本论文提供了一种低起始量的ChIP-seq全面实验方案，用于分析少量原代小鼠胆管上皮细胞中的组蛋白修饰，以及通过ATAC-seq评估染色质可及性。
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本文内容
摘要
摘要
多囊性肝病（PLD）是一种遗传性疾病，其特征是由胆管上皮细胞衍生的充满液体的囊肿形成，导致疾病进行性发展，并显著降低患者的生活质量。目前对 PLD 的治疗手段尚不充分，凸显了开发新型治疗策略的迫切需求。表观遗传调控在 PLD 进展中的作用，特别是染色质可及性和组蛋白修饰，仍缺乏深入研究。传统的表观遗传分析技术（如 ChIP-seq 和 DNase-seq）需要大量细胞，而从原代胆管上皮细胞中获取足够数量的细胞十分困难。为解决这一问题，我们优化了适用于少量原代胆管上皮细胞的低输入量 ChIP-seq 和 ATAC-seq 实验方案。这些方法能够在细胞用量极少的情况下，实现对组蛋白修饰和染色质可及性的分析。低输入量 ChIP-seq 利用微球菌核酸酶（MNase）进行 DNA 片段化，而 ATAC-seq 则采用 Tn5 转座酶来捕获开放的染色质区域。这些多组学技术为研究 PLD 及其他胆道疾病中胆管上皮细胞命运转变过程中的染色质状态动态变化提供了重要见解。更重要的是，所优化的实验流程可可靠地应用于其他低输入量的原代细胞，从而推动在多种细胞背景下探索表观遗传机制。本研究建立了一种系统性研究染色质状态改变的方法，有助于推动针对 PLD 及相关疾病的基于表观遗传学的治疗策略的发展。
引言
PLD 是一种遗传性疾病，其特征是由胆管细胞衍生出多个充满液体的囊肿。随着这些囊肿逐渐增大，会严重影响患者的生活质量1,4。目前针对 PLD 的治疗策略尚不充分，仅能带来有限的益处，且常导致较高的复发率和并发症发生率3,4。因此，迫切需要更安全、更有效的治疗方法，以应对 PLD 治疗中尚未解决的临床挑战。
在正常情况下，胆管上皮细胞处于静止状态，而在多囊肝病（PLD）中，这些细胞表现出过度增殖，这是疾病进展的关键驱动因素5,6。这种囊性转变背后的分子机制尚不明确。尽管表观遗传调控（包括染色质可及性和组蛋白修饰）在细胞命运转变中发挥着重要作用7,8，但其在PLD进展中的作用仍研究不足。然而，许多表观遗传谱型分析技术需要大量细胞。传统的ChIP-seq依赖超声波破碎染色质，以及染色质可及性检测方法如DNase-seq和MNase-seq，通常需要超过106个细胞，远超自原代胆管上皮细胞可获得的数....
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方案
1. ATAC-seq 所需溶液与胆管上皮细胞的制备
- 在进行ATAC-seq实验的至少一天前，使用表1中列出的试剂配制ATAC裂解缓冲液。
注意：ATAC裂解缓冲液可在避光条件下于4 °C保存至少1个月。 - 对于 freshly isolated primary cholangiocytes14，在分离后立即使用血细胞计数板对细胞进行计数，并尽快开展ATAC-seq实验。
注意：为尽量减少对细胞活力的影响，应尽可能快速进行后续操作。但如果将细胞置于冰上，通常在2小时内完成操作并无问题。
2. ATAC-seq
注意：ATAC-seq 实验使用 100,000 个胆管上皮细胞。样品和溶液需保持在冰上。ATAC-seq 实验的整个流程大约需要 2 天时间。
- 500 × g 离心 g 4 °C下离心5分钟。
- 弃去上清液，加入含有蛋白酶抑制剂的200 µL ATAC裂解缓冲液，轻轻吹打混匀，冰上孵育20 min。前10 min内，轻轻吹打混匀。
- 在 1,500 × g 条件下离心 g 4 °C 下离心....
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结果
为了获得原代胆管上皮细胞的染色质图谱，我们优化了适用于少量（约100,000个）原代胆管上皮细胞的低起始量ChIP-seq和ATAC-seq实验方案。原代胆管上皮细胞的琼脂糖凝胶电泳结果显示，使用1 × 105个原代胆管上皮细胞时，在37 °C条件下使用0.02 U MNase酶处理5分钟可有效生成单核小体，该条件被确定为最佳酶浓度（图1）。
WT 或 PLD 小鼠胆管细胞中 ATAC-seq 与 H3K9ac/H3K9me3 低输入量 ChIP-seq 分析概述
对 WT 和 PLD 胆管细胞中染色质可及性水平的全基因组分析获得了高质量的 ATAC-seq 和 ChIP-seq 数据。所有测序实验（包括 ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq）均设置两个生物学重复，以确保结果的可重复性。使用 FastQC 对 ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq 进行质量控制分析，结果显示测序读段质量较高（表 6）。ATA.......
