无饲养层且成分明确的脐血祖细胞重编程为诱导多能干细胞及类卵裂球干细胞

摘要

本方案概述了在无异种成分（XF）、无饲养层（FF）条件下，通过附加体介导的重编程方法，将人脐带血（CB）髓系祖细胞高效诱导为常规人诱导性多能干细胞（hiPSC）的化学定义体系。这些XF/FF条件下获得的脐带血来源hiPSC（XF-hiPSC）可被高效逆转为类似卵裂球的Tankyrase/PARP1抑制剂调控的 naive 态干细胞（TIRN-SC），具有增强的分化潜能及种间嵌合能力。

摘要

人脐血髓系祖细胞重编程为高保真度人诱导性多能干细胞（hiPSC）状态可实现 使用非整合型附加体质粒和基质信号实现。这些 传统的、已启动的脐带血来源的hiPSC细胞系可经化学方法高效地逆转为类似卵裂球的Tankyrase/PARP状态 具有功能全能性的抑制剂调控型 naive 干细胞（TIRN-SC）状态 PARP调控的TIRN-SCs是一类具有高表观遗传可塑性、稳定的表观基因组印记的人类干细胞，其分化潜能优于传统的谱系预置型hiPSCs。此处， 优化的XF/FF方法概述，用于高效间充质 基质激活的CD34+ CD33+脐血细胞的附加体质粒重编程 将髓系祖细胞重编程为常规XF/FF hiPSC。 TIRN回复可重复地增强XF/FF常规hiPSC获得转录、表观遗传和 功能特征分析显示，卵裂期人类胚胎细胞的谱系启动基因表达降低。我们验证了经TIRN逆转的脐血来源的XF-hiPSC 显示出在定向多谱系分化方面的显著改善 分化（包括造血和血管谱系）在广泛范围内 遗传上独立背景的组合。这些方法用于 生成符合cGMP标准的TIRN-SC细胞系的第一步 临床级HLA定义的“通用”供体TIRN-SC（UTIRN-SC）库 UTIRN-SC细胞系的建立及其分化可塑性的提升 来自CD34+ CD33+ 脐血祖细胞的研究可能对再生医学产生重大影响 医学。例如，UTIRN-SCs 可用于建立组织库 HLA 定义的冷冻保存心脏、血管和神经供体 多谱系全面的前体细胞 "现成的" 细胞治疗

引言

尽管人类诱导多能干细胞 人诱导多能干细胞（hiPSCs）为个性化细胞治疗提供了广阔前景，但其临床应用仍面临诸多重大挑战，包括致瘤性、免疫原性以及表型和功能上的异质性¹，这会影响其安全性、有效性和成本效益。此外，由传统始发态hiPSC系衍生的谱系定向祖细胞在不同细胞系间的分化效率存在高度变异性²，且表现出有限的 体内 移植与功能。然而，通过使用优化的重编程方法，这些局限性可以被克服³ 或替代性干细胞状态^4,5.

尽管非病毒附加体型重编程将皮肤或血液体细胞转化为hiPSC的效率 较低（约0.01%–2%）⁶在间充质基质干细胞-祖细胞（MSC）激活的共培养条件下，可实现高度优化的四因子重编程，其总体效率可达50%⁷在此系统中，通过可溶性和接触依赖性基质信号加速了脐血髓系祖细胞的细胞重编程。与传统的成纤维细胞来源的hiPSC相比，经基质预处理（SP）的附加体质粒脐血来源hiPSC系可更高效地分化为血管祖细胞（VP）。^3,

方案

所有重编程实验均遵循美国国家科学院（National Academy of Sciences）和国际干细胞研究学会（International Society of Stem Cell Research, ISSCR）发布的指南。人诱导多能干细胞（hiPSC）的生成所涉及的供体细胞采集方案及供体知情同意书，均已获得约翰斯·霍普金斯大学（Johns Hopkins University, JHU）机构审查委员会（Institutional Review Board, IRB）的批准。所有实验均在约翰斯·霍普金斯大学机构干细胞研究监督委员会（Institutional Stem Cell Research Oversight, ISCRO）的监管下进行，并符合机构关于知情同意和来源评估的标准。此外，所有涉及动物的使用和手术操作均严格按照经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（Institute of Animal Care and Use Committee, IACUC）批准的协议执行。所有涉及动物操作的实验（例如，向NOD.Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ（NOG SCID）小鼠（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）进行皮下/肌肉内注射以开展畸胎瘤分析，以及将胚胎移植至ICR假孕小鼠的囊胚移植实验）均已通过约翰斯·霍普金斯大学IACUC的审查与批准。上述审查内容包括对人道处死、人道饲养条件以及减轻动物不适的适当措施的评估....

