分析低起始量原代小鼠胆管细胞染色质状态转换的多组学技术

摘要

本手稿提出了一个全面的方案，用于低输入 ChIP-seq 来分析组蛋白修饰和 ATAC-seq，以评估少量原代小鼠胆管细胞中染色质的可及性。

摘要

多囊肝病 （PLD） 是一种遗传性疾病，其特征是形成源自胆管细胞的充满液体的囊肿，导致疾病进展和患者生活质量的显着降低。目前 PLD 的治疗方法不足，强调需要新的治疗策略。表观遗传调控在 PLD 进展中的作用，特别是染色质可及性和组蛋白修饰，仍未得到充分探索。传统的表观遗传学分析技术，如 ChIP-seq 和 DNase-seq，需要大量细胞，而这些细胞很难从原代胆管细胞中获得。为了解决这个问题，我们针对少量原代胆管胶细胞优化了低起始量 ChIP-seq 和 ATAC-seq 方案。这些方法允许以最少的细胞起始量分析组蛋白修饰和染色质可及性。低起始量 ChIP-seq 利用微球菌核酸酶 （MNase） 进行 DNA 片段化，而 ATAC-seq 使用 Tn5 转座酶捕获开放染色质区域。这些多组学技术为 PLD 和其他胆道疾病中胆管细胞命运转变过程中的染色质状态动力学提供了有价值的见解。重要的是，优化的方案自信地适用于其他低起始量原代细胞，从而能够探索各种细胞环境中的表观遗传机制。这项工作提出了一种研究染色质状态改变的系统方法，有助于开发基于表观遗传学的 PLD 和相关疾病治疗策略。

引言

PLD 是一种遗传性疾病，其特征是源自胆管细胞的多个充满液体的囊肿的发展。随着这些囊肿逐渐扩大，它们会严重影响患者的生活质量 ^1,2。现有的 PLD 治疗策略不足，仅提供有限的益处，同时经常导致高复发率和并发症 ^3,4。因此，迫切需要更安全、更有效的治疗方法来应对 PLD 治疗中尚未解决的临床挑战。

在正常情况下，胆管细胞保持静止状态，而在 PLD 中，它们表现出过度增殖，这是疾病进展的关键驱动因素 ^5,6。这种囊性转变的分子机制尚不清楚。虽然表观遗传调控（包括染色质可及性和组蛋白修饰）在细胞命运转变中起着至关重要的作用 ^7,8，^但其在 PLD 进展中的作用仍未得到充分研究。然而，许多表观遗传学分析技术需要大量的细胞。传统的 ChIP-seq 依赖于超声处理的染色质片段化，以及染色质可及性检测，如 DNase-seq 和 MNase-seq，通常需要超过 10⁶ 个细胞，远远超过原代胆管细胞可获得的数量。

本手稿为低起始量 ChIP-seq ^9,10,11 提供了一个全面的方案，用于分析组蛋白修饰，以及 ATAC-seq 11,12,13 用于评估低数量原代胆管细胞中染色质的可及性。低起始量 ChIP-seq 使用 MNase 片段化 DNA⁹，而 ATAC-seq 使用 Tn5 转座酶¹² 从开放染色质区域捕获 DNA 片段。利用这些方法的多组学分析为 PLD 和其他胆道疾病中胆管细胞命运转变过程中的染色质状态动力学提供了有价值的见解，从而促进了表观遗传靶向疗法的开发。

方案

1. 制备用于 ATAC-seq 的溶液和胆管细胞

1. 至少在 ATAC-seq 实验前 1 天，使用 表 1 中列出的试剂制备 ATAC 裂解缓冲液。
   注意：ATAC 裂解缓冲液可在 4 °C 下避光保存至少 1 个月。
2. 对于新鲜分离的原代胆管细胞¹⁴，分离后立即使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后进行 ATAC-seq 实验。
   注意：越早越好，以尽量减少对细胞活力的影响。但是，如果保持在冰上，则在 2 小时内进行通常不是问题。

