超分辨率超声定位显微成像用于啮齿类动物脑微血管系统的精细定位

摘要

超声定位显微镜（Ultrasound Localization Microscopy, ULM）是一种 recently developed 技术，可实现前所未有的分辨率来成像微血管系统 体内本文详细描述了如何利用专为临床前研究设计的标准化功能超声成像平台，获得啮齿类动物脑微血管的超分辨率图像。

摘要

超声定位显微镜（Ultrasound Localization Microscopy, ULM）是一种超分辨率成像技术，能够 体内 超越大脑微血管结构的可视化 常规超声的衍射极限。通过检测和追踪经静脉注射后在脑血管中循环的微泡，超分辨率超声显微成像（ULM）可生成空间尺度低至5–10 µm的血管密度、血流速度和背向散射信号幅度的高分辨率图谱。本方案介绍在啮齿类动物中实施ULM成像的完整工作流程，包括动物准备、探头定位、图像采集、微泡注射及数据处理，使用专用的功能性超声平台完成。文中描述了两种适用于小鼠（经颅）和大鼠（开颅窗）的制备方法，随后详细说明如何利用集成脑图谱进行探头对准和解剖靶向。采集过程中，超快超声序列与微泡团注同步，以捕获动态血流数据。后续重建步骤包括杂波滤波、图像插值、微泡检测、亚像素定位和轨迹追踪。输出结果包括反映血管占据情况的密度图、揭示血流模式与方向性的速度图，以及为结构解析提供额外对比度的幅度图。代表性结果展示了在完整冠状面上的成功成像，并指出了常见问题，如注射质量差、运动伪影和颅骨引起的像差。该方案适用于横断面和纵向研究，特别适合用于研究衰老、卒中、动脉瘤等疾病模型中的脑血管改变 神经退行性疾病。通过结合深度穿透能力、高时空分辨率以及无标记血管成像，超分辨率显微成像技术（ULM）为临床前模型中的无创脑微循环分析提供了一种强有力的工具。

引言

尽管大脑仅占体重的2%，却消耗了约20%的氧气和葡萄糖以维持神经元活动¹这一高代谢需求由复杂的血管网络来满足，该网络从大动脉和大静脉延伸至微血管，如小动脉、小静脉和毛细血管，并通过神经血管耦合进行调控。²这一精细调节过程的紊乱已被认为与多种神经系统疾病相关。例如，神经血管解耦是阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等疾病的早期病理特征，常早于神经退行性变的经典标志物（如β-淀粉样蛋白和tau蛋白病变）的出现。^3,4,5,6. 成像大脑的复杂特性 体内 因此，如何更好地满足日益增长的对生理过程理解的需求已成为首要关注的问题。技术的进步提供了独特的能力，能够以更高的精确度、分辨率和可及性，直接或间接地探究大脑功能与活动。

多普勒超声作为一种利用血流来功能性测量脑活动的有力工具已逐渐兴起⁷。特别是功率多普勒成像，其设计用于检测红细胞（RBCs）的运动，通过向血管发射重复的超声脉冲，并记录由运动红细胞散射回的超声回波的幅度⁸。超快超声成像，特别是功能性超声（fUS）的出现，标志着克服以往技术局限的关键转折点。事实上，传统超声以逐线扫描组织——这种顺序式方法将其应用限制于主要脑动脉，因为无法检测到脑微血管系统中典型的缓慢血流⁹。而较新的fUS技术采用多平面波发射，每秒可获取数千帧图像，显著提高了时间分辨率和信噪比（SNR）。尤为重要的是，fUS能够检测流速低至1 mm/s的微小血管中的血流动力学变化，从而支持对小动脉水平的脑活动进行实时功能性成像⁸。

尽管超快多普勒技术显著提升了微血管成像效果，但其分辨率仍受限于超声的衍射极限¹⁰。与功能性超声（fUS）相结合，超声定位显微术（ULM）突破了这一限制，通过利用造影剂和高精度定位算法，实现了毛细血管水平的微血管结构可视化¹¹。这为血管形态与功能的研究提供了前所未有的洞察。更具体而言，在ULM中，将直径约为1–3 µm的稳定充气微泡造影剂注入血液。这些微泡作为强效的声学散射体，可被检测为独立的点源信号。由于微泡显著小于超声波长，因此可在空间和时间上被分离，表现为系统的点扩散函数（PSF）。受光学超分辨率技术（如STORM和PALM）的启发，通过去卷积方法实现对这些微泡的亚像素级定位，从而高精度地确定其位置^10,12,13,14。这使得血管结构的空间分辨率可达5–10 µm，远优于传统超快超声功率多普勒成像的衍射极限。

