本方案描述了一种专为清醒小鼠脊髓超声刺激设计的超声换能器固定系统。该方法采用一种固定装置，可在确保超声换能器精确定位的同时，允许实验动物自由活动，而不会影响刺激的精确性。
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本文内容
摘要
摘要
聚焦超声（FUS）作为一种创新的非侵入性神经调控技术，已展现出在脊髓神经调控方面的重要潜力。然而，沿脊柱实现超声换能器的稳定固定仍面临显著的技术挑战。现有的固定方法通常需要长时间的动物麻醉，或存在粘附可靠性不足的问题。这些关键限制凸显了开发一种新型固定范式以确保操作稳定性与生理相容性的迫切需求。本实验方案介绍了一种用于清醒、自由活动小鼠脊髓刺激的创新性超声换能器固定系统。建立一种可靠的方法以实现超声换能器在椎体上的精确定位，是神经刺激实验的关键。该方法包含三个阶段：暴露T13椎体、精确磨除棘突以形成平面接触界面，以及使用义齿基托材料和粘合剂混合物将金属底座和准直器牢固粘接至椎体。该技术允许动物自由活动，实现自然的运动行为，同时确保各次实验间位置稳定且空间偏差最小，有助于在清醒动物模型中开展超声介导的脊髓干预研究。该方法特别适用于涉及脊髓损伤修复、血-脊髓屏障调控及慢性疼痛机制等需要行为学评估的研究。通过解决清醒动物神经调控研究中的一项关键技术难题，本方案提供了一种无运动限制的稳定换能器-脊柱界面，为获得更准确、可靠的实验结果奠定了基础。
引言
脊髓是整合中枢神经系统与周围神经系统信息的关键枢纽，在疼痛信号转导、运动神经网络重建以及神经可塑性调控等临床研究领域具有重要价值。聚焦超声（FUS）作为一种新兴的无创神经调控技术，已成为脊髓神经调控的重要手段。凭借其能够穿透深层组织、达到毫米级空间分辨率以及能量输出参数可控等物理特性，该技术的应用已从基础神经机制研究拓展至多种脊髓病理模型的临床前转化研究。
研究表明，FUS 可通过热效应和机械效应以两种方式调控脊髓神经回路：抑制或激活神经活动。此外，FUS 具有时间上可逆以及对组织安全的特性1,2,3。在脊髓损伤模型研究中，FUS 通过调节炎症反应并促进神经修复，改善了大鼠的运动能力4,5,6。此外，FUS 已被证实可通过微泡介导的空化效应打开血-脊髓屏障，提高局部药物递送效率7,8。在神经病理性疼痛领域，Liao 等人证实，FUS 通过调控 KCC2 表达并抑制 CaMKIV-KCC2 通....
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方案
本研究中描述的所有动物实验程序均经深圳先进技术研究院动物实验机构伦理委员会批准（证书编号：SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313）。所有实验均使用雄性 C57BL/6J 小鼠（8 周龄）。小鼠在手术时体重为 18–22 g。
1. 麻醉诱导与维持（5 ± 1 分钟）
- 预先为麻醉回路充气5分钟。
- 将诱导室设置为以2 L/min的气流速度输送含4%异氟烷的医用空气。给予卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）作为术前镇痛。
- 在失去翻正反射后，切换至面罩通气。
- 调节蒸发器，维持1.5–2%异氟烷浓度。
- 使用设定为37 °C的加热毯维持小鼠体温，麻醉期间目标体温范围为36–38 °C。
- 涂抹泰乐菌素眼膏。
2. 定位（1 ± 1 分钟）
- 使用可调节的小鼠立体定位适配器。
- 将小鼠置于俯卧位，保持脊柱对齐，以维持脊柱的生理曲度。
- 使用耳杆固定小鼠头部。
- 对称放置四肢。
3. 手术区域准备（1 ± 1 分钟）
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结果
旷场实验
旷场实验旨在评估小鼠在手术后可能出现的行为变化（图2A）。采用标准的40 cm × 40 cm旷场箱，以确保小鼠拥有足够的活动空间，同时维持相对一致的环境条件并尽量减少外界干扰。实验包括两个阶段：术前阶段和术后7天阶段。在每个阶段，均进行10分钟的视频记录，以记录小鼠的行为表现。使用SMART软件分析所采集的视频，精确测量小鼠的总移动距离，从而量化其活动水平。本实验共涉及6只小鼠，每只小鼠的术前和术后数据均被记录，并进行配对，用于后续统计分析。
采用 GraphPad 软件进行 Wilcoxon 符号秩检验，以确定手术前后阶段小鼠总移动距离是否存在显著差异。结果显示，p 值为 0.1562，显著高于统计学显著性阈值 0.05（图 2B）。这表明小鼠在手术前后的总移动距离之间无统计学上的显著差异。进一步分析差异发现，尽管部分小鼠在手术后总移动距离有所变化，但整体未呈现一致的趋势，且变化幅度未达到统.......
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讨论
本研究提出了一种新型的椎体耦合方案，可在清醒、自由活动的小鼠中实现对脊髓的精确超声神经调控。与传统的固定方法不同，该方法克服了常规固定技术的局限性。与需要持续麻醉（会抑制神经活动并干扰行为评估10）的刚性立体定位框架以及因脊柱运动易发生位移误差的弹性绑带9相比，该方法能够保留功能研究所需的关键自然运动行为。由于设备直接安装于脊柱骨上，显著降低了位移的可能性。该系统已专门用于下肢神经病理性疼痛小鼠模型治疗效果的初步探索，包括Von Frey纤维测试和冷板实验等行为学评估。未来的研究可进一步拓展其在更广泛科研领域的应用。
该方案的关键步骤包括三个连续阶段。第一，椎旁肌的显微外科分离（步骤5）需要在保留血管和神经完整性的前提下，仔细清除椎体表面残留的肌纤维。组织清除不彻底会影响换能器耦合效率，而意外损伤肌内血管或神经结构则可能导致出血并发症或呼吸功能受损。第二，骨界面准备（步骤7）要求在持续生理盐水冲洗下谨慎操作钻头，以防止热损伤。骨表面必须保持轻微湿润，以最大限度减少热量产生，并确保椎板几何.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分得到了香港大学深圳医院高层次人才科研启动项目（项目编号：HKUSZH202207003）的支持。我们诚挚感谢实验室全体成员在实验方案优化和动物护理方面的协助，以及中国科学院深圳先进技术研究院（SIAT）提供的机构支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉诱导室 | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂（502胶） | 北京化工厂 | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=true&id=736 869038961<k2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e&ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996&query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82&skuId=52584 34238219 | |
| 义齿基托材料 | 新世纪齿科 | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| 固定杆 | Custom | ||
| 异氟烷 | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| 金属基座 | Custom | ||
| 显微手术器械 | 深圳市众世科学仪器有限公司 | ||
| 精密钻机 | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| 小动物多通道麻醉系统 | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| 小鼠与幼年大鼠立体定位适配器 | 长沙迈越 | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =true&id=651346369142<k2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 &ns=1&priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a&query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A&skuId=4891677573 207&spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D&xxc= taobaoSearch | |
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| 超声准直器 | Custom |
参考文献
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a....
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