脐带血祖细胞向诱导多能和卵裂球样干细胞的定义无异种重编程

摘要

该协议概述了人脐带血（CB）髓系祖细胞（hiPSC）的无异种（XF），饲养层（FF），游离体重编程的化学定义方法。这些 XF/FF CB-hiPSC （XF-hiPSC） 可以有效地恢复为具有增强分化和种间嵌合潜能的卵裂球样 Tankyrase/PARP1 抑制剂调节幼稚干细胞 （TIRN-SC）。

摘要

使用非整合的游离载体和基质信号可以实现人脐带血 （CB） 髓系祖细胞重编程为高保真人诱导多能干细胞 （hiPSC） 状态。这些传统的、引发的 CB-hiPSC 系随后可以高效地化学恢复为具有功能全能性的卵裂球样 Tankyrase/PARP 抑制剂调节幼稚干细胞 （TIRN-SC） 状态。PARP 调节的 TIRN-SC 是具有高表观遗传可塑性、稳定表观基因组印记的人类干细胞，并且比传统的谱系引发 hiPSC 具有更高的分化效力。在这里，概述了优化的 XF/FF 方法，用于将 CD34+ CD33+ CB 髓系祖细胞的间充质间质激活的游离体重编程为常规 XF/FF hiPSC。TIRN 复原可重复地增强 XF/FF 常规 hiPSC，以采用谱系引发基因表达降低的裂解期人胚胎细胞的转录、表观遗传和功能特征。我们验证了 TIRN 恢复的 CB 衍生的 XF-hiPSC 在广泛的遗传独立背景库中显示出定向多系分化（包括血液血管谱系）的显着改善。这些方法是为临床级HLA定义的“通用”供体TIRN-SC（UTIRN-SC）库生成符合cGMP的TIRN-SC系的第一步。从CD34+ CD33+ CB祖细胞中衍生出具有改进分化多功能性的UTIRN-SC系可能对再生医学产生重大影响。例如，UTIRN-SC 可以生成 HLA 定义、冷冻保存的心脏、血管和神经供体祖细胞的组织库，用于全面的多谱系“现成”细胞疗法。

引言

尽管人诱导多能干细胞（hiPSCs）为个性化细胞疗法提供了广阔的机会，但其临床应用面临重大挑战，包括致瘤性、免疫原性以及表型和功能异质性¹，这影响了其安全性、有效性和成本效益。此外，源自传统引发的hiPSC系的谱系承诺祖细胞以高度可变的系间分化效率²产生，并且表现出有限的体内植入和功能。然而，可以使用优化的重编程方法³或替代干细胞状态^4,5来克服这些限制。

尽管皮肤或血体细胞向hiPSC的非病毒游离体重编程效率很低（~0.01%-2%）⁶，但可以实现CB祖细胞的高度优化的四因素重编程，并且在间充质基质干祖细胞（MSC）激活的共^{培养条件下可以}达到高达50%的批量效率7。在该系统中，可溶性和接触依赖性基质信号加速了 CB 髓系祖细胞的细胞重编程。基质引发 （SP） 游离体 CB 衍生的 hiPSC 系分化为血管祖细胞 （VP），其效率高于传统成纤维细胞衍生的 hiPSC ^3,5。SP-CB-iPSC衍生的VP表现出更真实的胚胎VP转录身份，减少衰老和对DNA损伤的敏感性^3,4。在全身或直接移植到视网膜缺血再灌注损伤成年免疫缺陷小鼠的玻璃体中后，SP-CB-iPSC衍生的VP也表现出比传统的hiPSC衍生的VP更强大的体内植入^3,4。

Zimmerlin等人建立了一种两步化学重编程系统（“LIF-5i -> LIF-3i”），该系统将引发的常规人多能干细胞转变为具有改善多系分^化潜力的TIRN-SC状态5。分化的 TIRN-SC 衍生的血管祖细胞表现出更高的功能、更高的基因组稳定性和优异的体内植入，如它们迁移到缺血性视网膜深层神经层和再血管化的能力的提高所表明的⁴。TIRN-SC经过蛋白质基因组重编程，获得功能性杂化卵裂球样状态，在种间嵌合体^测定中具有很高的贡献8。TIRN-SC 维持 DNMT1 表达，并防止 CpG 甲基化基因组印迹区域受到侵蚀。有趣的是，SP-CB-hiPSC比通过替代的、效率^{较低的方法}获得的hiPSC更有效地恢复为TIRN-SC5,9。