2. ATAC-序列

注意：使用 100,000 个胆管细胞进行 ATAC-seq。将样品和溶液保存在冰上。对于 ATAC-seq 实验，整个过程大约需要 2 天。

1. 在 4 °C 下以 500 × g 离心 5 分钟。
2. 弃去上清液，加入 200 μL 含有蛋白酶抑制剂的 ATAC 裂解缓冲液，轻轻移液混合，并在冰上孵育 20 分钟。在前 10 分钟内，轻轻移液混合。
3. 在 4 °C 下以 1,500 × g 离心 10 分钟。
4. 将 3 μL ATAC DNA 文库制备试剂盒中的酶混合物、10 μL ATAC DNA 文库制备试剂盒中的 5x 缓冲液和 37 μL 无核酸酶水混合，制备转座反应缓冲液 （50 μL）。充分混合。
5. 小心弃去上清液，将收集的细胞核沉淀物置于冰上，并立即加入 50 μL 转座反应缓冲液。轻轻重悬并在 37 °C 下孵育 60 分钟，每 10 分钟轻弹一次管底以混合。
   注：在丢弃上清液之前制备转座反应缓冲液，以防止细胞变干。
6. 根据制造商的说明，使用 PCR 纯化试剂盒纯化 DNA。
   注：在此步骤中，可以去除胆管细胞分离过程¹⁴ 中残留的蛋白 G 珠。DNA 样品可以储存在 -80 °C 下进行长期保存。
7. 根据制造商的说明，使用 ATAC DNA 文库制备试剂盒进行文库构建。
   注意：除非另有说明，否则请将所有样品和溶液保存在冰上。虽然其他试剂盒品牌的程序可能有所不同，但都与我们的实验方案兼容。
   1. PCR 富集：按 指定顺序混合以下组分，在 PCR 管中制备 PCR 富集混合物 （50 μL）：10 μL DNA 样品（来自步骤 2.6）、14 μL 无核酸酶水、10 μL 5x TAB、5 μL PPM、1 μL TAE、5 μL P5 引物和 5 μL P7 引物。轻轻移液混合。
   2. 将试管转移到PCR仪器上并运行以下程序：（72°C，3分钟）x 1个循环，（98°C，30秒）x 1个循环，（98°C，15秒，60°C，30秒，72°C，3分钟）x 15个循环，和（72°C，5分钟）x 1个循环，并保持在4°C。
   3. 纯化：使用前将 DNA Clean 磁珠置于室温下 30 分钟，然后进行两步磁珠纯化。
      1. 第一轮：向 PCR 产物中加入 30 μL DNA Clean 微珠（来自步骤 2.7.2），轻轻移液混合，并在室温下孵育 5 分钟。将 PCR 管放在磁力分离器上，等待溶液变清（~5 分钟）。小心地将上清液转移到新试管中，并丢弃 DNA Clean 珠子。
      2. 第二轮：向收集的上清液中加入 7.5 μL DNA Clean 珠子（来自步骤 2.7.3.1），轻轻移液混合，并在室温下孵育 5 分钟。将试管放在磁力分离器上，等待溶液变清（~5 分钟）。小心丢弃上清液。
   4. 将试管放在磁力分离器上，并在室温下用 200 μL 新鲜制备的 80% 乙醇冲洗 DNA Clean 珠子 2 x 30 秒。每次冲洗后小心丢弃上清液。在管子仍在磁分离器上的情况下，打开管盖并将珠子风干 10 分钟。最后，加入 22 μL 不含核酸酶的水以洗脱 DNA。
      注：DNA 样品可储存在 -80 °C 下进行长期保存。
8. 使用标准的下一代测序仪对文库进行测序。
   注意：我们建议至少获取 5000 万次双端读取。

3. 用于低起始量 ChIP-seq 的溶液和胆管细胞的制备

1. 至少在低起始量 ChIP-seq 实验前 1 天，使用 表 2、表 3、表 4 和表 5 中列出的试剂制备 ChIP 裂解缓冲液、ChIP MNase 缓冲液、ChIP 终止缓冲液、ChIP 2x RIPA 缓冲液、ChIP RIPA 缓冲液和 ChIP LiCl 缓冲液。
   注意：上述溶液可在 4 °C 下储存至少 1 个月。
2. 对于新鲜分离的原代胆管细胞¹⁴，分离后立即使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后进行低输入 ChIP-seq 实验。
   注意：越早越好，以尽量减少对细胞活力的影响。但是，如果保持在冰上，则在 2 小时内进行通常不是问题。

