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方法文章

昼夜节律光控系统：一种经济实惠、开源且易于搭建的光基实验通用系统

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DOI：

10.3791/68611

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2025年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, University of Bristol, 3Neuroscience and Mental Health Innovation Institute, School of Biosciences, Cardiff University

本文内容

摘要

本文介绍了一种构建、编程和运行昼夜节律炫光系统（Circadian Rave System）的实验方案，该系统是一种基于Arduino的发光二极管（LED）控制器，可用于管理多种复杂的光照程序。

摘要

精确控制光照在所有生物科学领域中具有广泛的应用，而在昼夜节律研究中尤为重要。地球上的生命在进化过程中形成了昼夜节律钟，这是一种内源性的生理与行为调节机制，能够与24小时的太阳日周期同步。为了研究生物钟，研究人员依赖于对光照或温度的实验性操控，以实现昼夜节律的同步化。目前大多数实验室使用市售设备或自行搭建的照明装置，用以模拟或干扰自然的昼夜循环。然而，这些系统在可编程性与精确性方面存在局限，缺乏标准化，且在某些情况下成本较高。为解决这些问题，我们开发了“昼夜节律狂欢系统”（Circadian Rave System），这是一套定制化的软硬件组合，可实现对多个独立光照箱的精确控制。我们已将软件开源，并提供了详细的硬件构建指南，旨在推动未来研究通过该系统实现标准化。为展示该系统的功能及其在昼夜节律实验中的实用性，我们在多种光照范式下测量了黑腹果蝇（Drosophila）的寿命与活动节律，以证明通过光照操控可实现昼夜节律的同步与干扰。综上所述，我们开发出一种标准化、可扩展且低成本的照明系统，任何具备基础电子或编程知识的研究人员均可在实验室内部自行搭建。

引言

在几乎所有涉及动物的实验中，对光的精确控制都至关重要。对于此类动物的实验室饲养，可购买市售的培养箱，但其对复杂光照和黑暗循环程序的编程能力有限。在许多研究领域中，编程复杂光照程序的能力都是必需的，而在昼夜节律研究中尤为关键。昼夜节律钟与太阳日同步，是一种内源性振荡器，能够调控从昆虫到哺乳动物的生理和行为变化1。因此，昼夜节律研究已逐渐渗透到生物学研究的诸多领域，如发育2、免疫3以及人类疾病病理学4。对昼夜节律钟的研究在很大程度上依赖于利用光或温度，通过精确控制时间、强度和循环模式来操控甚至干扰节律钟5,6。目前，亟需一种经济、可扩展且标准化的系统，用于在昼夜节律实验中控制这些变量。

除了调控内源性生物钟外，目前已开发出多种光遗传学工具，利用特定波长的光来控制外源基因的表达 体内 和 体外例如，巨大的遗传可操作性 黑腹果蝇 已为研究人员提供了多种光遗传学工具。例如，对光敏感的Gal4转录因子变体shineGal4可在蓝光照射下被激活，已被众多实验室常规使用7,8,9研究人员通常通过手动开关光源或激光诱导来实现光照变化，但这两种方法在实验设计与实施过程中均可能引入操作和技术上的限制。若能对光照的开启与关闭时间、特定波长、循环模式以及强度（剂量）进行程序化控制，将具有极大的优势。

为了使研究人员能够完全掌控光照条件，我们设计了昼夜节律光控系统（Circadian Rave System, CRS）。这是一种替代性的、经济实惠且可自行组装（DIY）的系统，研究人员可根据需要自行搭建和调整，实现对光照程序的全面定制。该系统基于Arduino微控制器，可控制多达六个独立的LED通道，具有成本低且可扩展的优点。由于易于使用，Arduino等微控制器已被成功用于开发多种DIY实验设备10,11,12。该系统可集成于现有培养箱中，并已在典型实验温度条件下成功测试，具备广泛的功能性（4–37 °C）。用户可通过专为多种操作系统开发的开源软件对CRS进行编程。该软件具有直观易用的用户界面，可编程复杂的光照程序，以更精确地模拟自然太阳光模式。这些自定义光照程序可被创建、保存，并随后加载至微控制器中，从而重复使用先前设定的光照方案，节省实验设置时间。设备编程完成后即可脱离计算机独立运行，相较于传统依赖专用计算机运行光照程序的系统，显著提升了可扩展性。为验证CRS的可靠性，我们对暴露于不同CRS生成光照程序下的果蝇（Drosophila）进行了寿命和活动分析。结果表明，CRS能够连续数月稳定执行多种光照程序。

