源，支持其完成特定的发育阶段。

在毒力筛选中，观察到不同昆...

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讨论

辣椒蓟马是一种全球性重要害虫，影响多种具有重要经济价值的作物，如玉米、花生、辣椒、大豆、草莓、甘薯和番茄1,11,19。目前的防控策略依赖于综合方法，包括农艺措施、生物防治因子和化学防治，其中涉及天敌、线虫和昆虫病原真菌（EPFs）的应用11,14,20,21。然而，大多数评估EPF效力的研究集中于温室或田间条件，导致高毒力菌株的筛选过程耗时且效率较低。此外，由于辣椒蓟马个体微小、具有强烈的接触趋向性（thigmotactic behavior）以及飞行能力，实验室饲养面临显著挑战，这增加了操作和 containment 的难度22。如前所述，在受控实...

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披露

作者声明本工作中不存在利益冲突。

致谢

我们特别感谢中国台湾台中市雾峰区Humi蓝莓农场的林焕珍先生，他提供了蓝莓植株。本研究由国家科学与技术委员会（NSTC）项目113-2313-B-005 -024 -MY3资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#00 昆虫针Entosphinx DMM0220英国制造
1.5 mL 离心管Corning incorporatedMCT-175-C美国制造
10 μL 接种环NEST Scientific718201美国制造
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007中国台湾制造
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01中国台湾制造
6 cm 培养皿Alpha Plus Scientific16021中国台湾制造
琼脂Bioman ScientificAGR001.1微生物学级
琼脂糖Bioman ScientificPB1200中国台湾制造
BioGreen Safe DNA 凝胶缓冲液Bioman ScientificSDB001T中国台湾制造
Easy DNA 高速提取组织试剂盒Fisher BiotecET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf（澳大利亚制造）
正向引物：LCO 1490Genomics PO-PR220919G6序列：5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’
GenepHlow 凝胶/PCR 试剂盒GeneaidDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
玻璃饲养容器 Sunshine Lab Equipment company尺寸：高 35 mm，内径 45 mm。可用任何类似尺寸的塑料或玻璃杯替代。
血细胞计数板Paul Marienfeld640030德国制造
培养箱HipointF740中国台湾制造
皮革打孔器Real Handmade Workshophttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp 热循环仪Thermo Fisher ScientificA37834美国制造
光学显微镜 Nikon Ci-L日本制造
画笔Tian Cheng brush company4716608400352可用细头水彩笔替代，相当于 0 号或 1 号圆头画笔。
纸巾may flowerBLS007-8中国台湾制造
Parafilm MBemisPM-996美国制造
研磨杵Bioman ScientificGT100R中国台湾制造
反向引物：HCO 2198Genomics PO-PR220919G6序列：5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’
沙氏葡萄糖肉汤HiMediaMH033-500G印度制造
体视显微镜SoptopSZN71中国台湾制造
TAE 缓冲液 50XBioman ScientificTAE501000中国台湾制造
吐温 80PanReac AppliChem142050.1661中国台湾制造
拉链袋wenchen plastic company1809000061尺寸：宽 12 cm，长 17 cm。（中国台湾制造）

参考文献

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