因此，TIRN-SC是一种替代干细胞状态，具有改进的多系分化能力和有效的嵌合体贡献。进一步优化
在明确的、符合 cGMP 的培养条件下进行 TIRN-SC 重编程将有助于生成用于治疗的各种功能性、可植入的细胞类型和组织。为了满足对具有成本效益的治疗祖细胞的需求，这些方法可用于使用 HLA 定义的 CD34⁺ 造血 CB 或外周血祖细胞生产 cGMP 级的“通用供体”TIRN-SC （UTIRN-SC） 库。HLA 定义的 UTIRN-SC 衍生祖细胞可以满足更多需要立即对复杂组织进行多系再生的患者的需求。

为临床骨髓移植 （BMT） 开发的范式可以指导从来自国家供体登记处的部分 HLA 匹配或 HLA-单倍体相同的造血干细胞开发 UTIRN-SC 库。对包括美国在内的 18 个国家的前 10 种单倍型进行预测性全球计算分析，将提供此类 hiPSC“单倍库”的平均患者覆盖率为 68.4%¹⁰。一个明确的UTIRN-SC库不仅可以提供谱系承诺的祖细胞，还可以支持家畜（例如猪）中种间囊胚互补系统的治疗性TIRN-SC应用，用于整个器官的产生^11,12，^包括产生诱导耐受性的造血祖细胞，以减少具有广泛遗传多样性的种群（例如，美国）的移植物排斥反应。

这种用于生成具有 TIRN 能力的 XF/FF hiPSC 系的改进重编程协议是开发未来符合 cGMP 的 UTIRN-SC 库的第一步。该协议概述了人CB髓系祖细胞的逐步基质引发重编程和功能验证，以形成常规XF-hiPSC系。这些XF-hiPSC表现出很容易地恢复到TIRN-SC，其效率与非XF方法^相似7，并获得了不受限制的功能多能性，包括提高产生结构良好的谱系偏倚减少畸胎瘤的能力（相对于同基因引发的XF-hiPSC）^4,5,9。我们还概述了验证 TIRN 恢复的 XF-hiPSC 的方案，以验证它们改进和稳健地直接分化到血液血管谱系。

方案

所有重编程实验均符合美国国家科学院和国际干细胞研究学会 （ISSCR） 发布的指南。对于 hiPSC 的生成，供体细胞收集方案和供体知情同意已获得约翰霍普金斯大学 （JHU） 机构审查委员会 （IRB） 监督的批准。所有实验均在 JHU 机构干细胞研究监督 （ISCRO） 的范围内进行，并符合有关知情同意和来源评估的机构标准。此外，所有动物使用和外科手术均按照 JHU 动物护理和使用研究所委员会 （IACUC） 批准的方案进行。所有涉及动物程序的实验（例如， 皮下/肌肉注射 NOD。Cg-Prkdc^scid IL2rg^tm1Wjl/SzJ （NOG SCID） 小鼠（Jackson Labs，Bar Harbor，ME）用于畸胎瘤分析和囊胚移植到 ICR 假怀孕小鼠）已获得 JHU IACUC 的审查和批准。这些审查包括对道德牺牲、人道住房以及尽量减少动物不适的适当措施的考虑。