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方案

1. 构建 CRS

注意：CRS 的设计初衷是由研究人员自行在实验室内部搭建，因此所有组件均可从多家供应商处购得（材料表）。例外的是印刷电路板（PCB），必须由专业的 PCB 制造商生产，或通过联系作者获取。如需商业生产，Gerber 文件已存放于 GitHub 代码仓库中（@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/microcontroller_PCB）。大学的工程院系通常配备有 PCB 打印设备。以下为构建、质量检测和编程单个 CRS 单元的详细说明。

  1. 组装电路
    1. 将电子元件焊接到微控制器PCB的顶部。仅Arduino A1连接器引脚位于PCB底部。元件在PCB上的位置对应于PCB上的字母-数字标识（表1）。使用万用表测试焊接连接。
    2. 通过A1连接将Arduino插入已组装的PCB底部。
    3. 将LED或LED灯带焊接到12 V电缆线上（建议长度至少为1米），并将12 V电线的正负端拧入PCB端子块中，然后用 螺丝刀固定。
      注意：可使用定制LED PCB（@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/LED_PCB）替代LED灯带；每个LED PCB容纳一个单独的LED。此方案的优势在于可使用具有已知且离散发射光谱的LED。
    4. 对六个通道中的每一个重复步骤1.1.3。
      注意：若使用LED灯带，每个LED通道可承载最高400 mA电流，相当于最多20个LED（每个20 mA）。因此，该系统设计为使用5 V LED灯带，每个输出通道连接最多20个LED。
  2. 构建CRS外壳
    1. 将CRS（PCB和Arduino）封装起来，以确保电路的安全性和使用寿命。
      注意：GitHub仓库中提供了一个可3D打印的外壳，已成功使用PLA和ABS材料打印，用于保护设备（@Trincatalyst/CRS/Hardware/CRS_enclosure）。
  3. LED外壳
    1. 可将LED直接集成到培养箱中，替换原有的照明装置，或将它们安装在定制外壳中，多个外壳可堆叠放入单个培养箱内（图1）。
    2. 定制外壳具有更高的可扩展性、成本效益以及更小的空间占用优势。回收实验室塑料制品（如移液器吸头盒）可进一步降低成本（图1D）。使用绝缘胶带将这些回收盒"遮光处理"，以防止漏光。然而，若需更耐用的解决方案，建议使用亚克力材料加工外壳，该方案已通过测试（@Trincatalyst/CRS/Hardware/LED_enclosure）。
      注意：务必测试外壳是否完全遮光，因为漏光可能干扰在同一环境中并行进行的其他实验；若在小型容器中使用LED灯带，还需测试LED是否会导致容器内部温度升高。
  4. 在CRS上安装固件
    1. 下载包含两个文件的CRS固件：definition.h 和 CircadianRaveSystem.ino。这两个文件均可在GitHub仓库中找到（@Trincatalyst/CRS/Software/PCB_firmware）。
    2. 从 www.arduino.cc/software 下载并安装Arduino集成开发环境（IDE）软件。
    3. 通过USB线将Arduino连接至计算机，并在Arduino IDE中选择正确的Arduino通信（COM）端口并建立连接。
      注意：在固件配置期间，Arduino无需连接至PCB电路。
    4. 接着，进入 文件 > 打开，选择包含definition.h和CircadianRaveSystem.ino文件的文件夹。
    5. 当新的IDE窗口打开后，点击 验证，然后上传。这将把固件安装到Arduino上。输出终端应显示完成信息。
    6. 断开Arduino连接，此时其已准备好作为CRS使用。
  5. 启动CRS
    1. 通过将一个5 V、2.5 A能力的电源适配器插入PCB的电源插孔来为CRS供电。
      注意：每个LED通道设计为可承载最高400 mA电流，相当于每个LED 20 mA时最多20个LED。该系统设计为使用5 V LED灯带，每个输出通道连接最多20个LED。PCB配备有过压和过流保护装置，当持续电流达到3 A或用户接入超过6.2 V的电源电压时，电源将被切断。
  6. CRS质量测试
    1. 在使用CRS进行实验之前，测试每个连接到CRS的LED/LED灯带是否能可靠运行至少2天。为此，运行GitHub仓库中提供的CRS_test_profile.txt文件（@Trincatalyst/CRS/Software/Test/CRS_test_2days.txt），或在CRS软件中设计一个光照程序。加载配置文件的步骤2.6中提供了如何运行CRS_test_2days.txt文件的说明。

