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无饲养层且成分明确的脐血祖细胞重编程为诱导多能干细胞及类卵裂球干细胞

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DOI：

10.3791/68613

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2025年8月22日

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案概述了在无异种成分（XF）、无饲养层（FF）条件下，通过附加体介导的重编程方法，将人脐带血（CB）髓系祖细胞高效诱导为常规人诱导性多能干细胞（hiPSC）的化学定义体系。这些XF/FF条件下获得的脐带血来源hiPSC（XF-hiPSC）可被高效逆转为类似卵裂球的Tankyrase/PARP1抑制剂调控的 naive 态干细胞（TIRN-SC），具有增强的分化潜能及种间嵌合能力。

摘要

人脐血髓系祖细胞重编程为高保真度人诱导性多能干细胞（hiPSC）状态可实现 使用非整合型附加体质粒和基质信号实现。这些 传统的、已启动的脐带血来源的hiPSC细胞系可经化学方法高效地逆转为类似卵裂球的Tankyrase/PARP状态 具有功能全能性的抑制剂调控型 naive 干细胞（TIRN-SC）状态 PARP调控的TIRN-SCs是一类具有高表观遗传可塑性、稳定的表观基因组印记的人类干细胞，其分化潜能优于传统的谱系预置型hiPSCs。此处， 优化的XF/FF方法概述，用于高效间充质 基质激活的CD34+ CD33+脐血细胞的附加体质粒重编程 将髓系祖细胞重编程为常规XF/FF hiPSC。 TIRN回复可重复地增强XF/FF常规hiPSC获得转录、表观遗传和 功能特征分析显示，卵裂期人类胚胎细胞的谱系启动基因表达降低。我们验证了经TIRN逆转的脐血来源的XF-hiPSC 显示出在定向多谱系分化方面的显著改善 分化（包括造血和血管谱系）在广泛范围内 遗传上独立背景的组合。这些方法用于 生成符合cGMP标准的TIRN-SC细胞系的第一步 临床级HLA定义的“通用”供体TIRN-SC（UTIRN-SC）库 UTIRN-SC细胞系的建立及其分化可塑性的提升 来自CD34+ CD33+ 脐血祖细胞的研究可能对再生医学产生重大影响 医学。例如，UTIRN-SCs 可用于建立组织库 HLA 定义的冷冻保存心脏、血管和神经供体 多谱系全面的前体细胞 "现成的" 细胞治疗

引言

尽管人类诱导多能干细胞 人诱导多能干细胞（hiPSCs）为个性化细胞治疗提供了广阔前景，但其临床应用仍面临诸多重大挑战，包括致瘤性、免疫原性以及表型和功能上的异质性1，这会影响其安全性、有效性和成本效益。此外，由传统始发态hiPSC系衍生的谱系定向祖细胞在不同细胞系间的分化效率存在高度变异性2，且表现出有限的 体内 移植与功能。然而，通过使用优化的重编程方法，这些局限性可以被克服3 或替代性干细胞状态4,5.

尽管非病毒附加体型重编程将皮肤或血液体细胞转化为hiPSC的效率 较低（约0.01%–2%）6在间充质基质干细胞-祖细胞（MSC）激活的共培养条件下，可实现高度优化的四因子重编程，其总体效率可达50%7在此系统中，通过可溶性和接触依赖性基质信号加速了脐血髓系祖细胞的细胞重编程。与传统的成纤维细胞来源的hiPSC相比，经基质预处理（SP）的附加体质粒脐血来源hiPSC系可更高效地分化为血管祖细胞（VP）。3,5SP-CB-iPSC来源的VP表现出更真实的胚胎期VP转录特征、更低的衰老水平以及对DNA损伤的更低敏感性3,4SP-CB-iPSC来源的VP也表现出更强的稳健性 在体 相较于传统的hiPSC来源的VP，在视网膜缺血-再灌注损伤的成年免疫缺陷小鼠中，经全身或直接移植至玻璃体腔后具有更强的植入能力3,4.

Zimmerlin 等人建立了一种两步化学重编程系统（“LIF-5i -> LIF-3i）可将已启动的常规人类多能干细胞转变为具有增强多向分化潜能的TIRN-SC状态5分化的TIRN-SC来源的血管前体细胞表现出更高的功能活性、更强的基因组稳定性以及更优的性能 体内 移植能力增强，表现为迁移至缺血性视网膜深层神经层并实现再血管化的能力提高4TIRN-SC 经历了蛋白质基因组重编程，获得功能性杂合胚细胞样状态，并在种间嵌合体实验中表现出高贡献能力8TIRN-SC 维持了 DNMT1 的表达，并对 CpG 甲基化的基因组印记区域具有抵抗侵蚀的保护作用。有趣的是，SP-CB-hiPSC 比其他来源的 hiPSC 更高效地重编程为 TIRN-SC 通过 替代的、效率较低的方法5,9.

因此，TIRN-SCs 是一种具有增强的多谱系分化能力和高效嵌合体贡献能力的替代性干细胞状态。进一步优化
在明确且符合cGMP规范的培养条件下进行TIRN-SC重编程，将有助于生成多种功能性强、可移植的细胞类型与组织，用于治疗用途。为满足对成本效益高的治疗用前体细胞的需求，可应用这些方法，利用HLA定义的CD34+细胞生成符合cGMP标准的“通用供体”TIRN-SC（UTIRN-SC）细胞库。+ 造血CB或外周血祖细胞。HLA定义的UTIRN-SC来源祖细胞可满足更多需要立即进行多谱系复杂组织再生的患者的临床需求。