1. 无饲养层无异种 hiPSC 游离体重编程

1. 供体造血祖细胞制备
   1. 分娩后立即使用冷冻保存的CD34 ⁺ 造血干细胞/祖细胞（例如，1x10⁶ 个新生儿CB细胞）或将冷冻管储存在液氮储罐中。确保细胞在运输和处理过程中持续保持冷冻状态。
      注意：或者，也可以在收集后立即使用非冷冻保存的供体细胞并使用批准的方案富集 CD34。
   2. 在水浴中解冻细胞之前，轻轻打开生物安全柜内的灭菌冷冻管，以释放小瓶内的任何滞留气体，然后紧紧关闭小瓶。
   3. 将小瓶置于 37 °C 水浴中 1 至 2 分钟。轻轻旋转小瓶，直到几乎没有冰块残留。从水浴中取出小瓶并彻底灭菌（即 70% 乙醇喷雾）。
      注意：所有步骤都需要适当的无菌技术，并在无菌生物安全罩柜内执行。
   4. 轻轻缓慢地将细胞转移到空的 50 mL 无菌锥形管中。用 1 mL 冷的无异种造血祖细胞 （XF-HP） 扩增培养基（表 1）洗涤小瓶，并轻轻地（沿管边缘滴加）与细胞混合以稀释 DMSO 冷冻保护剂。
   5. 将试管放在架子上 30 秒，然后缓慢（滴加）加入 2 mL 冷 XF-HP 培养基。在加入培养基的同时轻轻旋转细胞悬液。通过依次添加 4、8 和 4 mL 冷 XF-HP 培养基（总体积高达 20 mL）重复此步骤两次。将稀释的细胞在 4°C 下以 100 x g 离心 10 分钟。
      注意：不要在冷冻保护剂溶液中和稀释步骤中上下移液细胞。滴加XP-HP培养基，缓慢加入，直到DMSO稀释至少10倍。使用冷介质作为DMSO稀释导致放热反应。
   6. 在生物安全柜中吸出无细胞上清液。轻轻地去除细胞沉淀。重悬于 2 mL XF-HP 扩增培养基中，使用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行细胞计数。
   7. 将解冻的细胞转移到超低附着细胞培养多孔板上（例如， 将 2 mL 细胞/XF-HP 培养基混合物转移到 6 孔板的 1 孔中）。
   8. 用 Saran 包裹板以模拟缺氧条件。将板转移到培养箱（37°C，5%CO₂，潮湿气氛）中。或者，将未包装的板放入具有 O₂ 对照（5% O_2,5 % CO₂，潮湿气氛）的培养箱中。
   9. 在XF-HP培养基中培养造血祖细胞3天。
2. 间充质干祖细胞（MSC）制备
   1. 通过将冷冻保存的等分试样在37°C水浴中孵育1至2分钟，解冻低传代（p2至p3）人间充质干细胞的等分试样（0.75-1x10,6个细胞）。轻轻旋转小瓶，直到几乎没有冰块残留。从水浴中取出小瓶并彻底灭菌（即 70% 乙醇）。
      注意：低传代 （p2） 人间充质干细胞可以使用既定方案从人骨髓中购买或制备并冷冻保存。MSC可以提前约7-10天解冻，并在核转染前一天作为饲养层进行辐照/铺板（图1）。
   2. 轻轻缓慢（沿管边缘滴加）将细胞转移到生物安全柜内装有冷无种无血清间充质干细胞（XF-MSC）培养基（表1）的15mL锥形管中，以稀释DMSO冷冻保护剂至少10倍（例如， 将1mL冷冻保存的细胞等分试样转移到9mL XF-MSC培养基中）。
   3. 使用 1 或 2 mL 冷 XF-MSC 培养基冲洗试管并混合到锥形试管中。将稀释的细胞在 4°C 下以 100 x g 离心 5 分钟。
   4. 在生物安全柜中吸出无细胞上清液。将细胞沉淀轻轻重悬于 1 mL XF-MSC 培养基中，使用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行细胞计数。
   5. 将解冻的细胞转移到组织处理的细胞培养多孔板上（例如每 cm² 5,000-6,000个细胞或6孔板的1孔中约50,000个细胞）。将板置于培养箱（37°C，5%CO₂，潮湿气氛）中。在生物安全柜中每 2-3 天刷新一次 XF-MSC 培养基。
   6. 在核融合的前一天，在生物安全柜中吸出无细胞上清液。用PBS（2mL/孔）洗涤MSC一次。吸出PBS。加入 1 mL/孔的细胞解离试剂（例如，1X 胰蛋白酶-EDTA 溶液）。在 CO₂ 培养箱中在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   7. 通过加入 1 mL XF-MSC 培养基（至少 2 倍稀释）中和解离试剂，并用移液器轻轻研磨到单细胞悬液中。将细胞悬液收集到15mL锥形管中。以 100 x g 离心 5 分钟。