4. 低起始量 ChIP-seq 的第 1 天：细胞裂解、MNase 消化和抗体孵育

注意：对于低起始量 ChIP-seq 实验，整个过程大约需要 3 天。

1. 将胆管细胞分成每管 100,000 个细胞的等分试样，并将样品和溶液保存在冰上。
   注：如果对多种组蛋白修饰进行低起始量 ChIP-seq 实验，则在添加组蛋白修饰抗体之前按比例扩大体积是可以接受的。以下步骤中的试剂体积基于一根包含 1 × 10⁵ 个细胞的试管。
2. 在 4 °C 下以 2,000 × g 离心 5 分钟。
3. 弃去上清液，加入 19 μL 含有蛋白酶抑制剂的 ChIP 裂解缓冲液，轻轻移液混合，并在冰上孵育 10 分钟。避免产生气泡。
4. 加入 19 μL ChIP MNase 缓冲液，轻轻移液混合。
5. 加入 2 μL MNase （0.01 U/μL） 并轻轻移液混合。在 37 °C 孵育 5 分钟。
   注意：孵育时间很关键。MNase 的最终浓度为 0.0005 U/μL。MNase 的最佳浓度可以根据细胞类型和数量来确定。
6. 立即将样品置于冰上，加入 5 μL ChIP STOP 缓冲液以终止消化，然后轻轻移液混合。
7. 加入 45 μL 含有蛋白酶抑制剂的 ChIP 2x RIPA 缓冲液，轻轻移液混合，并在冰上进一步孵育 10 分钟。
8. 在 4 °C 下以 20,000 × g 离心 15 分钟。 将上清液缓慢转移到新试管中。
   注：在此步骤中，可以去除胆管细胞分离过程¹⁴ 中残留的蛋白 G 珠。
9. 加入 40 μL ChIP RIPA 缓冲液。
10. 对于免疫沉淀 （IP） 样品，每个样品添加 1 μg 抗体，并将悬浮液在旋转器 （20 rpm） 上于 4 °C 孵育过夜。
11. 对于输入样品，不要添加任何抗体，并将悬浮液在旋转器 （20 rpm） 上于 4 °C 孵育过夜。

5. 低起始量 ChIP-seq 的第 2 天：免疫沉淀、洗涤和洗脱

注意：对于 IP 示例，请按照步骤 5.1-5.7作。对于 Input samples （输入样本），请遵循步骤 5.8-5.12。

1. 用 1 mL 冰冷的 ChIP RIPA 缓冲液预洗蛋白 G 微珠。
2. 向样品中加入 400 μg 蛋白 G 珠，并在 4 °C 下旋转 （20 rpm） 孵育 2 小时。
3. 用 150 μL 冰冷的 ChIP RIPA 缓冲液在 4 °C 下在旋转器 （20 rpm） 上洗涤珠子 5 x 5 分钟。使用磁力分离器去除上清液。
4. 在 4 °C 下，在旋转器 （20 rpm） 上用 150 μL 冰冷的 ChIP LiCl 缓冲液洗涤磁珠 5 分钟。使用磁力分离器去除上清液。
5. 加入 30 μL ChIP 洗脱缓冲液（29 μL 无核酸酶水和 1 μL 蛋白酶 K）以重悬磁珠，并在 55 °C 下以 900 rpm 振荡 90 分钟。定期轻轻弹动试管，使珠子保持悬浮状态。
6. 使用磁力分离器收集上清液，并将其缓慢转移到新管中。在 72 °C 下孵育 40 分钟以灭活蛋白酶 K。
7. 使用荧光计测量 DNA 浓度。
   注：DNA 样品可储存在 -80 °C 下进行长期保存。
8. 对于输入样品，加入 1 μL 蛋白酶 K，并在 55 °C 下以 900 rpm 的速度摇动 90 分钟。
9. 使用苯酚-氯仿提取法纯化 DNA。加入 130 μL DNA 提取试剂并剧烈涡旋，直到溶液变为粉红色。以 20,000 × g 离心 5 分钟。
10. 将上清液转移到新试管中，加入 130 μL 冰冷的异丙醇，然后加入 1 μL 糖原和 6.5 μL 3M NaAc。以 20,000 × g 离心 15 分钟。
11. 弃去上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤一次，然后以 20,000 × g 离心 15 分钟。干燥沉淀并将其重悬于 30 μL 无核酸酶水中。
12. 使用荧光计测量 DNA 浓度。
    注：DNA 样品可储存在 -80 °C 下进行长期保存。