临床骨髓移植（BMT） 所建立的范式可为来自国家供体登记库中部分HLA匹配或HLA单倍型相同的造血干细胞的UTIRN-SC库的建立提供指导。对包括美国在内的18个国家中排名前10的单倍型进行预测性全球计算分析，此类hiPSC“单倍型库”可实现平均68.4%的患者覆盖率10。一个明确的UTIRN-SC库 不仅可提供谱系定向的前体细胞，还可支持在家畜（如猪）中利用种间囊胚互补系统进行治疗性TIRN-SC应用，以生成完整器官11,12，包括生成可诱导耐受的造血前体细胞，从而减少遗传多样性广泛人群（如美国）中的移植物排斥反应。

这种用于生成具有TIRN能力的无饲养层/无异源成分（XF/FF）人诱导多能干细胞（hiPSC）系的改良重编程方案，是建立未来符合cGMP标准的通用TIRN-SC细胞库的第一步。本方案详细阐述了逐步的基质启动型重编程过程，以及将人脐带血髓系前体细胞重编程为常规无饲养层hiPSC系的功能验证流程。这些无饲养层hiPSC可高效逆转为TIRN-SC，其效率与非无饲养层方法相当7，并获得了无限制的功能性多能性，包括相较于同源启动型无饲养层hiPSC，形成结构良好且谱系偏向性降低的畸胎瘤能力显著增强4,5,9。我们还提供了验证TIRN逆转后XF-hiPSC的实验方案，证实其在向造血-血管谱系直接分化方面具有更优且稳定的分化能力。

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方案

所有重编程实验均遵循美国国家科学院（National Academy of Sciences）和国际干细胞研究学会（International Society of Stem Cell Research, ISSCR）发布的指南。人诱导多能干细胞（hiPSC）的生成所涉及的供体细胞采集方案及供体知情同意书，均已获得约翰斯·霍普金斯大学（Johns Hopkins University, JHU）机构审查委员会（Institutional Review Board, IRB）的批准。所有实验均在约翰斯·霍普金斯大学机构干细胞研究监督委员会（Institutional Stem Cell Research Oversight, ISCRO）的监管下进行，并符合机构关于知情同意和来源评估的标准。此外，所有涉及动物的使用和手术操作均严格按照经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（Institute of Animal Care and Use Committee, IACUC）批准的协议执行。所有涉及动物操作的实验（例如，向NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ（NOG SCID）小鼠（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）进行皮下/肌肉内注射以开展畸胎瘤分析，以及将胚胎移植至ICR假孕小鼠的囊胚移植实验）均已通过约翰斯·霍普金斯大学IACUC的审查与批准。上述审查内容包括对人道处死、人道饲养条件以及减轻动物不适的适当措施的评估。