   8. 吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL XF-MSC 培养基中，使用血细胞计数器或自动细胞计数器进行细胞计数。
   9. 使用 g 射线或 X 射线辐照器照射 （2,000 rad） 间充质祖细胞，并在 XF-MSC 培养基中将 Arg-Gly-Asp （RGD） 肽包被的合成表面 6 孔板（每孔 2x10⁵ 个细胞）照射到 5 次传代下。将板在培养箱中过夜（37°C，5%CO₂，潮湿气氛）。
3. Xenofree 游离重编程
   1. 将 XF-HP 扩增培养基中的 3 天龄 CB HP 培养物收集到生物安全柜中的 15 mL 锥形管中。以 200 x g 离心 5 分钟。
   2. 在生物安全柜中吸出无细胞上清液。 使用血细胞计数器或自动细胞计数器将细胞沉淀轻轻重悬于 1 mL XF-HP 扩增培养基中进行细胞计数。
   3. 将 1x10⁶ 个扩增的 HP 细胞与 100 μL 人 CD34⁺ 细胞核转溶溶液（人 CD34⁺ 细胞核转基因试剂盒）混合。加入 6 μg 纯化的浓缩附加体 （<5 μL），并使用核滤剂盒的塑料转移移液管小心地转移到核滤液皿中。避免气泡。将比色皿放入核保护器装置中并使用程序 U-008。
      注意：通过在TOP10大肠杆菌中常规转化制备基于游离EBNA的pCEP4载体pEP4 EO2S EM2K（OCT4，SOX2，MYC，KLF4）的储备液，并使用质粒Maxi-prep试剂盒进行纯化。核移核当天，使用 PCR 纯化试剂盒清理和浓缩质粒 ⁷.
   4. 核苷移后，立即将 500 μL 预热的 XF-HP 扩增培养基加入比色皿中，并使用无菌转移移液管将 1 mL XF-HP 培养基中的细胞转移到 1 孔的超低附着细胞培养 6 孔板上。
      注意：核转染的细胞非常脆弱，无法承受常规 1 mL 移液器吸头的剪切应力。转移到超低附着培养板上是促进核转染后细胞恢复的步骤，然后最终附着到 RGD 包被的培养板上。
   5. 用保鲜膜紧紧包裹板以模拟缺氧条件。将板置于 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂，潮湿气氛）中。或者，将未包装的板放入具有 O₂ 对照（5% O_2,5 % CO₂，潮湿气氛）的培养箱中。孵育4至6小时。
      注意：此步骤将允许核转染的HP细胞在转移到MSC单层之前恢复。
   6. 将细胞收集到生物安全柜中的 15 mL 锥形管中。以 200 x g 离心 5 分钟。
   7. 在生物安全柜内吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL XF-HP 扩增培养基中。在补充有ROCK抑制剂Y-27632（终浓度10μM）的XF-HP扩增培养基（2mL /孔）中的RGD包被板中，以约17,500个细胞/cm² 的密度将核转染的HP细胞接种到辐照的MSC上。将板置于 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂，潮湿气氛）中。
   8. 核移核两天后，在生物安全柜内的每个孔中加入 2 mL（等体积）的 E8 培养基。
   9. 每隔一天用 E8 培养基更换一半体积的培养基。将漂浮细胞收集到 15 mL 锥形管中，以 200 x g 离心 5 分钟，然后将回收的细胞加回培养物中。
   10. 在第21天，制备玻连蛋白包被的组织培养处理的6孔板。将 1mL 稀释的玻连蛋白溶液（例如，玻连蛋白-XF 为 40 mL/mL）加入 6 孔板的 1 孔中，并在室温下孵育 1 小时。
   11. 在生物安全柜内使用倒置显微镜手动拾取单个 XF-hiPSC 菌落。用移液管研磨并将单个菌落转移到补充有 ROCK 抑制剂 Y-27632（终浓度 5 μM）的 E8 培养基中的玻连蛋白包被板上。将板置于 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂，潮湿气氛）中。
   12. 第二天，小心地用不补充ROCK抑制剂的E8培养基更换培养基。此后每天在生物安全柜中更换 E8 培养基（2 mL/孔）。