超分辨率定位显微成像（ULM）是一种强大且有效的血管图谱绘制工具，可实现毛细血管尺度的成像，并克服了多种光学方法仅限于表层组织成像的局限性。与需要脑组织固定和染色的其他技术相比，ULM能够在活体动物中进行微血管成像，支持纵向研究和药理学实验，这是其另一项关键优势。所获取的信息不仅包括静态的血管图谱，还能提供毛细血管水平的血流定量估算，从而为临床前和临床应用开辟了广阔前景。为了促进研究的可重复性，本文描述了一套完整的基于ULM的小鼠脑部成像工作流程，该流程采用专为临床前研究设计的标准化功能超声成像平台实现。

方案

本研究中描述的所有实验程序均符合2010年9月22日欧洲共同体理事会指令（010/63/UE）的要求，并经当地动物实验伦理委员会（编号59的“巴黎中心与南部”动物实验伦理委员会，项目编号#2020-16）批准。实验使用成年雄性C57BL/6 Rj小鼠（2月龄，20–30 g）和Sprague-Dawley Rj:Han大鼠（200–300 g），均购自商业供应商。动物以每笼四只的方式饲养，维持12小时光照/12小时黑暗循环，环境温度恒定为22 °C，并自由供应食物和水 随意摄取实验开始前，所有动物均在饲养条件下进行至少一周的适应期。所用试剂和设备列于下文 材料表

1. 动物准备

1. 小鼠的麻醉与动物准备
   1. 将小鼠放入异氟烷诱导室，以2%异氟烷混合空气（0.075 L/min）和氧气（0.175 L/min，或医用空气）进行麻醉诱导。
   2. 通过使用牢固但无损伤的压力捏压脚趾或尾巴，检查是否无反射反应，以确认麻醉深度足够。若存在反射，可略微增加异氟烷浓度。操作前需重新评估。
   3. 将动物转移至立体定位仪，该仪器置于设定为37 °C的加热垫上以维持体温，并确保持续输送异氟烷 通过 相同浓度和流速的掩膜
   4. 涂抹眼药膏以预防角膜溃疡和白内障形成。
   5. 使用修剪器剃除小鼠头部的毛发。涂抹脱毛膏，最多停留1至1.5分钟，然后用温水彻底冲洗，并用纱布擦干。根据需要重复操作，直至所有毛发去除。避免脱毛膏停留时间过长，以免对皮肤造成化学性损伤。
   6. 将离心处理过的超声耦合凝胶（无气泡、脱气）涂抹于头部，以确保声学耦合。
2. 大鼠的麻醉与动物准备
   1. 称重后，使用1 mL注射器通过腹腔注射给予混合麻醉剂（氯胺酮75 mg/kg和赛拉嗪10 mg/kg）。剃除头部顶部的毛发，并用碘溶液清洁皮肤。
      注意：氯胺酮在许多国家属于严格管制物质，采购和使用可能需要特殊授权。可采用其他麻醉方案（包括异氟烷）来实现外科麻醉水平。
   2. 将动物置于立体定位仪上，立体定位仪放置在预设温度为37 °C的加热垫上，以维持动物体温。在动物眼部涂抹足量的眼科软膏，防止角膜干燥及白内障形成。
   3. 使用1 mL注射器皮下注射美洛昔康（2 mg/kg），用于术中镇痛。
   4. 通过用适当但不造成损伤的压力捏压脚趾或尾巴，检查是否无反射反应，以确认麻醉深度足够。若存在反射反应，追加初始麻醉剂量的四分之一。等待约5分钟后重新评估麻醉深度。只有在确认达到外科麻醉水平后方可继续操作，并每隔20-30分钟重新评估一次。
   5. 沿矢状缝使用手术刀做一纵行切口，确保切口深度足以包含附着于颅骨的皮肤和结缔组织。
   6. 手术过程中使用生理盐水保持周围组织充分湿润。
   7. 使用旋转钻头轻轻划出颅窗轮廓，标记颅骨表层。为了获得最佳的脑组织通路，颅窗的横向尺寸应约为14 mm，前后向尺寸至少为2 mm，具体大小需根据颅骨尺寸调整。
   8. 沿轮廓继续研磨，直至无骨质阻力。钻孔过程中，应定期滴加数滴生理盐水以冷却骨组织，减少热损伤。使用边缘圆滑的细小骨膜剥离器应可无阻力地插入缝隙中。
   9. 使用短促的单向扩孔动作，将最外层骨质磨薄，直至几乎无法感觉到阻力。
   10. 在颅窗的侧缘插入一把边缘圆润、略带弯曲的细 spatula。
   11. 缓慢将刮铲向中心移动，轻柔地将骨片从脑膜上分离。当感觉不到阻力时，抬起并完全移除已分离的骨片。
   12. 在硬脑膜上方涂抹经离心处理的超声耦合凝胶。实验装置示意图如图所示。 图1.