1. 无饲养层无异源成分的hiPSC附加体质粒重编程

  1. 供体造血祖细胞制备
    1. 使用冻存的CD34+ 造血干细胞/祖细胞（例如，1x106 新生儿脐带血细胞）在分娩后立即使用，或将冻存管置于液氮储存罐中保存。确保细胞在运输和操作过程中始终处于冷冻状态。
      注意：也可在采集后立即使用经批准方案进行CD34富集的非冷冻保存供体细胞。
    2. 在水浴中解冻细胞前，应在生物安全柜内轻轻打开已灭菌的冻存管，释放管内可能存在的滞留气体，然后迅速拧紧管盖。
    3. 将小瓶置于37 °C水浴中1至2分钟，轻轻摇动小瓶直至几乎无冰残留。从小瓶从水浴中取出，并彻底进行消毒（即， 70% 乙醇喷雾）
      注意：所有步骤均需采用适当的无菌技术，并在无菌生物安全柜内进行。
    4. 轻柔缓慢地将细胞转移至一个空的50 mL无菌锥形管中。用1 mL冷的无异源造血祖细胞（XF-HP）扩增培养基洗涤冻存管表1）并沿管壁逐滴加入细胞中，轻轻混匀以稀释DMSO冷冻保护剂。
    5. 将离心管直立放置于管架中静置30秒，缓慢地（逐滴加入）加入2 mL冷的XF-HP培养基。在加入培养基的同时轻轻摇动细胞悬液。重复此步骤两次，依次再加入4 mL、8 mL和4 mL冷的XF-HP培养基（最终总体积达20 mL）。将稀释后的细胞在4 °C下以100 × g离心10分钟。
      注意：在冷冻保护剂溶液中以及稀释过程中，切勿反复吹打细胞。将XP-HP培养基逐滴缓慢加入，直至二甲基亚砜（DMSO）至少被稀释10倍。使用预冷的培养基，因为DMSO稀释过程会释放热量。
    6. 在生物安全柜中吸除无细胞上清液。轻轻吹打使细胞沉淀重悬，加入2 mL XF-HP扩增培养基，用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
    7.  将解冻的细胞转移至超低吸附细胞培养多孔板中（例如 将2 mL细胞/XF-HP培养基混合物转移至6孔板的1个孔中。
    8. 用保鲜膜 tightly 包裹培养板以模拟缺氧条件。将培养板放入培养箱中（37 °C，5% CO₂）。2，湿润的环境）。或者，将未包裹的培养板置于含有O₂的培养箱中2 对照（5% O₂）2, 5% CO₂2，湿润的环境）。
    9. 在XF-HP培养基中培养造血祖细胞3天。
  2. 间充质干细胞-祖细胞（MSC）制备
    1. 解冻一份等分试样（0.75 - 1×106 通过将冻存的低代次（p2至p3代）人源间充质干细胞（MSC）冻存管在37 °C水浴中孵育1至2分钟，解冻细胞。轻轻摇动冻存管，直至几乎无冰晶残留。将冻存管从水浴中取出，并用70%乙醇彻底消毒。
      注意： 低代次（p2）人源MSC可通过既定方案从人骨髓中分离获得，或直接购买，并进行冻存。MSC可在核转染前约7-10天解冻，并于核转染前一天经辐照后接种作为饲养层图1）。
    2. 轻柔缓慢地（沿离心管边缘逐滴）将细胞转移至含有冷的无异源无血清间充质干细胞培养基（XF-MSC）的15 mL圆锥形离心管中（表1在生物安全柜内进行操作，将DMSO冷冻保护剂至少稀释10倍（例如， 将1 mL冻存细胞等分试样转移至9 mL XF-MSC培养基中。
    3. 使用1至2 mL冷的XF-MSC培养基冲洗试管，并将冲洗液合并至锥形管中。在4 °C条件下，以100 × g离心稀释后的细胞5分钟。
    4. 在生物安全柜中吸除无细胞上清液。用1 mL XF-MSC培养基轻柔重悬细胞沉淀，用于血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
    5.  将解冻的细胞转移至经组织培养处理的多孔细胞培养板中（例如 每平方厘米5,000-6,000个细胞2 或6孔板每孔约50,000个细胞）。将培养板置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）2，潮湿环境）。在生物安全柜中每2-3天更换一次XF-MSC培养基。
    6. 转染前一天，在生物安全柜中吸除无细胞的上清液。用 PBS 洗涤间充质干细胞一次（每孔 2 mL），吸除 PBS。每孔加入 1 mL 细胞解离试剂（例如 1X 胰蛋白酶-EDTA 溶液），在 37 °C 的 CO₂2 培养箱
    7. 通过加入1 mL XF-MSC培养基（至少2倍稀释）中和消化试剂，并用移液器轻轻吹打形成单细胞悬液。将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中。在100 × g下离心5分钟。  
    8. 吸弃上清液。用1 mL XF-MSC培养基重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
    9. 使用γ射线或X射线辐照装置对传代次数少于5代的间充质前体细胞进行辐照（2,000 rad），随后接种于精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽修饰的合成表面6孔板（2×10⁵细胞/孔）5 每孔细胞数）置于XF-MSC培养基中，将培养板放入培养箱中孵育过夜（37 °C，5% CO₂）。2，湿润的环境）。
  3. 无异源性附加体重编程
    1. 在生物安全柜中，将培养3天的CB HP细胞用XF-HP扩增培养基收集至15 mL锥形管中，200 × g离心5分钟。
    2. 在生物安全柜中吸取无细胞上清液。  轻轻将细胞沉淀重悬于1 mL XF-HP扩增培养基中，用于血细胞计数板或自动细胞计数器进行细胞计数。
    3. 将1x10合并6 扩增的HP细胞与100 µL人CD34+ 细胞核转染溶液（人 CD34）+ 细胞核转染试剂盒）。加入6 µg纯化浓缩的附加体（episome）<5 µL）并使用核转染试剂盒中的塑料移液管小心转移至核转染杯中，避免产生气泡。将转染杯放入核转染仪中，选择程序U-008。
      注意：准备基于EBNA的附加体质粒pCEP4载体pEP4 EO2S EM2K的储备液（OCT4、SOX2、MYC、KLF4) 通过在 TOP10 中进行常规转化 E. 大肠杆菌中扩增质粒，并使用质粒大量提取试剂盒进行纯化。在核转染当天，使用PCR纯化试剂盒对质粒进行纯化和浓缩。 7.
    4. 核转染后立即向电转杯中加入500 µL预热的XF-HP扩增培养基，用无菌移液管将细胞转移至超低吸附细胞培养6孔板的1个孔中，总体积为1 mL XF-HP培养基。
      注意：核转染后的细胞非常脆弱，无法耐受常规1 mL移液器吸头产生的剪切应力。将细胞转移至超低吸附培养板是核转染后促进细胞恢复的步骤，之后再转移至RGD包被的培养板进行最终贴壁。
    5. 用塑料膜 tightly 包裹培养板以模拟缺氧条件。将培养板放入 CO2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2，湿润的环境）。或者，将未包裹的培养板置于含有O₂的培养箱中2 对照（5% O₂）2, 5% CO2，湿润的环境）。孵育4至6小时。
      注意：此步骤可使核转染的 HP 细胞在转移至 MSC 单层细胞前得以恢复。
    6. 在生物安全柜中将细胞收集至15 mL锥形管中。以200 × g离心5分钟。
    7. 在生物安全柜中吸除上清液。用1 mL XF-HP扩增培养基重悬细胞沉淀。将核转染后的HP细胞以约每平方厘米17,500个细胞的密度接种至经辐照的MSC上2 在添加ROCK抑制剂Y-27632（终浓度10 µM）的XF-HP扩增培养基（2 mL/孔）中，接种于RGD包被的培养板中。将培养板置于CO₂培养箱中2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2，湿润的环境）。
    8. 核转染两天后，在生物安全柜中向每孔加入2 mL（等体积）E8培养基。
    9. 每隔一天更换一半体积的培养基，使用 E8 培养基。收集悬浮细胞至 15 mL 圆底离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟，将沉淀的细胞重新加入原培养物中。
    10. 第21天，准备经基底膜铺被处理的6孔板，每孔加入1 mL稀释的玻连蛋白溶液（例如，Vitronectin-XF稀释至40 μg/mL），室温孵育1小时。
    11. 在生物安全柜内使用倒置显微镜手动挑选单个XF-hiPSC克隆。用移液器吹打重悬后，将单个克隆转移至添加ROCK抑制剂Y-27632（终浓度5 µM）的E8培养基中，接种于包被有玻连蛋白的培养板上。将培养板置于CO₂培养箱中2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2，湿润的环境）。
    12. 次日，在生物安全柜中小心地将培养基更换为不含ROCK抑制剂的E8培养基。此后每天更换E8培养基（每孔2 mL）。