2. 运行实验

  1. 请按照以下步骤安装CRS软件，该软件可用于编程、运行和检查复杂的光照程序。
  2. 安装CRS软件
    1. 直接从GitHub代码仓库(@CRS/CRS_software)下载CRS软件。
      注意：该软件已通过全面测试，完全兼容以下操作系统：
      对于Windows 10和11系统，请下载@Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zip。
      对于macOS Ventura系统，请下载@Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zip。
    2. 找到并打开已下载的CRS软件。这将启动安装过程，安装完成后即可使用。
      注意：建议将软件移动至更易访问的文件夹中。
  3. 连接CRS设备
    1. 开启CRS设备电源。
    2. 使用Future Technology Devices International（FTDI）电缆将CRS设备连接至已预装CRS软件的计算机。
    3. 打开CRS软件，然后在View选项卡中点击Select Port下拉菜单，选择CRS设备，连接成功后六个LED表格应全部更新。如果此前有实验正在运行，每个配置文件将相应更新。此时，每个CRS LED均已准备就绪，可进行编程。
  4. 编程CRS
    ​注意：CRS的设计初衷是用于昼夜节律实验，并尽可能集成了相关功能。例如，一个典型的复杂实验可能需要持续数天的光同步，随后数天的黑暗处理，再进行进一步的再同步。
    1. 在开始实验前，需在CRS中完整编程整个实验。使用LED标签1至6（图1B）独立编程六个输出通道中的每个LED或LED灯带。每个LED标签内均提供所编程光照程序的图形化表示，可在编程过程中作为参考。
    2. 光照程序被划分为三个独立步骤，每个步骤均可设置光照强度和持续时间。步骤1和步骤3会循环执行，可在不同LED通道之间起到同步作用，例如允许在不同时间将样品装入LED封闭装置中。使用循环切换功能重复步骤2，通常将其编程为持续24小时的周期。
    3. 通过切换T1、T2、T3和T4的光照强度和持续时间，可创建复杂的光照程序。T1和T3作为过渡阶段，可实现光照强度的渐升和渐降，更接近自然光照的日周期变化。程序设定完成后，保存并运行。
      注意：当编程的光照程序正在运行时，图形化程序将相应更新，View选项卡也会同步更新。
  5. 光照配置文件的存储与加载
    1. 对于在多个实验中重复使用的光照程序，可使用Save按钮保存配置文件，该操作会将配置文件转换为CRS可读的txt文件。
    2. 使用Load按钮将先前保存的配置文件加载至CRS中，以加快后续编程速度。
  6. 加载并运行配置文件
    1. 为进行测试，可同时运行每个LED灯带的测试配置文件。进入LED标签页，点击Load profile，然后选择CRS_test_profile.txt。
    2. 点击Program以将配置文件上传至CRS。图形界面及配置文件统计信息应同步更新。
    3. 点击Start，图形界面将实时更新运行进度。对全部六个LED配置文件重复此操作。
  7. 断开与CRS硬件的连接
    1. 在View选项卡中点击Disconnect按钮断开连接，随后安全移除FTDI连接线。
  8. 检查实验进度
    1. 在CRS运行期间如需检查光照程序状态，请打开CRS软件，在View选项卡中点击Select Port下拉菜单并选择CRS设备。View选项卡将显示全部六个LED标签的当前信息。之后按前述方法断开连接。