图 1：啮齿类动物ULM脑成像实验装置示意图。 成像系统由一个超声采集单元组成，该单元连接至安装在电动定位平台上的高频探头。图中展示了处于立体定位框架中的小鼠和大鼠：小鼠头皮剃净，用于经颅成像；而大鼠则通过手术制备的颅窗进行成像。两种动物均通过尾静脉插管注射对比剂。该装置可在微泡注射期间稳定地获取高分辨率的功能性超声数据。请点击此处查看该图的高清版本。

3. 小鼠或大鼠尾静脉插管
   1. 使用一个27 G × 1/2"带翼输液套件，连接至一个18 G × 1/2"针头，并配有8英寸导管。如有可能，缩短导管长度以尽量减少死腔体积。
   2. 轻柔地将动物尾巴旋转90度，以暴露尾部侧静脉（见图2）。使用胶带固定尾巴位置，确保稳定性，并防止插管过程中不必要的移动。
   3. 从尾尖（远端）开始向尾根部移动，以识别尾静脉。为便于此操作，可用温水预热尾巴，促进血管扩张，增强静脉可见性。
   4. 用手指在尾巴根部施加轻柔压力，并向注射部位滑动（即逆血流方向）。该操作可暂时阻断静脉回流，使尾静脉扩张并更加明显，便于导管插入。
   5. 将带翼输液套件的27 G × 1/2"针头平行于静脉插入，确保针尖斜面朝上。
   6. 观察导管内是否有回血现象，以确认针头位置正确。
      注意：应从尾部远端开始进行插管，以避免后续注射时因先前穿刺点导致液体渗漏。若尾静脉插管困难或失败，可考虑其他中心通路，包括眶后窦/丛、颈静脉或隐静脉。

图2：啮齿类动物尾部横截面解剖结构，展示导管插入术的血管解剖标志。 一幅啮齿类动物尾部远端横截面的示意图，显示主要血管的相对位置。两条动脉位于中线附近：背侧尾动脉位于上方（背侧）区域，腹侧尾动脉位于尾部横截面的下方（腹侧）部分。这些动脉通常在静脉内操作过程中需要避开。动脉两侧为尾静脉，对称分布于左右两侧，紧贴皮肤下方，是导管插入或微泡注射的首选穿刺部位。该解剖概览有助于精确定位静脉，尤其在加热促进血管扩张时更为明显。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 使用 IcoScan 软件进行探头定位
   1. 在采集平台上启动 fUS 采集软件（例如用于 Iconeus One 的 IcoScan），并创建一个实验会话。调整超声探头的位置。
      注意：将探头置于大鼠或小鼠头部上方约 1 mm 处。在开始任何成像序列之前，确保探头已与超声耦合剂接触。
   2. 启动实时成像采集，并根据实时脑血容量（CBV）成像结果调整探头位置。大脑应位于图像中央。优化成像参数（如对比度和压缩），以提高可视化质量。
   3. 在采集软件中打开Angio3D菜单。调整扫描参数（第一层、最后一层和步长），确保覆盖整个大脑。开始采集。
      注意：设置扫描参数时，应确保扫描范围包括大脑后部，即所有后部动脉。
   4. 保持采集软件处于打开状态，并启动IcoStudio软件用于数据分析与可视化。加载Angio3D扫描数据。
   5. 进入脑部配准面板，使用全自动或手动配准模式，将扫描数据注册至Allen 小鼠通用坐标框架。
   6. 将配准结果保存为 .bps 文件。
   7. 接下来，进入脑部导航菜单。在图谱管理器面板中，使用父/子树导航器浏览 Allen 小鼠脑图谱。选择目标解剖区域，这些区域将叠加显示在三视图面板的扫描图像上。
   8. 选择一个与感兴趣区域重叠的成像平面。在冠状面视图中手动设置两个标记，以定义目标成像切片。
   9. 点击脑部定位系统（BPS），提取与所选成像平面对应的探头位置的电机坐标。查看由 Angio3D 扫描计算出的图像预览，然后点击复制 BPS 坐标。
   10. 切换回IcoScan软件，打开探头定位面板。点击“输入 BPS 坐标”，粘贴步骤 1.4.9 中提取的坐标值。探头将自动移动并对齐至所选成像平面。
   11. 执行一次实时成像采集，确认当前成像平面与步骤 1.4.8 预测的平面一致。
       注意：通过保存并重复使用相同的空间标记，可在不同实验会话中一致地重新定义成像平面，从而实现纵向研究中的精确探头复位。