2. 人诱导多能干细胞的常规培养与维持

  1. 5至6天后当菌落变大（即直径0.5至1 mm或约80%汇合度）时，在生物安全柜中吸除培养基。
  2. 每孔加入2 mL PBS洗涤细胞，吸除PBS。每孔加入1 mL基于EDTA的细胞解离溶液，在CO2培养箱（37 °C，5% CO2，湿润环境）中孵育5分钟。使用显微镜检查细胞是否已松散贴壁（例如呈发亮的圆形，但仍附着于培养板）。
  3. 在生物安全柜中轻柔吸除解离溶液，避免破坏细胞。
  4. 用1–2 mL添加ROCK抑制剂Y-27632（终浓度5 µM）的E8培养基，通过非剧烈吹打收集细胞，以维持细胞团块。将细胞团块转移至包被有玻连蛋白的（见1.3.11节）6孔细胞培养板（每孔相当于10个菌落或1:10传代）。将培养板放入CO2培养箱（37 °C，5% CO2，湿润环境）中培养。
  5. 每5–7天使用基于EDTA的细胞解离溶液继续传代培养。
    注意：SP-CB-hiPSC重编程通常无需额外的亚克隆或手动挑取菌落，但如果hiPSC克隆中出现形态异常的菌落（例如出现成纤维细胞样自发分化、类胚体形成，或出现异常非扁平菌落），应在生物安全柜内借助显微镜和微量移液器手动挑选正常菌落，或弃去异常克隆。重编程效率低或不稳定者不适用于TIRN-SC逆转。

3. XF-hiPSC 克隆的表型验证

  1. 在长期冻存和用于功能研究之前，按照第2节所述方法，将XF-hiPSC克隆扩增至少5-7代以进行初步验证（图2），并在每个冻存管上记录传代次数。
    注意：低代次XF-hiPSC克隆的初步表征可通过多种检测方法确认，例如碱性磷酸酶活性检测、TRA-1抗原或NANOG免疫检测。
  2. 使用碱性磷酸酶染色对XF-hiPSC进行验证和计数（图2A、B）。
    注意：在表观遗传质粒核转染后第3-5周（P0代），可通过统计第3天接种的单个起始细胞中完全重编程的克隆数量，来确定批量培养中的重编程效率7,13。
    1. 在生物安全柜中吸除培养基。
    2. 用PBS洗涤细胞（每孔2 mL），吸除PBS。加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定细胞，在室温下孵育10分钟。
    3. 根据化学废弃物安全指南，移除并妥善处理多聚甲醛/PBS溶液。
    4.  用PBS洗涤细胞（每孔2 mL），吸除PBS。加入1-2 mL碱性磷酸酶底物溶液，在室温下缓慢振荡孵育10至15分钟。
    5. 用PBS洗涤3次以终止反应。拍照并进行克隆计数。
      注意：避免过长的孵育时间或过高温度，以免导致假阳性染色。
  3. 使用TRA-1抗原免疫染色对XF-hiPSC进行染色验证和计数（图2C）。
    ​注意：对于表观遗传质粒重编程，在早期传代中应使用已发表的方案检测转基因表达及EBNA1载体骨架7。常规验证包括通过G显带进行核型分析（图2D）或基于全基因组芯片的覆盖度检测。基本的多能性功能也可通过畸胎瘤分化方案（图2E）或非定向拟胚体分化的定量多基因表达评分卡进行检测14。
    1. 在生物安全柜中，向重复孔中加入适当浓度的荧光染料偶联活细胞抗体至E8培养基中，对TRA-1-60或TRA-1-81抗原进行免疫染色，孵育30分钟。
    2. 吸除培养基，用E8培养基洗涤两次（每孔2 mL）。
    3. 在E8培养基或酚红-free培养基中拍照并计数。
      注意：也可选择在室温下用2%多聚甲醛/PBS溶液固定细胞10分钟，然后使用标准抗体对TRA-1抗原进行免疫染色。 
  4. 通过流式细胞术验证XF-hiPSC的免疫表型。
    1. 在生物安全柜中吸除培养基。
    2. 用PBS洗涤细胞（每孔2 mL），吸除PBS。加入酶解解离试剂（如Accutase，每孔1 mL），将培养板置于CO2培养箱中（5% CO2，湿润环境）37 °C孵育5分钟。
    3. 加入等体积培养基收集细胞，并通过细胞筛网（40-70 µm滤膜）过滤。在200 x g条件下离心5分钟。
    4. 将细胞沉淀重悬于含5% FBS的PBS中（每孔等量对应1 mL），使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞。每项FACS检测分配约100,000-200,000个细胞至圆底管中（每项检测体积约100 µL）。
    5. 对于细胞外染色，可选使用纯鼠血清进行封闭（每项检测加5 µL，室温孵育5分钟），然后按照制造商说明书加入荧光染料偶联抗体（如TRA-1-81 PE、SSEA4 APC）孵育。用3 mL PBS洗涤，300 x g离心5分钟，重悬于FACS缓冲液（如含5% FBS的PBS）中，并使用FACS仪器获取数据。
      注意：始终使用相应同型对照抗体，并平行染色样本以验证免疫检测蛋白的特异性。
    6. 对于细胞内染色（如NANOG-PE、OCT3/4-PE、SOX2-PE），按照制造商说明书进行固定/通透处理步骤。加入荧光染料偶联抗体或相应的同型对照抗体，使用FACS仪器获取数据。