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结果

CRS 概述
CRS 是硬件与软件的结合，允许用户为每个设备最多六条独立的 LED 灯带编程复杂的光照方案（图 1A）。该软件可从 GitHub 仓库（@Trincatalyst/CRS/Software）免费下载，在软件主界面中可找到更详细的使用说明（图 1B）。硬件设计成本低廉且易于搭建，无需具备电子学先验知识（图 1C）。组件可从用户偏好的供应商处采购，但我们列出了已成功测试并使用的来源（材料表）。唯一无法直接商业购买的部件是微控制器和可选的 LED 印刷电路板（PCB），但两者均可通过商业 PCB 制造服务生产；Gerber 文件已在 GitHub 仓库中提供（@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber）（图 1B）。可使用安装在 LED PCB 或 LED 灯带上的 LED，当使用 LED 灯...

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讨论

为了研究光如何影响生理和行为，需要复杂的光照程序，通常需同时运行多个条件。在这些昼夜节律实验中，精确控制光照的时间和强度对于获得可靠且可重复的数据至关重要。光照循环可通过市售的培养箱或连接机械定时插座的LED灯实现。然而，这些系统在编程复杂光照循环参数方面能力有限或完全无法实现，且用户通常需要手动更改设置。CRS是一种简单且低成本的解决方案，可用于模式生物（如Drosophila和斑马鱼（Danio rerio））的光同步。目前已有部分系统存在，但各自在使用上均有优缺点；例如，某一系统能够控制多种光波长，但每台设备的通道数量有限17。另一种系统可同时控制光照循环并监测活动，但专为小鼠实验设计18。此外，这两个系统在整个实验过程中均需将专用计算机持续连接至微控制器，这显著增加了设备成本并限制了系统的可扩展性。单个CRS系统具备上述大多数优点，同时具有更高的可扩展性，最多可同时运行六个独立的光照通道，且无需专用计算机来运行光照程序。CRS还可与不透明盒子结合使用，将多个盒子置于同一个培养箱内，从而在单个培养箱中...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢Edgar Buhl博士和James Hodge教授提供DAM系统的使用机会及搭建指导。我们还感谢Paul Martin教授在开发CRS过程中给予的支持与指导。本研究工作得到了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）授予Paul Martin教授的基金项目（编号：BB/T001984/1）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 µF 陶瓷电容器Farnell 2507749数量 = 2
100 kΩ 轴向通孔电阻 250 mWFarnell 3951804数量 = 6
100 Ω 轴向通孔电阻 250 mWFarnell 3496799数量 = 6
1 µF 陶瓷电容器Farnell 2819603数量 = 2
2.54 mm 间距通孔排针 水平安装 - FTDI Farnell 3756363数量 = 6
Arduino 排针 10 针Farnell 1593417数量 = 1
Arduino 排针 3 针Farnell 1593412数量 = 1
Arduino 排针 8 针Farnell 1593416数量 = 1
Arduino Uno R3Arduino A000066数量 = 1
筒形插孔Farnell 224959数量 = 1
昼夜节律闪烁系统 PCBMartin 实验室Martin 实验室1（120 条灯带或 1 个带 LED 电路板的 LED 组件）
二极管 Farnell 4245041数量 = 1
eFuse 电路保护器Farnell 4178928数量 = 1
FTDI 电缆Farnell 2419945数量 = 1
LEDRS 855-5933120 条灯带或 1 个带 LED 电路板的 LED 组件
电源 15WFarnell 2815857数量 = 1
接线端子 Farnell 2314973数量 = 6
意法半导体 N 沟道 MOSFET STP30NF10Farnell 9946403数量 = 6

参考文献

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