结果

该方案优化了已发表的方法，利用附加体型载体和基质信号，高效地将髓系祖细胞重编程为高保真引发表观多能性状态⁷. 该方案（图1) 概述了用于人脐带血CD34+细胞经XF/FF基质细胞预处理后附加体质粒重编程的明确定义方法⁺ 将前体细胞重编程为XF-hiPSC，并指导如何验证其功能 通过 定向造血-血管特化，随后在LIF-3i/MEF条件下逆转为类胚细胞样的TIRN干细胞。

采用此优化方案，hiPSC集落在2-3周内以高频率（>7%）出现（图2A，B）。与其他非整合重编程方法⁶（例如仙台病毒、mRNA转染）相比，本方法在后续TIRN逆转过程中更具成本效益且可重复性更高。通过PCR检测，在传代8-20次后确认使用附加体型载体重编程的非XF hiPSC细胞系中无外源基因残留

讨论

Zambidis 研究团队最初报道了一种高度优化的四因子附加体质粒法，可将谱系定向的脐血髓系祖细胞重编程为脐血来源的人诱导多能干细胞（CB-hiPSC），在纯化的附加体质粒表达细胞中，其总体效率可达50%⁷。本文中，我们介绍了一种在无饲养层/无异源成分（XF/FF）基质细胞预处理条件下改良的原始人脐血祖细胞附加体质粒重编程方案。该方法利用了谱系定向的CD33⁺CD45⁺CD34⁻髓系细胞增强的重编程能力，通过暴露于可溶性及接触依赖性的间充质基质细胞信号，实现快速且近乎完全的非整合型重编程。