4. XF-hiPSC 克隆的冷冻保存与解冻

  1. 在长期冻存和用于功能研究之前，将XF-hiPSC克隆扩增至少5-7代以进行初步验证（图2）。在每个冻存管上记录传代次数。
    1. 在生物安全柜中吸除培养基。
    2. 用PBS洗涤细胞（每孔2 mL），吸除PBS。 加入基于EDTA的细胞解离溶液（每孔1 mL），将XF-hiPSC集落解离为细胞团块。将培养板置于CO2培养箱中孵育5分钟（37 °C，5% CO2，湿润环境）。使用显微镜检查细胞是否已松散附着（例如呈现发亮的圆形细胞）。
    3. 轻柔吸除解离溶液，避免破坏细胞单层集落，并用1-2 mL E8培养基通过非剧烈吹打方式收集细胞，以维持细胞团块（每团块含10-50个细胞）。将XF-hiPSC收集至无菌15 mL锥形管中。以200 × g离心5分钟。
    4. 在生物安全柜中吸除上清液。将细胞沉淀重悬于冻存液中（表2，约每毫升对应一个孔的细胞量）。
    5. 将细胞转移至长期储存用的冷冻管中。将冷冻管放入程序降温盒中，并在-80 °C冰箱中过夜冷冻。次日，将冻存管转移至液氮罐中进行长期保存。
  2. 复苏时，预先用玻连蛋白包被培养板（见第1.3.11节）。
    1. 将冻存管放入37 °C水浴中，复苏约1-2分钟。进行表面消毒（即喷洒乙醇）。
    2.  在无菌生物安全柜中，缓慢将XF-hiPSC转移至含有9 mL复苏培养基（表2）的无菌15 mL锥形管中，使细胞缓慢稀释10倍。
      注意：切勿剧烈吹打。
    3. 以200 × g离心5分钟。
    4. 在生物安全柜中吸除 无细胞的上清液。将细胞沉淀重悬于添加ROCK抑制剂的E8培养基（1-2 mL）中（终浓度为5 mM）。
      注意：若不添加Y-27632，将导致细胞复苏后存活率显著降低。
    5. 将复苏后的细胞接种至1或2个预先包被玻连蛋白的6孔板孔中。次日更换为不含ROCK抑制剂的常规E8培养基，用于细胞扩增。

5. 无异源性成分的XF-hiPSC血液血管分化

  1. 使用我们优化的无异源成分造血-血管分化方案对XF-hiPSC进行分化（图3）4。
    ​注意：本方案修改自文献15。
    1. 在传代后1-3天，当XF-hiPSC汇合度达到约40-50%时进行准备。
    2. 在生物安全柜中吸除培养基，并加入2 mL中胚层定向培养基（表2）。
    3. 2天后，在生物安全柜中吸除培养基，并每孔加入2 mL血管分化培养基（表2）。若此步骤中可见大量死亡或漂浮细胞，用2 mL PBS洗涤一次。
    4. 在生物安全柜中每隔一天更换一次血管分化培养基，直至第11天。
      注意：若因细胞密度过高、pH降低导致培养基变黄，可添加1 mL新鲜培养基或每日更换。
  2. 在血管分化培养基中培养7-10天后，使用磁珠细胞分选法从贴壁单层细胞中纯化CD31+或CD34+血管细胞。
    ​注意：每个独立克隆的分化动力学可能不同。需通过FACS分析确定CD31/CD34表达的峰值时间点（图4A）。必须进行磁珠富集前和富集后的FACS分析。此阶段可从上清液中回收造血祖细胞（HP），并使用CD34微珠进行富集。来源于XF-hiPSC的CD34+造血祖细胞可通过甲基纤维素集落形成实验进一步验证（图4B-C）16。
    1. 在生物安全柜中吸除培养基，用PBS洗涤细胞（每孔2 mL），吸除PBS后加入酶解离试剂（如Accutase，每孔1 mL）将hiPSC集落解离为单细胞。将细胞在CO2培养箱（5% CO2，湿润环境）中37 °C孵育5分钟。
    2. 在生物安全柜中加入等体积培养基收集细胞，以200 × g离心5分钟。
    3. 将细胞沉淀重悬于血管分化培养基（表2）中，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞。预留约50,000-100,000个细胞，用于磁珠富集前的FACS检测，使用直接偶联的抗CD31或抗CD34抗体。
    4. 将剩余细胞以300 × g离心5分钟。在生物安全柜中将细胞沉淀重悬于磁珠富集缓冲液（PBS pH 7.2，含0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA）中。
    5. 将细胞通过细胞筛网（40-70 µm滤器）过滤，以300 × g离心5分钟，再重悬于60 µL磁珠富集缓冲液中。
    6. 加入20 µL FcR阻断试剂，随后加入20 µL CD31或CD34微珠，4 °C孵育15-20分钟。
    7. 在生物安全柜中用2 mL磁珠富集缓冲液洗涤细胞，并以300 × g离心5分钟。
    8. 在生物安全柜中将细胞沉淀重悬于1 mL磁珠富集缓冲液中。
    9. 在生物安全柜内，将LS柱置于磁性细胞分选器的磁场中，用3 mL磁珠富集缓冲液洗涤柱子。
    10. 将细胞上样至柱中。 将未标记细胞收集至15 mL锥形管中。用3 mL磁珠富集缓冲液洗涤柱子3次。
    11. 将柱子从分选器上取下，置于新的15 mL锥形管上。
    12. 加入3-5 mL内皮细胞生长培养基冲洗出磁性标记的细胞，以200 × g离心5分钟。
    13. 在生物安全柜中将细胞沉淀重悬于1 mL内皮细胞生长培养基中，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞。预留约50,000个细胞，用于磁珠富集后分选纯度的FACS分析，使用直接偶联的抗CD31或抗CD34抗体。
    14. 分离得到的血管祖细胞（VP）可在纤连蛋白包被（10 µg/mL）的组织培养处理板或培养瓶中，使用内皮细胞生长培养基进一步扩增。

