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方法文章

用于小鼠脊髓神经调节的超声换能器固定方法

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DOI：

10.3791/68605

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2025年8月1日

 ,  ,  , 
1Jinan University, 2Department of Neuromedical Center, The University of Hong Kong-Shenzhen Hospital, 3Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

本文内容

摘要

本方案描述了一种专为清醒小鼠脊髓超声刺激设计的超声换能器固定系统。该方法采用一种固定装置，可在确保超声换能器精确定位的同时，允许实验动物自由活动，而不会影响刺激的精确性。

摘要

聚焦超声（FUS）作为一种创新的非侵入性神经调控技术，已展现出在脊髓神经调控方面的重要潜力。然而，沿脊柱实现超声换能器的稳定固定仍面临显著的技术挑战。现有的固定方法通常需要长时间的动物麻醉，或存在粘附可靠性不足的问题。这些关键限制凸显了开发一种新型固定范式以确保操作稳定性与生理相容性的迫切需求。本实验方案介绍了一种用于清醒、自由活动小鼠脊髓刺激的创新性超声换能器固定系统。建立一种可靠的方法以实现超声换能器在椎体上的精确定位，是神经刺激实验的关键。该方法包含三个阶段：暴露T13椎体、精确磨除棘突以形成平面接触界面，以及使用义齿基托材料和粘合剂混合物将金属底座和准直器牢固粘接至椎体。该技术允许动物自由活动，实现自然的运动行为，同时确保各次实验间位置稳定且空间偏差最小，有助于在清醒动物模型中开展超声介导的脊髓干预研究。该方法特别适用于涉及脊髓损伤修复、血-脊髓屏障调控及慢性疼痛机制等需要行为学评估的研究。通过解决清醒动物神经调控研究中的一项关键技术难题，本方案提供了一种无运动限制的稳定换能器-脊柱界面，为获得更准确、可靠的实验结果奠定了基础。

引言

脊髓是整合中枢神经系统与周围神经系统信息的关键枢纽，在疼痛信号转导、运动神经网络重建以及神经可塑性调控等临床研究领域具有重要价值。聚焦超声（FUS）作为一种新兴的无创神经调控技术，已成为脊髓神经调控的重要手段。凭借其能够穿透深层组织、达到毫米级空间分辨率以及能量输出参数可控等物理特性，该技术的应用已从基础神经机制研究拓展至多种脊髓病理模型的临床前转化研究。

研究表明，FUS 可通过热效应和机械效应以两种方式调控脊髓神经回路：抑制或激活神经活动。此外，FUS 具有时间上可逆以及对组织安全的特性1,2,3。在脊髓损伤模型研究中，FUS 通过调节炎症反应并促进神经修复，改善了大鼠的运动能力4,5,6。此外，FUS 已被证实可通过微泡介导的空化效应打开血-脊髓屏障，提高局部药物递送效率7,8。在神经病理性疼痛领域，Liao 等人证实，FUS 通过调控 KCC2 表达并抑制 CaMKIV-KCC2 通路，有效缓解了大鼠的神经病理性疼痛表现9。Song 等人证明，在腰段脊髓施加低强度 tsFUS 可显著减轻大鼠慢性压迫损伤模型中的机械性异痛，并抑制小胶质细胞活化10。实现 FUS 对脊髓的精确调控依赖于超声能量递送系统的空间稳定性。目前的固定策略主要分为两类：1）刚性固定法：通过使用立体定位框架实现精确定位，但需要持续麻醉，这会抑制实验动物的神经活动，影响行为学评估的有效性1,2,3,4,10；2）柔性固定法：采用弹性绑带装置，可在清醒动物中开展研究，但由于脊柱活动度较大，存在位移误差和换能器脱落的问题6,8,9。此外，椎板几何结构的异质性导致超声能量显著衰减，降低了神经调控的效率7,8。

本研究创新性地提出了一种可植入的聚焦超声换能器固定方案，用于清醒、自由活动小鼠脊髓神经调控研究。该方案采用微创手术方法，将金属基座、准直器与椎骨结构整合为一体，支持超声换能器的重复安装，确保超声靶点的一致性，并将超声能量经椎板传播时的衰减控制在可接受范围内。所建立的方法克服了现有技术的关键局限，从而可在清醒、行为自然的动物中开展更可靠且可重复的脊髓神经调控实验。关键参数包括在T13水平处作2.5 cm的正中切口、不锈钢金属基座的固定，以及义齿基托材料与氰基丙烯酸酯粘合剂按3:1的体积比混合使用。该方法的局限性包括手术具有中等程度的侵入性，以及骨面处理过程对操作者技术熟练程度的依赖性。