6. 低起始量 ChIP-seq 的第 3 天：文库构建和测序

1. 根据制造商的说明，使用 ChIP DNA 文库制备试剂盒进行文库构建。
   注：这些步骤包括末端制备、接头连接和文库扩增。移液 5 ng ChIP 样品（输入和 IP 样品）用于文库构建。除非另有说明，否则请将所有样品和溶液保存在冰上。虽然其他试剂盒品牌的程序可能有所不同，但都与我们的实验方案兼容。
2. 最终制备：将 5 ng DNA 样品（来自步骤 5.6 或步骤 5.11）、15 μL 末端制备混合物 4、6.5 μL Tris EDTA 和不含核酸酶的水混合至最终体积为 65 μL，在 PCR 管中制备最终制备反应缓冲液 （65 μL）。将试管转移到 PCR 仪器并运行以下程序：20 °C 15 分钟，65 °C 15 分钟，并保持在 4 °C（热盖：105 °C）。
3. 接头连接：以 1：100 的比例稀释 DNA 接头 S。混合 65 μL 末端制备产物（来自步骤 6.2）、25 μL 快速连接缓冲液 2、5 μL 快速 DNA 连接酶和 5 μL 稀释的 DNA 接头 S，在 PCR 管中制备接头连接反应缓冲液 （100 μL）。将试管转移到 PCR 仪器上并运行以下程序：20 °C 15 分钟，然后在 4 °C 下保持（热盖：105 °C）。
4. 纯化：
   1. 使用前将 DNA Clean 磁珠置于室温下 30 分钟。向接头连接产物中加入 60 μL DNA Clean 微珠（来自步骤 6.3）。轻轻移液混合并在室温下孵育 5 分钟。
   2. 将 PCR 管放在磁力分离器上，等待溶液变清（~5 分钟）。小心丢弃上清液。
   3. 将管子放在磁选机上。在室温下，用 200 μL 新鲜制备的 80% 乙醇冲洗 DNA Clean 磁珠 2 x 30 秒。每次冲洗后小心丢弃上清液。
   4. 在管子仍在磁分离器上的情况下，打开管盖并将珠子风干 5 分钟。最后，加入 22.5 μL 的 10 mM Tris-HCL （PH 8.0） 以洗脱 DNA。
5. 文库扩增：混合 20 μL 纯化产物（来自步骤 6.4）、2.5 μL i5 PCR 引物、2.5 μL i7 PCR 引物和 25 μL 扩增混合物，在 PCR 管中制备文库扩增反应缓冲液 （50 μL）。轻轻移液混合。将试管转移到 PCR 仪器并运行以下程序：（95 °C 3 分钟）x 1 个循环，（98 °C 20 秒，60 °C 15 秒，72 °C 30 秒）x 18 个循环，（72 °C 5 分钟）x 1 个循环，并保持在 4 °C。
6. 纯化：使用前将 DNA Clean 磁珠置于室温下 30 分钟，然后进行两步磁珠纯化。
   1. 第一轮：向文库扩增产物中加入 30 μL DNA Clean 微珠（来自步骤 6.5）。轻轻移液混合并在室温下孵育 5 分钟。将 PCR 管放在磁力分离器上，等待溶液变清（~5 分钟）。小心地将上清液转移到新试管中，并丢弃 DNA Clean 珠子。
   2. 第二轮：向收集的上清液中加入 7.5 μL DNA Clean 微珠。轻轻移液混合并在室温下孵育 5 分钟。将试管放在磁力分离器上，等待溶液变清（~5 分钟）。小心丢弃上清液。将管子放在磁选机上。在室温下，用 200 μL 新鲜制备的 80% 乙醇冲洗 DNA Clean 磁珠 2 x 30 秒。每次冲洗后小心丢弃上清液。在管子仍在磁分离器上的情况下，打开管盖并将珠子风干 10 分钟。最后，加入 22.5 μL 10 mM Tris-HCl （PH 8.0） 以洗脱 DNA。
      注：DNA 样品可储存在 -80 °C 下进行长期保存。
7. 在标准的下一代测序仪中对文库进行排序。
   注意：我们建议至少获取 10-2000 万次双端读取。