6. XF-hiPSC 功能验证的实验设计指南

  1. 使用已建立的非整合方法（如附加体质粒7,17、仙台病毒18或mRNA19重编程）在最早传代阶段建立经过验证的无饲养层人诱导多能干细胞（XF-hiPSC）储备细胞系。
    注意：不同非整合重编程方法的效率与可靠性比较可参见其他文献6。在早期传代过程中，可通过PCR方法验证附加体质粒或仙台病毒重编程方法中转基因物质的清除情况7,20。转基因残留不符合TIRN-SC生成的要求。
  2. 通过G显带分析或基于全基因组芯片的覆盖度检测方法验证XF-hiPSC克隆的核型正常性9。
  3. 利用DNA甲基化芯片、基因表达芯片或测序方法，验证XF-hiPSC细胞系的基因表达和表观基因组完整性（例如亲本印记、X染色体激活状态）5,11,14。
  4. 通过畸胎瘤分化实验（图2E）、基于RT-PCR芯片的定量拟胚体（EB）分化检测14，或向三个胚层定向分化的实验9，验证XF-hiPSC的基本功能性多能性。
    注意：有关利用显微镜下组织学表征对畸胎瘤实验进行多谱系分化能力及谱系内增殖指数定量分析的方法，可参见其他文献4。向中胚层谱系及血液-血管特化方向的定向分化方案（图4A-C）已有详细描述4,5,9，向定型内胚层的定向分化实验方案也已有报道（图4D）5。向外胚层定向分化的实验示例可参见其他文献4,5。

7. XF-hiPSC 的化学 TIRN 适应

  1. 购买或根据已发表的方案，使用CF1或CF1 × DR4杂交E13.5小鼠胚胎自行制备低代次MEF饲养层细胞9,21在TIRN适应步骤前至少一天，将200,000个MEF饲养细胞接种至经明胶处理（0.1%明胶水溶液，每孔1 mL）的组织培养级6孔板中，每孔接种量为200,000个4,5,9).
  2. 在无饲养层培养系统中（例如 E8 培养基，参见）维持和扩增无转基因的 XF-hiPSC 培养物，并确保其核型经验证正常 表1 用于内部配制）。
  3. 将 E8 培养基更换为 LIF-5i 培养基（每孔 2 mL； 表1在生物安全柜中，当 XF-hiPSC 培养物达到约 50% 汇合度时（即初次接种后 3–5 天）
  4. 第二天，在生物安全柜中用 PBS（每孔 2 mL）洗涤 LIF-5i-适应的 XF-hiPSC 一次，吸除培养基。吸去上清液，每孔加入 1 mL 酶法细胞解离试剂，于 37 °C、CO₂2 培养箱
  5. 在生物安全柜中用移液器轻轻吹打，制成单细胞悬液。每孔加入1 mL LIF-5i培养基中和。将细胞悬液收集至无菌15 mL锥形离心管中。  200 × g 离心 5 分钟。
  6. 在生物安全柜中吸除上清液。用 2 mL LIF-5i 培养基重悬细胞沉淀。
    注意：如果可能，取一部分样品进行细胞计数。使用未添加抑制剂或生长因子的 LIF-5i/LIF-3i 培养基即可中和酶活性。
  7. 用 PBS 洗涤 MEF 培养板两次（每孔 2 mL，6 孔板），然后加入细胞（将 1 孔量的 LIF-5i 适应细胞接种至含 2 mL LIF-5i 培养基的 1 孔 MEF 饲养层细胞中）。
    注意：针对每种独立的 XF-hiPSC 细胞系优化初始接种密度为可选步骤。若前一步骤中已进行细胞计数，则至少接种 1x106 每孔细胞数接种至饲养层上。  将培养板转移至 CO₂ 培养箱中2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2，湿润的环境）。
  8. 在CO₂培养箱中，于MEF上使用LIF-5i培养基培养XF-hiPSC 3-5天2 培养箱（37 °C，5% CO₂）2，湿润的环境）。每天更换LIF-5i培养基。
  9. 当在饲养层上培养 3–5 天后形成圆顶状 TIRN-SC 克隆时，在生物安全柜中吸除培养基。洗涤每孔  用 2 mL PBS 洗涤。
  10. 吸弃 PBS。每孔加入 1 mL 细胞解离液（例如 Accutase）。在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 5 分钟。2 培养箱（5% CO₂）2，湿润的环境）。
  11. 加入1 mL LIF-3i培养基（表1在生物安全柜中，向每孔加入适量培养基以中和消化试剂。轻柔吹打混匀，收集细胞至15 mL离心管中。在200 × g下离心5分钟。
  12. 在生物安全柜中吸除上清液。用LIF-3i培养基（每孔1 mL）重悬细胞，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。以约5 × 10⁵个细胞/孔的密度接种5 在生物安全柜中，将细胞以每孔2 mL LIF-3i培养基接种至明胶包被的6孔板中的经照射MEF上。
    注意：对所有后续传代重复执行步骤 7.12 至 7.16。  在初始的LIF-5i适应性培养后，以较低密度接种LIF-3i培养（2×10⁵）5 细胞/孔），每3-4天传代一次。
  13. 在用于功能研究或冻存之前，将TIRN逆转的XF-hiPSC在LIF-3i培养基中连续传代至少6-7代。记录在无异源成分的启动态培养基（如E8）或LIF-5i/LIF-3i TIRN培养基中的传代次数。
    注意：高传代（例如， >p40）XF-hiPSC 细胞系的效率较低且 不 推荐高代次细胞系常带有染色体或亚染色体水平的缺陷，这些缺陷会 不 与高效的TIRN逆转不兼容，将导致逆转效率低下和培养稳定性受限。此外，使用已进行过多次传代的TIRN培养物 更大 在LIF-3i培养基中传代超过15次 不 推荐 用于功能研究。在LIF-3i培养基中，TIRN回复的XF-hiPSC的功能影响在第7至第15代之间最为显著。