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讨论
为了系统而全面地绘制囊性胆管细胞状态转变过程中染色质状态的动态变化，我们成功优化了适用于少量原代胆管细胞的低输入量ChIP-seq和ATAC-seq技术。尽管本研究聚焦于原代胆管细胞，但我们确信该方案也可应用于其他存活率高但数量有限的原代细胞。类似地，虽然本研究仅展示了H3K9ac和H3K9me3的ChIP-seq分析结果，但该方案同样适用于其他组蛋白修饰，包括激活型标记如H3K4me1、H3K4me3、H3K9ac和H3K27ac，以及抑制型标记如H3K9me3、H3K27me3和H3K36me3。实验成功执行依赖于若干关键步骤。
第一个关键步骤是确保原代胆管上皮细胞分离的高存活率。ATAC-seq 和低输入量 ChIP-seq 均需要高存活率的细胞，因此细胞在分离后必须立即计数并进行后续处理。胆管上皮细胞分离过程中残留的任何 Protein G 磁珠均不会影响实验结果，因为这些磁珠可在后续步骤中被去除（低输入量 ChIP-seq 的第 4.8 步和 ATAC-seq 的第 2.6 步）。低输入量 ChIP-seq 的第二个关键步骤是使用 MNase 消化染色质。MNase 的浓.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了国家自然科学基金（82402166，授予 R.J.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA | Solarbio | E1170 | |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio | T1140 | |
| 1 M Tris-HCl (pH=8.0) | Solarbio | T1150 | |
| 3 M NaAc | Beyotime | ST342 | |
| 8 M LiCl | Sigma | L7026 | |
| 琼脂糖凝胶 | Biosharp | BS081 | |
| ATAC DNA 文库构建试剂盒 | Vazyme | TD501 | |
| CaCl2 | Sangon Biotech | A501330 | 1 M 储存液 |
| ChIP DNA 文库构建试剂盒 | Vazyme | ND607 | |
| DNA 纯化磁珠 | Vazyme | N411 | |
| DNA 提取试剂 | Solarbio | P1012 | |
| EGTA | Solarbio | E8050 | 100 mM (pH = 8) 储存液 |
| 荧光计 | Invitrogen | Q33226 | |
| 糖原 | Thermo Scientific | R0561 | |
| 血细胞计数板 | QIUJING | XB.K.25. | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896 | 10% 储存液 |
| 磁力分离架 | Promega | Z5342 | |
| MgCl2 | Sangon Biotech | A100288 | 1.5 M 储存液 |
| MNase | Sigma | N3755 | 0.01 U/µL 储存液 |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476 | 5 M 储存液 |
| NP40 | Solarbio | N8030 | |
| 无核酸酶水 | Life Technologies | AM9937 | |
| PCR 仪 | Applied Biosystems | 4484073 | |
| PCR 纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 04693132001 | |
| Protein G 磁珠 | Invitrogen | 10004D | |
| 蛋白酶 K | TransGen | GE201-01 | |
| 旋转混匀仪 | Kylin-Bell | QB-528 | |
| SDS | Solarbio | S8010 | 10% 储存液 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma | S1827 | |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 5355 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| Tween-20 | Solarbio | T8220 | |
| 软件 | 引用（PMID）/公司 | 版本 | 网站 |
| Bowtie2 | 22388286 | 2.3.5.1 | https://github.com/BenLangmead/bowtie2 |
| Deeptools | 27079975 | 3.4.3 | https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/ |
| FastQC | 0.12.1 | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| IGV | 21221095 | 2.12.3 | https://igv.org/ |
| MACS2 | 18798982 | 2.2.7.1 | https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html |
| Miniconda | Anaconda | 4.7.12.1 | https://www.anaconda.com/ |
| MultiQC | 27312411 | 1.23 | https://seqera.io/multiqc/ |
| Picard | 2.27.5 | https://broadinstitute.github.io/picard/ | |
| samtools | 33590861 | 1.6 | https://www.htslib.org/ |
| trim-galore | 0.6.6 | https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ |
参考文献
- Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
- Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and t....
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