7. ATAC-seq 和 Low-input ChIP-seq 的数据分析

1. 准备分析虚拟环境 （miniconda）
   1. 使用以下命令从网站下载 Miniconda3，然后按照 Miniconda 的安装说明进行作。
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      重击Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
   2. 为 ATAC-seq 和 ChIP-seq 的分析管道创建虚拟环境。
      conda create -n NGS管道
      conda activate NGSpipeline
      conda install bioconda：：fastqc bioconda：：multiqc bioconda：：trim-galore bioconda：：bowtie2 bioconda：：samtools bioconda：：macs2 bioconda：:d eeptools bioconda：:p icard bioconda：：igv
   3. 下载参考基因组序列文件并为 bowtie2 比对制作比对索引。
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
2. 使用 FastQC 对 ATAC-seq reads 和 ChIP-seq reads 进行质量控制，并使用 MultiQC 总结质量控制报告，以确保测序结果的 GC 偏差和足够的文库复杂性用于下游分析。丢弃具有显著差异质量控制结果的序列库。
   fastqc -o <输出目录> ......
   multiqc
3. 使用 trim 丰富的 Trim 排序适配器。
   trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 --e 0.1 --paired -j <线程编号> -o <输出目录>
4. 使用默认参数使用 Bowtie2 将修剪的读数映射到 mm10 参考基因组组装，并将添加参数 （--very sensitive -X 2000） 传递给 ATAC-seq 的 bowtie2，因为 ATAC-seq 片段的长度分布很广。
   1. 对于 ATAC-seq：
      bowtie2 -p <线程编号> --非常敏感 -X 2000 -x < 步骤 7.1.3 中的基因组索引> -1 < 从 4.2 读取 1 中清理了 fastq 文件> -2 <从 4.2 读取 2 中清理了 fastq 文件> | samtools 查看 -S -O BAM -@ <线程编号> -o <输出 bam 文件>
   2. 对于 ChIP-seq：
      bowtie2 -p <线程号> -x < 步骤 7.1.3 中的基因组索引> -1 <从 4.2 读取 1 > -2 中清理了 fastq 文件 <从 4.2 读取 2 中清理了 fastq 文件> | samtools view -S -O BAM -@ <线程号> -o
5. 去除比对分数低 （q30） 的读数以及与线粒体基因组和非标准染色体比对的读数。
   samtools 视图 -bh -q 30 -f 2 <输入 bam 文件> | samtools 视图 -h | grep -v 'chrM' | grep -v '随机' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <输出过滤的 bam 文件>
6. 使用 Picard MarkDuplicates 命令删除 PCR 重复读数。
   picard MarkDuplicates I=<输入过滤的 bam 文件> O=
   M= REMOVE_DUPLICATES=true
7. 使用带有参数 -f BAMPE -g mm -B -q 0.01 的 MACS2 callpeak 命令调用峰值。
   macs2 callpeak -f BAMPE -t <删除重复的 bam 文件 > -g mm -n <输出前缀> -B -q 0.01
8. 使用 Deeptools BamCoverage 命令生成 BigWig 文件。
   samtools 索引 <删除重复的 BAM 文件> -@ 4
   bamCoverage -b <删除重复的 bam 文件> -o <输出 BigWig 文件> -bs 50 -p <线程编号> --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
9. 使用 IGV 基因组浏览器查看来自 macs2 的 narrowPeak 文件和来自 Deeptools BamCoverage 的 BigWig 文件。

结果

为了生成原代胆管细胞的染色质景观，我们针对低数量 （~100,000） 的原代胆管细胞优化了低起始量 ChIP-seq 和 ATAC-seq 方案。原代胆管细胞的琼脂糖凝胶电泳结果表明，对于 1 × 10⁵ 个原代胆管细胞，0.02 U MNase 在 37 °C 下 5 分钟导致单核小体的产生，这被确定为最佳浓度（图 1）。