8. 无饲养层/无异源成分 hiPSC 来源 TIRN-SC 定向分化实验设计指南。

  1. 直接将XF/FF hiPSC来源的TIRN-SC应用于既定的定向分化方案中，无需任何预处理 "重新引物”步骤（即， 无需在将TIRN干细胞用于定向分化实验前，将其转换回传统的“启动”状态。
  2. 为评估TIRN对XF-hiPSC的功能影响，应设置处于相同传代次数的同源性子代细胞培养物并行培养。将启动状态/TIRN同源性子代XF-hiPSC培养物在各自培养基中平行维持培养例如，第8天，接种于玻连蛋白上 与. 在 MEF 上使用 LIF-3i），并同时进行畸胎瘤实验（图5），或使用相同的拟胚体或定向分化方案与材料进行分化（图6).
  3. 在可能的情况下，对终末分化的谱系进行功能评估。例如，血管前体细胞可通过蛋白表达、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（LDL）摄取实验以及Matrigel管形成实验进行评估（图7).
    注意：针对CB-hiPSC和TIRN-SC分化而来的VP细胞，可额外进行其他功能检测（如DiI-Ac-LDL摄取、衰老、增殖、迁移实验）， 体外 Matrigel 管形成实验、动物 Matrigel 植入实验、异种移植实验）详见其他文献3,4.
  4. 调整并优化初始接种密度和动力学参数（图6每次分化实验中，针对每个独立的XF-hiPSC克隆进行检测。 
    注意：在定向分化实验中，TIRN逆转的无饲养层人诱导多能干细胞（XF-hiPSC）比启动态的无饲养层人诱导多能干细胞（primed XF-hiPSC）具有更强的增殖能力和分化潜能。TIRN培养体系通常所需的初始接种密度低于E8培养体系，且无需添加抗凋亡补充剂以提高克隆存活率。

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结果

该方案优化了已发表的方法，利用附加体质粒和基质信号，高效地将髓系祖细胞重编程为高保真引发表观多能状态7. 该方案（图1) 概述了用于XF/FF基质细胞诱导的脐血CD34+细胞游离型重编程的明确方法+ 将前体细胞重编程为XF-hiPSC，并指导如何验证其功能 通过 定向造血-血管特化，随后在LIF-3i/MEF条件下逆转为类胚裂球的TIRN干细胞。

采用此优化方案，hiPSC 克隆在 2-3 周内以较高（>7%）频率出现（图 2A，B）。与其他非整合重编程方法6（例如仙台病毒、mRNA 转染）相比，我们发现该方法更具成本效益，并且在后续 TIRN 逆转过程中具有更高的可重复性。通过 PCR 检测，在传代 8-20 次后确认了使用附加体型载体重编程的非 XF hiPSC 系中无外源基因残留

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讨论

Zambidis 研究团队最初报道了一种高度优化的四因子附加体质粒法，可将谱系定向的脐血髓系祖细胞重编程为脐血来源的人诱导多能干细胞（CB-hiPSC），在纯化的附加体质粒表达细胞中，其总体效率可达50%7。本文中，我们介绍了一种在无饲养层/无异源成分（XF/FF）基质细胞预处理条件下改良的原始人脐血祖细胞附加体质粒重编程方案。该方法利用了谱系定向的CD33+CD45+CD34−髓系细胞增强的重编程能力，通过暴露于可溶性及接触依赖性的间充质基质细胞信号，实现快速且近乎完全的非整合型重编程。

使用传统的hiPSC细胞系进行再生医学研究受到限制，主要原因是其分化效率高度可变，且下游前体细胞的体内功能较差。影响传统hiPSC功能多能性的一个关键因素在于，它们与已定型的鼠类植入后上胚层干细胞（mEpiSC）具有共性，并表现出本质上已定向谱系、功能受限的多能性22。传统hiPSC会进入一系列定型的多能状态，表现出高...