2. 超声定位显微成像（ULM）数据采集

1. 微泡制备
   注意：可使用多种市售超声造影剂。然而，不同产品的气体成分、微泡浓度、直径和稳定性可能有所不同。请遵循制造商关于制备和储存的建议。
   1. 使用无菌注射器，通过隔膜将 5 mL 的 0.9% 氯化钠溶液注入小瓶中。
      注意：对于重复团注给药或持续输注，可使用较少体积的 0.9% 氯化钠溶液制备更高浓度的微泡悬液。应根据预期用途相应调整稀释倍数。
   2. 剧烈震荡小瓶 20 秒，以充分重悬微泡并实现均匀分散。
2. 超分辨率超声显微成像（ULM）记录
   1. 预先设定记录参数，包括超声序列、帧率和总记录时间。
      注意：推荐的记录参数为 2.5 Hz 下持续 5–10 分钟。
   2. 抽取拟注射的微泡体积并开始数据采集。采集开始后，立即进行微泡注射。建议大鼠注射 200 µL，小鼠注射 100 µL，并采用适当的稀释比例。
   3. 在实时图像中确认造影增强效果。随后立即通过向导管内注射生理液体，冲洗死腔中残留的微泡。典型的微泡强度曲线示例如图3所示。
   4. 等待采集完成并保存数据。
   5. 采集结束后，根据所用实验方案执行以下操作：
      1. 对于小鼠（非侵入性方案）：停止异氟烷麻醉以逆转麻醉状态，并在温暖环境中监测动物直至完全清醒。
      2. 对于大鼠（带有颅窗的侵入性方案）：按照机构和伦理指南，通过腹腔注射 Euthasol（戊巴比妥钠，140 mg/kg）实施安乐死。

图3：微泡信号强度随时间的变化。（A）用于信号提取的兴趣区域（ROI）示意图，涵盖整个冠状面脑切片。（B）在5分钟采集期间微泡信号强度的时间过程。微泡团注于30秒时注入，导致信号幅度出现特征性上升。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 使用 IcoLab 软件进行图像重建

1. 打开 IcoLab，通过点击屏幕最左侧的 ULM 标签，进入 ULM 模块。
2. 点击 Compute ULM Maps 以启动处理流程，具体如 图4 所示。
3. 选择包含已采集数据的源文件夹。
4. 选择需要处理的特定扫描数据，并根据需要调整处理的时间范围。
5. 点击 Next 进入报告步骤。在报告步骤中，配置输出文件夹路径，用于保存处理后的文件；并设置将包含在 PowerPoint 报告中的图像可视化参数。
6. 在最终界面中，检查所选选项的摘要信息。
7. 准备就绪后，点击 RUN 开始处理。处理完成后，将生成一个 .trk 文件，其中包含所有定位微泡的坐标，以及用于密度、速度和背向散射幅度（BSA）的光栅化 TIFF 文件。
   注意：5 分钟的采集数据可能需要数小时的处理时间。建议在夜间或专用工作站上执行此步骤。
   1. 微泡密度图生成：将选定采集时间内所有检测到的微泡的定位位置进行累积，并映射到固定分辨率的空间网格上。
      注意：生成的密度图中每个像素反映的是该空间单元内定位微泡的数量。最终输出为灰度图像（TIFF 格式），像素强度对应血管占据情况，从而实现血管网络的高分辨率重建。
   2. 速度图生成：软件通过连续帧追踪单个微泡，形成轨迹。对于每条轨迹，软件通过位移除以经过时间计算速度矢量（单位为 mm/s）。
      注意：可生成两种类型的速度图：绝对速度图，其中每个像素存储经过微泡的平均速度大小；方向性速度图，其中速度沿选定解剖轴（如 x 或 z 轴）分解，并存储相应的带符号分量。这些图被光栅化到相同的空间网格上，并作为独立的 TIFF 图像保存。
   3. BSA 图生成：对于每个定位的微泡，显示其原始超声信号幅度（背向散射强度）。将这些幅度投影到空间网格上，累积每个像素中的信号强度。生成的 BSA 图突出显示微泡通过声束焦点区域的区域，所提供的对比度可补充密度图和速度图¹⁵。