使用传统的hiPSC细胞系进行再生医学研究受到限制，主要原因是其分化效率高度可变，且下游前体细胞的体内功能较差。影响传统hiPSC功能多能性的一个关键因素在于，它们与已定型的鼠类植入后上胚层干细胞（mEpiSC）具有共性，并表现出本质上已定向谱系、功能受限的多能性²²。传统hiPSC会进入一系列定型的多能状态，表现出高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amaxa Biosystems Nucleofector II	Lonza	AAB-1001
抗 CD143 (BB9) 抗体，APC 标记	BD Biosciences	557929	每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD144 抗体，PE 标记	BD Biosciences	560410	每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD146 抗体，PE 标记	BD Biosciences	550315	每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD184/CXCR4 抗体，APC 标记	BD Biosciences	555976	每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD31 抗体	BD Biosciences	550389	免疫荧光检测中用封闭液稀释至 1:100
抗 CD31 抗体，APC 标记	eBioscience	17-0319-42	每项检测（FACS）使用 2 µL
抗 CD34 抗体，APC 标记	BD Biosciences	555824	每项检测（FACS）使用 5 µL
抗 CD45 抗体，PE 标记	BD Biosciences	555483	每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 NANOG 抗体，PE 标记	BD Biosciences	560483	每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 OCT4 抗体，PE 标记	R&D Systems	IC1759P	每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 SOX17 抗体，Alexa488 标记	BD Biosciences	562205	每项检测（FACS）使用 5 µL
抗 SOX2 抗体，PE 标记	R&D Systems	IC2018P	每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 SSEA-4 抗体，APC 标记	R&D System	FAB1435A	每项检测（FACS）使用 5 µL
抗 SSEA-4 GloLIVE 抗体，NL493 标记	R&D System	NLLC1435G	按 1:50 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
抗 TRA-1-60 A488 标记试剂盒	ThermoFisher Scientific	A25618
抗 TRA1-60 抗体，PE 标记	BD Biosciences	560193	每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 TRA-1-60 GloLIVE 抗体，NL557 标记	R&D Systems	NLLC4770R	按 1:50 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
抗 TRA-1-60 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记	Stemgent	09-0068	按 1:100 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
抗 TRA1-81 抗体，PE 标记	BD Biosciences	560161	每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 TRA-1-81 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记	Stemgent	09-0069	按 1:100 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
CD31 MicroBead 试剂盒，人源	Miltenyi Biotec	130-091-935
CD34 MicroBead 试剂盒，人源	Miltenyi Biotec	130-046-702
CD34+ 混合供体， 脐带血，100 万个细胞	AllCells	CB, CR, CD34+, Mixed, PS, CS10, 1M	替代细胞来源包括胎肝、成人骨髓和动员的外周血
CF1 小鼠	Charles river	023
CHIR99021	R&D System	L5283	用 DMSO 重悬至 100 mM
Corning Costar 组织培养处理 6 孔板	Corning	3506
Corning Synthemax II-SC 基质，10 mg 瓶装	Corning	3535	以 5 μg/cm2 使用，作为 Corning 3978 的替代品
Corning Synthemax-R 6 孔板	Corning	3978	已停产，由 3535 取代
Costar 6 孔透明平底超低吸附 6 孔板	Corning	3471
Countess 细胞计数板	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess 自动细胞计数仪	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CryoStore CS10	StemCell Technologies	100-1061
DII-Ac-LDL	Thermo Fisher Scientific	L3484	使用浓度为 5–15 µg/mL
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 补充剂	Thermo Fisher Scientific	10565018
DMEM/F-12，含 HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma Aldrich	D2650
DR4 小鼠	The Jackson Laboratory	3208
Essential 8 (E8) 培养基	StemCell Technologies	5940
胎牛血清 (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30071.03
FIX & PERM 细胞通透化试剂盒	Thermo Fisher Scientific	GAS004
佛司可林 (Forskolin)	Stemgent	04-0025	用 DMSO 重悬至 100 mM
明胶（猪源）	Sigma Aldrich	G1890-100G	溶于水后高压灭菌
人 CD34+ 细胞核转染 试剂盒	Lonza	VPA-1003
同型对照小鼠 IgG1，PE 标记	BD Biosciences	554680
同型对照小鼠 IgG2a，PE 标记	BD Biosciences	558595
同型对照大鼠 IgG2b，PE 标记	R&D Systems	IC013P
KnockOut 血清替代物	Thermo Fisher Scientific	10828-028
L-抗坏血酸	Millipore Sigma	A8960
L-谷氨酰胺 (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-081
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
Matrigel	Corning	356237	在 48 孔板中每孔使用 200 µL
MEM 非必需氨基酸 (MEM NEAA) (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
MethoCult SF H4436	StemCell Technologies	04436
MidiMACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302
mTeSR1 培养基	StemCell Technologies	85850
Nalgene 冻存管	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
4% 甲醛溶液（PBS 配制）	Thermo Fisher Scientific	J19943.K2	用 PBS 稀释至所需浓度
PD0325901	Sigma Aldrich	PZ0162	用 DMSO 重悬至 100 mM
青霉素/链霉素 (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
pEP4 E02S EM2K 附加体	Addgene	20923	质粒在 TOP10 E. coli (Invitrogen) 中扩增，并使用 QIAGEN 质粒 Maxi 试剂盒纯化。
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
Poietics 人源间充质干细胞	Lonza	PT-2501	第 2 代 75 万个细胞可按制造商说明解冻并传代 1–2 代后使用或进行二次冻存
普莫瑞胺 (Purmorphamine)	Stemgent	04-0009	用 DMSO 重悬至 10 mM
重组 Activin A	Peprotech	120-14E	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人 FGF2	Peprotech	100-18B	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人碱性 FGF (bFGF)	Peprotech	100-18B	在 PBS 中含 0.1% 牛血清/人血清白蛋白中重悬至 100 µg/mL
重组人 FLT3 配体	R&D Systems	308-FKHB 或 308E-GMP	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人胰岛素	Biogems	10-365
重组人 Kit 配体	R&D Systems	BT-SCF 或 BT-SCF-GMP	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人 LIF	Peprotech	300-05	在 PBS 中含 0.1% 牛/人血清白蛋白中重悬至 100 µg/mL
重组人 TGFβ1	Peprotech	100-21	在 PBS 中含 0.1% 牛/人血清白蛋白中重悬至 100 µg/mL
重组人血小板生成素	R&D Systems	288-TPN 或 288E-GMP	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人转铁蛋白	Millipore Sigma	T3705
重组人 BMP4	Peprotech	120-05	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
SB431543	Selleckchem	S1067	用 DMSO 重悬至 10 mM
SIGMAFAST，碱性磷酸酶显色底物，片剂	Millipore Sigma	B5655	1 片溶解于 10 mL 纯化水中
亚硒酸钠	Millipore Sigma	S5261
Stemolecule Y27632 溶液	Stemgent	04-0012-02	ROCK 抑制剂溶液 (10 mM)
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Thermo Fisher Scientific	A11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)	Thermo Fisher Scientific	A1067501	将 5 mL StemPro MSC SFM XenoFree 补充剂与 500 mL StemPro MSC SFM 基础培养基混合配制 XF-MSC 培养基。分装后的培养基可在 -20°C 冻存。
StemSpan SFEM	StemCell Technologies	9600
Thermo Scientific Mr. Frosty 冻存容器	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
欧洲荆豆凝集素 I (UEA-1)，生物素标记	Vector Laboratories	B-1065-2	荧光检测中用封闭液稀释至 1:200
VEGF	Peprotech	100-20	用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
Versene 溶液	Thermo Fisher Scientific	15040066
无饲养层基质 Vitronectin XF	StemCell Technologies	7180	用 CellAdhere 稀释缓冲液稀释至 40 µL/mL
XAV939	Sigma Aldrich	X3004	用 DMSO 重悬至 100 mM
β-巯基乙醇	Thermo Fisher Scientific	21985-023	避光