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披露

无任何披露事项需要声明。

致谢

本研究工作获得了美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI，项目编号：R01EY032113；ETZ）、马里兰干细胞研究基金（项目编号：2023-MSCRFV-5995；2024-MSCRFV-6248；2025-MSCRFV-0005；2025-R2-MSCRFV-0004；ETZ）以及丽莎·迪恩·莫斯利基金会（ETZ）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaAAB-1001
抗 CD143 (BB9) 抗体，APC 标记 BD Biosciences557929每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD144 抗体，PE 标记 BD Biosciences560410每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD146 抗体，PE 标记 BD Biosciences550315每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD184/CXCR4 抗体，APC 标记 BD Biosciences555976每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 CD31 抗体BD Biosciences550389免疫荧光检测中用封闭液稀释至 1:100
抗 CD31 抗体，APC 标记 eBioscience17-0319-42每项检测（FACS）使用 2 µL
抗 CD34 抗体，APC 标记 BD Biosciences555824每项检测（FACS）使用 5 µL
抗 CD45 抗体，PE 标记 BD Biosciences555483每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 NANOG 抗体，PE 标记BD Biosciences560483每项检测（FACS）使用 10–20 µL
抗 OCT4 抗体，PE 标记R&D SystemsIC1759P每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 SOX17 抗体，Alexa488 标记 BD Biosciences562205每项检测（FACS）使用 5 µL
抗 SOX2 抗体，PE 标记R&D SystemsIC2018P每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 SSEA-4 抗体，APC 标记 R&D SystemFAB1435A每项检测（FACS）使用 5 µL
抗 SSEA-4 GloLIVE 抗体，NL493 标记R&D SystemNLLC1435G按 1:50 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
抗 TRA-1-60 A488 标记试剂盒ThermoFisher ScientificA25618
抗 TRA1-60 抗体，PE 标记BD Biosciences560193每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 TRA-1-60 GloLIVE 抗体，NL557 标记 R&D SystemsNLLC4770R按 1:50 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
抗 TRA-1-60 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记Stemgent09-0068按 1:100 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
抗 TRA1-81 抗体，PE 标记BD Biosciences560161每项检测（FACS）使用 10 µL
抗 TRA-1-81 StainAlive 抗体，DyLight 488 标记Stemgent09-0069按 1:100 稀释使用（活细胞及固定后免疫染色）
CD31 MicroBead 试剂盒，人源Miltenyi Biotec130-091-935
CD34 MicroBead 试剂盒，人源Miltenyi Biotec130-046-702
CD34+ 混合供体， 脐带血，100 万个细胞AllCellsCB, CR, CD34+, Mixed, PS, CS10, 1M替代细胞来源包括胎肝、成人骨髓和动员的外周血
CF1 小鼠Charles river023
CHIR99021R&D SystemL5283用 DMSO 重悬至 100 mM
Corning Costar 组织培养处理 6 孔板Corning3506
Corning Synthemax II-SC 基质，10 mg 瓶装Corning3535以 5 μg/cm2 使用，作为 Corning 3978 的替代品
Corning Synthemax-R 6 孔板Corning3978已停产，由 3535 取代
Costar 6 孔透明平底超低吸附 6 孔板Corning3471
Countess 细胞计数板Thermo Fisher ScientificC10228
Countess 自动细胞计数仪Thermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoStore CS10StemCell Technologies100-1061
DII-Ac-LDLThermo Fisher ScientificL3484使用浓度为 5–15 µg/mL
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基） Thermo Fisher Scientific11995065
DMEM/F-12，含 GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific10565018
DMEM/F-12，含 HEPESThermo Fisher Scientific11330032
DMSO（二甲基亚砜）Sigma AldrichD2650
DR4 小鼠The Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) 培养基StemCell Technologies5940
胎牛血清 (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
FIX & PERM 细胞通透化试剂盒Thermo Fisher ScientificGAS004
佛司可林 (Forskolin)Stemgent04-0025用 DMSO 重悬至 100 mM
明胶（猪源）Sigma AldrichG1890-100G溶于水后高压灭菌
人 CD34+ 细胞核转染 试剂盒LonzaVPA-1003
同型对照小鼠 IgG1，PE 标记BD Biosciences554680
同型对照小鼠 IgG2a，PE 标记BD Biosciences558595
同型对照大鼠 IgG2b，PE 标记R&D SystemsIC013P
KnockOut 血清替代物Thermo Fisher Scientific10828-028
L-抗坏血酸Millipore SigmaA8960
L-谷氨酰胺 (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237在 48 孔板中每孔使用 200 µL
MEM 非必需氨基酸 (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
MethoCult SF H4436StemCell Technologies04436
MidiMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 培养基StemCell Technologies85850
Nalgene 冻存管Thermo Fisher Scientific5000-0020
4% 甲醛溶液（PBS 配制）Thermo Fisher ScientificJ19943.K2用 PBS 稀释至所需浓度
PD0325901Sigma AldrichPZ0162用 DMSO 重悬至 100 mM
青霉素/链霉素 (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
pEP4 E02S EM2K 附加体Addgene20923质粒在 TOP10 E. coli (Invitrogen) 中扩增，并使用 QIAGEN 质粒 Maxi 试剂盒纯化。 
磷酸盐缓冲液 (PBS)Biological Industries02-023-1A
Poietics 人源间充质干细胞 LonzaPT-2501第 2 代 75 万个细胞可按制造商说明解冻并传代 1–2 代后使用或进行二次冻存
普莫瑞胺 (Purmorphamine)Stemgent04-0009用 DMSO 重悬至 10 mM
重组 Activin APeprotech120-14E用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人 FGF2Peprotech100-18B用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人碱性 FGF (bFGF)Peprotech100-18B在 PBS 中含 0.1% 牛血清/人血清白蛋白中重悬至 100 µg/mL
重组人 FLT3 配体R&D Systems308-FKHB 或 308E-GMP用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人胰岛素Biogems10-365
重组人 Kit 配体R&D SystemsBT-SCF 或 BT-SCF-GMP用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人 LIFPeprotech300-05在 PBS 中含 0.1% 牛/人血清白蛋白中重悬至 100 µg/mL
重组人 TGFβ1Peprotech 100-21在 PBS 中含 0.1% 牛/人血清白蛋白中重悬至 100 µg/mL
重组人血小板生成素 R&D Systems288-TPN 或 288E-GMP用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
重组人转铁蛋白Millipore SigmaT3705
重组人 BMP4Peprotech120-05用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
SB431543SelleckchemS1067用 DMSO 重悬至 10 mM
SIGMAFAST，碱性磷酸酶显色底物，片剂Millipore SigmaB56551 片溶解于 10 mL 纯化水中
亚硒酸钠Millipore SigmaS5261
Stemolecule Y27632 溶液Stemgent04-0012-02ROCK 抑制剂溶液 (10 mM)
StemPro Accutase 细胞解离试剂Thermo Fisher ScientificA11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher ScientificA1067501将 5 mL StemPro MSC SFM XenoFree 补充剂与 500 mL StemPro MSC SFM 基础培养基混合配制 XF-MSC 培养基。分装后的培养基可在 -20°C 冻存。
StemSpan SFEMStemCell Technologies9600
Thermo Scientific Mr. Frosty 冻存容器Thermo Fisher Scientific5100-0001
欧洲荆豆凝集素 I (UEA-1)，生物素标记Vector LaboratoriesB-1065-2荧光检测中用封闭液稀释至 1:200
VEGFPeprotech100-20用无菌 PBS 含 0.1% 人或牛血清白蛋白重悬至 (100 µg/mL)
Versene 溶液Thermo Fisher Scientific15040066
无饲养层基质 Vitronectin XFStemCell Technologies7180用 CellAdhere 稀释缓冲液稀释至 40 µL/mL
XAV939Sigma AldrichX3004用 DMSO 重悬至 100 mM
β-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific21985-023避光

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