图 4：ULM 图像重建处理流程图。 该图展示了分析软件中用于从原始超声数据生成超分辨率微泡（ULM）图像的连续处理步骤。从复合帧（n = 200）开始，步骤 1 应用奇异值分解（SVD）杂波滤波，以将微泡（MB）信号与组织背景分离。在步骤 2 中，微泡信号经过 Lanczos 插值，生成预处理后的图像序列。步骤 3 进行局部极大值检测，并将其与系统点扩散函数（PSF）相关联，以识别候选微泡位置。在步骤 4 中，采用亚像素定位（质心检测）和粒子追踪技术提取微泡轨迹，并据此计算速度图和背向散射振幅图。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 使用 IcoStudio 软件进行数据可视化

1. 在 IcoStudio 中加载 .trk 文件以开始数据探索。
2. 在右侧面板中调整对比度、压缩和色彩图等可视化参数，以优化数据呈现效果。
3. 使用主视图底部的双滑块设置积分时间，定义起始帧和结束帧。
4. 打开 Density 选项卡以查看微泡出现情况，并在 Absolute Density（每像素计数）和 Directional Density（轴向加权）之间进行选择。
5. 使用 Velocity 选项卡以多种模式显示微泡速度（单位：mm/s），包括绝对速度、方向性速度、轴向速度和横向速度。调整对比度、压缩和速度阈值以增强可视化效果。
6. 浏览 BSA 选项卡以可视化微泡反射率，该功能提供一种替代的对比机制，可突出显示微血管结构和面外运动。可导出高分辨率 PNG 截图，或生成 TIFF 文件用于定量分析，并可自定义像素尺寸和数据类型设置。

结果

图5 中的代表性示例显示了大鼠脑部的超分辨率定位显微成像（ULM）数据，该数据是在注射200 µL微泡团注后，持续记录1分钟获得的，分辨率达到10 µm。

图5：单次注射微泡后从开颅大鼠获得的代表性超分辨率定位显微成像（ULM）输出结果。图中显示了完整冠状面脑切片的微泡（MB）密度（左）、速度（中）和背向散射幅度（右）示例图，数据采集于注射200 µL微泡团注后1分钟内。比例尺：2 mm。放大插图突出显示左侧皮层微血管结构（比例尺：0.5 mm）。密度图反映了微泡出现的空间分布，揭示了血管网络的结构。速度图展示了单个微泡的流动速度与方向性，可用于区分不同类型的血管。幅度图显示了微泡产生的背向散射超声信号，提供了一种额外的对比机制，有助于增强血管形态及平面外运动的可视化效果。请点击此处查看该图的高清版本。

所得图像展示了脑微血管系统的三种互补视图：微泡（MB）密度（左）、速度（中）和背向散射幅度（右）。每幅图像对应大脑的一个完整冠状切面，放大插图重点显示左侧皮层微血管系统（比例尺分别为 2 mm 和 0.5 mm）。

密度图显示了微泡在视场内空间分布的情况。血管形态的分辨远低于衍射极限，能够清晰呈现大血管和精细的毛细血管结构。此类图谱可清晰展示血管网络的拓扑结构，包括分支和分叉模式，即使在深层皮层区域亦能实现。

速度图显示了各个微泡沿轴向（z方向）投影的流动速度。该投影产生带有符号的速度值，其中负速度表示流向皮层的上升血流，正速度表示向下的血流。在啮齿类动物的大脑皮层中，血管结构具有高度刻板的特征：穿支小动脉从软脑膜表面向下进入皮层各层，而小静脉则从皮层向上返回表面以引流脱氧血液¹⁶。这种一致的解剖结构使得可以利用方向性速度测量来区分不同类型的血管，通常轴向正速度代表动脉血流，负速度代表静脉回流。总体而言，通过超分辨率显微成像（ULM）测得的速度值与文献中先前报道的范围一致^10,17，穿支小动脉中的速度为10–20 mm/s，而在主要颅内动脉中可达每秒数厘米。这些发现与早期观察结果相符，即流动的微泡在流变学行为上 closely 模拟红细胞¹⁸，从而验证了ULM在微尺度上量化生理血流动力学的可行性。