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方案

本研究中描述的所有动物实验程序均经深圳先进技术研究院动物实验机构伦理委员会批准（证书编号：SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313）。所有实验均使用雄性 C57BL/6J 小鼠（8 周龄）。小鼠在手术时体重为 18–22 g。

1. 麻醉诱导与维持（5 ± 1 分钟）

  1. 预先为麻醉回路充气5分钟。
  2. 将诱导室设置为以2 L/min的气流速度输送含4%异氟烷的医用空气。给予卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射）作为术前镇痛。
  3. 在失去翻正反射后，切换至面罩通气。
  4. 调节蒸发器，维持1.5–2%异氟烷浓度。
  5. 使用设定为37 °C的加热毯维持小鼠体温，麻醉期间目标体温范围为36–38 °C。
  6. 涂抹泰乐菌素眼膏。

2. 定位（1 ± 1 分钟）

  1. 使用可调节的小鼠立体定位适配器。
  2. 将小鼠置于俯卧位，保持脊柱对齐，以维持脊柱的生理曲度。
  3. 使用耳杆固定小鼠头部。
  4. 对称放置四肢。

3. 手术区域准备（1 ± 1 分钟）

  1. 使用电动剪毛器（刀头间隙 0.1 mm）去除手术区域的毛发。
  2. 确保脱毛区域约为 3 cm × 1 cm。
  3. 沿与毛发生长相反的方向进行三次剪毛操作。

4. 切口与入路（2 ± 1 分钟）

  1. 消毒 用碘伏对术区进行3次消毒 （每隔30秒）每次随后用酒精擦拭。通过脚趾夹捏反应确认麻醉深度。
  2. 触诊 最后一根肋骨（在小鼠中连接至T13椎骨）并将其用作
    主要解剖标志。在T13椎体水平沿纵向做一2.5 cm切口
    使用解剖刀沿背侧中线切开。
  3. 依次解剖皮下筋膜。
  4. 通过解剖平面暴露椎旁肌。

5. 椎旁肌分离（5 ± 1 分钟）

  1. 将手术显微镜的放大倍数设置为5倍，以最佳观察椎旁肌肉和椎体结构。
  2. 使用显微剪刀对椎旁肌肉进行锐性分离。
  3. 完全切除背侧和外侧的椎旁肌肉，同时保留腹侧肌肉层。
  4. 使用可吸收止血纱布控制出血。

6. 金属底座安装（1 ± 1 分钟）

  1. 将固定杆（塑料）安装到立体定位适配器上。
  2. 将定制金属底座（不锈钢，0.28 g）安装在杆的远端（图1A）。
  3. 将定制金属底座双侧放置于T13脊椎横突处。
  4. 确认耦合稳定性。

7. 骨界面制备（2 ± 1 分钟）

  1. 在手术显微镜下清除椎板和棘突上的残留肌肉组织。
  2. 使用无菌棉片加压实现完全止血。
  3. 使用精密骨钻在持续生理盐水灌注下创建一个平面接触面。以5,000-10,000 rpm的转速操作骨钻，以最大限度减少产热。佩戴护目镜 钻孔时佩戴面罩和口罩。
  4. 用生理盐水浸湿的棉签清除骨粉。

8. 固定系统密封（3 ± 1 分钟）

  1. 按 3:1 的体积比混合义齿基托材料与氰基丙烯酸酯粘合剂（502 胶水）。佩戴丁腈手套和护目镜，以防接触皮肤或眼睛。
  2. 使用该粘合剂混合物将超声准直器（塑料材质，0.6 g，图 1B）和金属基座固定到脊柱上（图 1C）。
  3. 在受控环境条件下（24 ± 1 °C，相对湿度 40–60%）使粘合剂混合物固化。保持静置 60 秒，直至肉眼确认完全固化（表面光泽消失，形成刚性界面）。
  4. 将金属基座与塑料固定杆分离。
  5. 固定稳定性验证：在水平面内对金属基座施加轻微的旋转力。在 5 倍放大镜下观察准直器与椎骨界面是否存在位移（<0.1 mm 公差）。若位移超过公差，需重新涂抹粘合剂混合物（步骤 8.2），并重复固化过程（步骤 8.3）。

9. 伤口闭合（1 ± 1 分钟）

  1. 对齐创口边缘，完全包埋金属基底。
  2. 使用4-0尼龙线进行间断缝合 。
  3. 用碘伏擦拭切口。
  4. 清除准直器层流暴露区域内的残留血液和骨碎片，并用无菌棉填塞以封闭并止血。