WT 或 PLD 小鼠胆管细胞的 ATAC-seq 和 H3K9ac/H3K9me3 低起始量 ChIP-seq 分析概述
WT 和 PLD 胆管细胞中染色质可及性水平的全基因组分析揭示了高质量的 ATAC-seq 和 ChIP-seq 数据。所有测序实验，包括 ATAC-seq 和低起始量 ChIP-seq，均使用两次生物学重复进行，以确保可重复性。使用 FastQC 对 ATAC-seq 和低起始量 ChIP-seq 进行的质量控制分析表明测序读取质量高（表 6）。跨基因的 ATAC-seq 信号热图...

讨论

为了系统、全面地绘制囊性胆管细胞状态转换背后的染色质状态动力学，我们成功优化了有限数量的原代胆管细胞的低起始量 ChIP-seq 和 ATAC-seq。尽管这项研究侧重于原代胆管细胞，但我们相信该方案也可以应用于其他可用性有限的高活力原代细胞。同样，虽然本研究仅介绍了 H3K9ac 和 H3K9me3 的 ChIP-seq 分析结果，但该方案同样适用于其他组蛋白修饰，包括 H3K4me1、H3K4me3、H3K9ac 和 H3K27ac 等激活标记，以及 H3K9me3、H3K27me3 和 H3K36me3 等抑制标记。几个关键步骤对于确保实验的成功执行至关重要。

第一个关键步骤是确保原代胆管细胞分离的高活力。ATAC-seq 和低起始量 ChIP-seq 都需要高活力细胞;因此，必须在分离后立即对细胞进行计数和处理。胆管细胞分离过程中残留的任何蛋白 G 珠子都不会影响实验，因为它们可以在手术过程中去除（低起始量 ChIP-seq 的方案步骤 4.8 和 ATAC-seq 的方案步骤 2.6）。低起始量 ChIP...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA	Solarbio	E1170
1 M Tris-HCl （pH=7.5）	Solarbio	T1140
1 M Tris-HCl （pH=8.0）	Solarbio	T1150
3 M NaAc	Beyotime	ST342
8 M LiCl	Sigma	L7026
琼脂糖凝胶	Biosharp	BS081
ATAC DNA 文库制备试剂盒	Vazyme	TD501
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	1 M 储备液
ChIP DNA 文库制备试剂盒	Vazyme	ND607
DNA 清洁珠	Vazyme	N411
DNA 提取试剂	Solarbio	P1012
EGTA	Solarbio	E8050	100 mM （pH = 8） 储备液
荧光计	Invitrogen	Q33226
糖原	Thermo Scientific	R0561
血细胞计数器	QIUJING	XB。K.25。
Igepal CA-630	Sigma	I8896	10% 库存
磁选机	Promega	Z5342
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1.5 M 库存
MNase	Sigma	N3755	0.01 U/µL 原液
NaCl	Sangon Biotech	A610476	5 M 原液
NP40	Solarbio	N8030
无核酸酶水	Life Technologies	AM9937
PCR 仪器	Applied Biosystems	4484073
PCR 纯化试剂	QIAGEN	28106
蛋白酶抑制剂	罗氏	04693132001
蛋白 G 微珠	Invitrogen	10004D
蛋白酶 K	TransGen	GE201-01
旋转器	Kylin-Bell	QB-528
SDS	Solarbio	S8010	10%  库存
脱氧胆酸钠	Sigma	S1827
热混合器 舒适	Eppendorf	5355
Triton X-100	Solarbio	T8200
吐温-20	Solarbio	T8220
软件	Citation （PMID）/Company	版本	Website
Bowtie2	22388286	2.3.5.1	https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools	27079975	3.4.3 https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC		0.12.1	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV	21221095	2.12.3	https://igv.org/
MACS2	18798982	2.2.7.1	https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
Miniconda	Anaconda	4.7.12.1	https://www.anaconda.com/
MultiQC	27312411	1.23	https://seqera.io/multiqc/
Picard		2.27.5	https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools	33590861	1.6	https://www.htslib.org/
修剪丰富		0.6.6	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/