背向散射振幅（BSA）图提供了由每个微泡（MB）返回的超声信号强度的空间分布。当微泡通过焦区时，背向散射能量达到最大，因此该图可基于方位高度位置提供对比度。BSA图有助于优化分割效果，识别平面外运动或低振幅血管，特别是在较大深度或靠近焦区边缘的区域。此外，BSA图还可用于检测与深度相关的信号衰减，或识别焦区对准不一致的情况¹⁵。

为验证脑部定位系统对平面靶向的可重复性，图6A展示了在同一麻醉小鼠中于第0天（第1周）和第7天（第2周）针对同一冠状面获取的超分辨显微血管密度图。两张图谱的叠加显示血管信号具有高度的空间一致性，证实了平面复位的精确性以及纵向实验的可靠性，这与先前研究结果一致¹⁹。

可对上述任何输出结果进行定量分析。例如，用户可利用强度阈值或聚类算法对血管进行分割，进而提取区域统计信息，如血管密度、平均血流速度，以及包括血管半径、平均长度、分支数量和其他血管网络结构描述参数在内的形态计量学参数。可在这些图谱上直接进行不同皮层区域或实验组间（例如，药物注射组与对照组）的比较，或基于共同识别出的血管进行衍生参数统计分析^20,21。作为此类分析的一个示例，我们对中国台湾左脑体感皮层（S1BF，图6B）和左丘脑（图6C）的血管参数进行了区域定量分析。首先将密度图二值化并骨架化，并通过欧几里得距离变换估算血管半径。血流速度直接由微泡（MB）轨迹获得，血流量则根据先前所述的泊肃叶定律（Poiseuille's law）由血管半径推导得出²¹。本研究采用了与前述研究相同的方法学。须状图展示了d0和d7时间点血管半径、速度和血流量的分布情况，表明各次实验间具有良好的可重复性。综上所述，这些多模态超分辨率定位显微成像（ULM）输出结果能够对脑部微血管网络进行全方位表征，以前所未有的分辨率提供解剖结构与动态功能的双重洞察。

图6：利用脑定位系统实现切面定位的纵向重复性及血管定量分析示例。（A）对同一只麻醉小鼠在第0天（第1周）和第7天（第2周）使用脑定位系统靶向同一冠状面获取的超分辨率显微成像（ULM）血管密度图（比例尺 = 1 cm）。两张图的叠加显示血管信号具有高度空间一致性，表明跨实验会话的切面定位具有良好的可重复性。（B,C）从两个感兴趣区域提取的血管参数代表性定量结果：左侧体感皮层（S1BF，B）和左侧丘脑（C）。对于每个区域，展示第0天的血管密度图（比例尺 = 0.5 cm），并辅以箱须图显示第0天和第7天血管半径（µm）、流速（mm/s）和流量（mm³/s）的分布情况（中位数，第25–75百分位数，须线 = 1.5×四分位距，离群值单独标出）。这些结果展示了本流程从ULM数据中提取形态计量学和血流动力学参数的能力。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

超声定位显微镜（ULM）代表了超声成像领域的一项变革性进展，能够实现超越传统衍射极限的微血管结构超分辨率可视化。本文讨论了ULM实验流程中的关键步骤，提出了可能的改进方法与故障排除策略，探讨了该技术的局限性，评估了其相较于其他成像模态的重要性，并分析了其在生物医学研究中的意义与潜在应用。

ULM 方案中的关键步骤

超分辨率显微成像（ULM）的成功实施包含多个关键步骤，其影响如图7所示。其中最重要的步骤之一是微泡的给药，因为微泡的浓度和输送质量会直接影响成像结果。需要达到最佳浓度，以在空间分辨率和可检测性之间实现平衡。给药不足，例如导管位置不佳或外渗，可能导致血管信号极低以及重建不完整，如图7B所示，仅有少量微泡进入血液循环。高帧率成像（通常在千赫兹范围内）对于捕捉微泡的快速运动并实现帧间可靠追踪至关重要。采集过程中任何不稳定性，例如由呼吸引起的运动、固定不良或麻醉不足，都会降低定位精度。这一点在图7C中有所体现，采集期间过度运动导致生成的密度图模糊且无法使用。