10. 术后管理

  1. 体温调节：将小鼠置于加热毯（37°C）上，直至其完全恢复自主活动能力（通常为麻醉后2–3小时）。
  2. 术后抗生素预防：手术后立即通过皮下注射方式，在背部颈部区域注射头孢唑林钠（50 mg/kg，用0.9%生理盐水溶解至浓度为50 mg/mL）。
  3. 保持伤口清洁卫生。术后前3天每天使用生理盐水润湿的棉签清洁伤口一次，并每日检查手术部位是否有感染、裂开或炎症迹象。
  4. 术后镇痛：术后3天内每12小时皮下注射一次卡洛芬（5 mg/kg）11。
    注意：图1D 显示了恢复后活体小鼠体内植入的固定系统。

11. 危险废物处理

  1. 将骨粉和受血液污染的材料收集到贴有"生物危害"标识的防漏生物危害袋中，并运送至有资质的医疗废物处理机构。
  2. 将未固化的义齿基托材料和502胶残留物放入标有"化学废物"标签的密封耐化学腐蚀容器中，并存放于指定的通风柜内，按照化学废物管理规程进行处置。
  3. 将针头、手术刀片和骨钻放入标有"生物危害"标签的防刺穿锐器容器中丢弃。

12. 安全警示

  1. 处理义齿基托材料时，应佩戴腈类手套和安全护目镜，避免直接接触皮肤；混合与固化操作应在通风良好的通风橱中进行，以尽量减少吸入挥发性单体。
  2. 残余材料应根据机构规定作为化学废弃物处置。使用502氰基丙烯酸酯胶粘剂时，应避免接触皮肤或眼睛；若发生接触，须立即用清水冲洗15分钟，并寻求医疗帮助。应在通风区域使用，储存于阴凉干燥处，远离点火源，并避免与棉质或羊毛织物接触。
  3. 使用精密钻具时，应固定好手机，佩戴面罩和外科口罩，并用生理盐水冲洗钻磨部位，以防止热损伤。

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结果

旷场实验
旷场实验旨在评估小鼠在手术后可能出现的行为变化（图2A）。采用标准的40 cm × 40 cm旷场箱，以确保小鼠拥有足够的活动空间，同时维持相对一致的环境条件并尽量减少外界干扰。实验包括两个阶段：术前阶段和术后7天阶段。在每个阶段，均进行10分钟的视频记录，以记录小鼠的行为表现。使用SMART软件分析所采集的视频，精确测量小鼠的总移动距离，从而量化其活动水平。本实验共涉及6只小鼠，每只小鼠的术前和术后数据均被记录，并进行配对，用于后续统计分析。

采用 GraphPad 软件进行 Wilcoxon 符号秩检验，以确定手术前后阶段小鼠总移动距离是否存在显著差异。结果显示，p 值为 0.1562，显著高于统计学显著性阈值 0.05（图 2B）。这表明小鼠在手术前后的总移动距离之间无统计学上的显著差异。进一步分析差异发现，尽管部分小鼠在手术后总移动距离有所变化，但整体未呈现一致的趋势，且变化幅度未达到统...

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讨论

本研究提出了一种新型的椎体耦合方案，可在清醒、自由活动的小鼠中实现对脊髓的精确超声神经调控。与传统的固定方法不同，该方法克服了常规固定技术的局限性。与需要持续麻醉（会抑制神经活动并干扰行为评估10）的刚性立体定位框架以及因脊柱运动易发生位移误差的弹性绑带9相比，该方法能够保留功能研究所需的关键自然运动行为。由于设备直接安装于脊柱骨上，显著降低了位移的可能性。该系统已专门用于下肢神经病理性疼痛小鼠模型治疗效果的初步探索，包括Von Frey纤维测试和冷板实验等行为学评估。未来的研究可进一步拓展其在更广泛科研领域的应用。

该方案的关键步骤包括三个连续阶段。第一，椎旁肌的显微外科分离（步骤5）需要在保留血管和神经完整性的前提下，仔细清除椎体表面残留的肌纤维。组织清除不彻底会影响换能器耦合效率，而意外损伤肌内血管或神经结构则可能导致出血并发症或呼吸功能受损。第二，骨界面准备（步骤7）要求在持续生理盐水冲洗下谨慎操作钻头，以防止热损伤。骨表面必须保持轻微湿润，以最大限度减少热量产生，并确保椎板几何...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了香港大学深圳医院高层次人才科研启动项目（项目编号：HKUSZH202207003）的支持。我们诚挚感谢实验室全体成员在实验方案优化和动物护理方面的协助，以及中国科学院深圳先进技术研究院（SIAT）提供的机构支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉诱导室Shenzhen RWDhttps://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts
氰基丙烯酸酯粘合剂（502胶）北京化工厂https://item.taobao.com/item.htm?
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参考文献

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