微泡定位与追踪依赖于先进的图像处理算法，这些算法可检测单个微泡，实现亚像素级定位，并以超衍射精度重建轨迹。即使采用适当的图像采集与处理方法，解剖因素（如颅骨引起的像差）仍可能影响图像质量。在经颅成像中，尤其是在老年小鼠中，颅骨增厚可引入声学畸变。这会导致矢状缝下方出现特征性的阴影伪影，在该区域无法检测到任何微泡，如图7D所示。此类像差会降低信噪比，除非采用自适应滤波或优化探头放置位置进行校正，否则可能遮蔽血管结构。

当所有步骤均成功执行时，可获得高质量的超分辨率显微血管成像图，如图7A所示，该图通过经颅方法重建出致密且分辨清晰的血管网络。

图 7：小鼠ULM成像质量的参考与故障排查示例。 图（A）显示在年轻成年小鼠中获取的高质量经颅ULM微泡（MB）密度图，展示了在整个冠状面上成功的血管映射。图（B）展示了一个因微泡外渗或静脉通路不足导致血管信号差的例子，结果表现为微泡检测稀疏。图（C）显示因动物过度运动而影响成像质量的采集结果，产生模糊且无法解读的密度图。图（D）突出显示在老年小鼠中常见由颅骨引起的声学像差，表现为矢状缝下方无微泡检测的阴影锥形区域，这是由于信噪比降低所致。这些示例可作为识别和解决ULM成像中常见实验伪影的视觉参考。比例尺：1 mm。请点击此处查看该图的高清版本。

方法的局限性

尽管超分辨率显微超声（ULM）具有诸多优势，但其本身存在一些局限性，影响了其适用性。在二维成像中，血管偏出成像平面是一个显著问题，因为延伸至成像平面之外的血管无法被充分重建，导致血管图谱不完整。这一局限性可通过转向容积式（三维）成像方法加以缓解²²，但会增加计算复杂度。静脉插管操作也构成技术障碍，尤其在小型动物模型中，实现稳定的微泡输送在技术上具有挑战性。微泡的稳定性同样是一个限制因素，特别是在长时间成像过程中。由于微泡血液循环半衰期较短，可能需要重复推注或持续输注方案，以在整个数据采集期间维持足够的对比度。运动伪影仍然是一个重大问题，尤其对于清醒状态的受试对象，即使微小的不自主运动也可能破坏超分辨率成像质量。最后，ULM的成像深度本质上受限于超声波的衰减。虽然在高频（例如15 MHz）下对啮齿类动物成像通常不会出现此问题，但在猪或非人灵长类等较大动物中则更具挑战性。在这些情况下，可能需要使用较低频率的探头以获得足够的成像深度，但这会牺牲空间分辨率——凸显了在将ULM应用于更大体型的临床前模型时，必须权衡深度与细节之间的关键取舍。

超分辨显微镜（ULM）相较于现有方法的重要性

超声定位显微镜（ULM）相较于传统成像方式具有显著优势，尤其在微血管成像方面表现突出。其最显著的优势之一是能够突破传统超声的衍射极限，实现与双光子显微镜等光学技术相当的空间尺度下的亚衍射成像。然而，与这些光学方法不同的是，ULM具备更深的组织穿透能力，可无创地获取原本难以可视化的脑区结构信息。

超分辨显微超声成像（ULM）还具备功能成像能力，可对血流速度、灌注动力学及血管重塑进行定量评估。这些特性使其非常适用于研究神经血管网络中的生理过程和病理变化。与磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）相比，ULM 成本更低，无需复杂的基础设施，且避免了具有已知毒性风险的对比剂的使用，而是依赖安全性良好的充气微泡作为造影剂。

高空间分辨率和高时间分辨率的结合，使超分辨率显微成像（ULM）在多种研究应用中具有重要价值。在针对微血管结构和深部脑核团的研究中，该技术尤为强大，而传统成像方法在这些领域往往存在局限。此外，与需要组织固定和染色的组织学方法不同，ULM能够在活体动物中实现实时成像，支持纵向研究设计以及药物干预等动态实验操作。

除了静态血管成像外，超分辨率显微成像（ULM）还能通过以极高的空间和时间精度捕捉脑血流动力学，实现高分辨率的功能成像。近期研究进展已证明其在啮齿类动物全脑功能神经成像中的可行性，揭示了在分布广泛的脑网络中，毛细血管水平上由刺激诱发及自发的、依赖于活动的血流变化²。这使得ULM成为功能研究的有力工具，有效弥合了介观尺度血流动力学成像与神经元活动图谱之间的鸿沟。

可用性、效率和可重复性考虑因素

本方案中描述的超分辨率显微成像（ULM）工作流程已针对不同实验设置下的易实施性和可重复性进行了优化。通过使用市售组件，包括经美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的微泡造影剂以及标准的啮齿类动物麻醉流程，确保了该技术的广泛可及性。此外，整个数据处理流程被集成于专用软件（IcoLab）中，通过自动完成微泡定位、轨迹重建和图像图谱生成等复杂步骤，显著提升了操作便捷性。这一简化的用户界面减少了对自定义代码的需求，最大限度地降低了人为干预，有助于在不同用户和实验之间获得一致的结果。尽管高分辨率ULM处理在计算上较为密集，特别是对于长时间采集或三维体数据，但批量处理工具和GPU加速可显著缩短分析时间。该方案的模块化设计也有助于提高可重复性，研究人员可在保持稳健分析框架的同时，精细调整采集和处理参数。本方案还包含一个专门章节，介绍如何利用IcoScan和IcoStudio进行探头定位，使用户能够在不同成像会话中将探头精确地重新定位至相同的成像切面，定位精度约为100 µm。这一功能在纵向研究中尤为重要，因为精确的空间一致性对于随时间追踪血管变化至关重要。上述特性共同降低了新用户的学习门槛，并支持ULM技术在探索性研究和纵向成像研究中的规模化应用。

结论

本方案介绍了一种在啮齿类动物脑成像中实施超声定位显微镜（Ultrasound Localization Microscopy, ULM）的完整工作流程，涵盖手术准备、微泡注射、图像采集以及利用专为临床前研究优化的标准化采集与分析平台进行高分辨率血管图谱构建。ULM 是生物医学成像领域的一项重大进展，能够在活体中以前所未有的细节实现微血管系统的超分辨率可视化。与现有的成像方式相比，ULM 具备高空间分辨率、功能性血流定量分析以及操作便捷性的独特结合，特别适用于血管发育、神经血管耦合及疾病病理生理学的研究。随着该技术的不断成熟，ULM 有望成为临床前研究乃至未来临床神经成像应用中的核心技术手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
动物体温控制器（带直肠探针的加热板）	Physitemp	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, France	Antisedan	5 mg/mL 注射液
C57BL/6 小鼠	Janvier Labs	SC-C57J-M	8 周龄雄性 C57BL/6Rj 小鼠
牙科钻机	Foredom, USA	K.1070 高速旋转微型电机套件
脱毛膏	Vichy	N/A
眼药膏	TVM, UK	Ocry-gel
毛发修剪器	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
IcoLab 处理软件（v 1.2.0.0）	Iconeus, France	IcoLab
Iconeus One Xpand 配置	Iconeus, France	IconeusOne Xpand
IcoPrime 15MHz 探头	Iconeus, France	IcoPrime-15MHz Probe
IcoScan 采集软件（v1.9.0）	Iconeus, France	IcoScan
IcoStudio 分析软件（v2.2.0）	Iconeus, France	IcoStudio
碘溶液	Mylan, France	N/A
异氟烷麻醉工作站	Minerve, Esternay, France	N/A
氯胺酮	Virbac, France	Ketamine1000	100 mg/mL 注射液
美洛昔康	Boehringer Ingelheim	Metacam	0.5 mg/mL 注射液
针头	Terumo, France	AN*1838R1	18 G × ½” 针头，带 8” 管路
生理盐水	Laboratoire Gilbert Physiodose, Pharmacy, France	N/A
手术刀	DREXCO medical, France	80011
SonoVue 微泡造影剂	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
刮刀	Phymed, France.	K.1070 High Speed Rotary Micromotor Kit
Sprague-Dawley Rj:Han 大鼠	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - Sprague Dawley 雄性大鼠，体重 200–300 g
立体定位仪	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	配备小鼠适配器 （货号：922）和非损伤性耳杆（货号：922）
注射器	DREXCO medical, France	2058
超声耦合剂	DREXCO medical, France	Medi'Gel
带翼输液器	Terumo, France	SV*27EL
2% 赛拉嗪	Bayer, France	Rompun	20 mg/mL 注射液