2. 常规hiPSC培养和维护

1. 当菌落在 5 至 6 天后变大（即直径 0.5 至 1 毫米或约 80% 汇合）时，在生物安全柜中吸出培养基。
2. 加入 2 mL/孔 PBS 洗涤细胞。吸出PBS。加入 1 mL 基于 EDTA 的细胞解离溶液。在 CO₂ 培养箱（37°C，5% CO₂，潮湿气氛）中孵育 5 分钟。使用显微镜检查细胞是否松散附着（例如，闪亮的圆形细胞，但仍附着在板上）。
3. 在生物安全柜内轻轻吸出解离溶液，而不会破坏细胞。
4. 将细胞收集在补充有ROCK抑制剂Y-27632（终浓度5μM）的1-2mL E8培养基中，并进行非剧烈移液以维持细胞团块。将细胞团块转移到玻连蛋白包被（见第 1.3.11 节）6 孔细胞培养处理板上（相当于每孔 10 个菌落或 1：10 分裂）。将板置于 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂，潮湿气氛）中。
5. 每 5-7 天使用基于 EDTA 的细胞解离溶液继续传代培养。
   注意：SP-CB-hiPSC重编程通常不需要额外的亚克隆或手动菌落挑选，但如果hiPSC克隆包含具有异常形态的菌落（例如，自发分化，如成纤维细胞或胚胎样体形成，出现异常的非扁平菌落），使用微量移液器和显微镜手动选择生物安全柜内的菌落或丢弃异常克隆。hiPSC 的非有效、不稳定重编程与 TIRN-SC 恢复不兼容。

3. XF-hiPSC克隆的表型验证

1. 在长期冷冻保存和应用于功能研究之前，将XF-hiPSC克隆扩展至少5-7个传代以进行初始验证（图2），如第2节所述。记录每个冷冻保存瓶上的传代次数。
   注意：低传代XF-hiPSC克隆的初始表征可以通过多种测定来确认，例如赤啉磷酸酶活性，以及TRA-1抗原或NANOG免疫检测。
2. 使用碱性磷酸酶染色进行XF-hiPSC验证和计数（图2A，B）。
   注意：通过枚举在第 3 天接种的每个单个输入细胞的完全重编程菌落的数量，可以在 P0 3-5 周的游离核转后 3-5 周确定批量培养物中的重编程^效率。
   1. 在生物安全柜中吸出培养基。
   2. 用PBS（每孔2mL）洗涤细胞。吸出PBS。通过添加 2% 多聚甲醛/PBS 溶液固定细胞。在室温下孵育10分钟。
   3. 根据化学废物安全指南去除和处置多聚甲醛/PBS 溶液。
   4. 用PBS（每孔2mL）洗涤细胞。吸出PBS。加入1-2mL碱性磷酸酶底物，在室温下缓慢搅拌孵育10至15分钟。
   5. 用PBS洗涤3次以停止反应。显微照片和枚举。
      注意：避免过长的孵育时间或温度，因为它可能导致假阳性染色。
3. 使用 TRA-1 抗原免疫染色剂进行 XF-hiPSC 染色验证和计数（图 2C）。
   注意：对于游离体重编程，应使用已发表的方案⁷ 在初始传代期间检测转基因表达和 EBNA1 载体骨架。常规验证包括通过 G 条带（图 2D）或基于全基因组阵列的覆盖测定进行核型分析。基本功能多能性也可以使用畸胎瘤分化方案（图2E）或非定向胚胎样体分化的定量多基因表达记分卡进行测定¹⁴。
   1. 在生物安全柜中，免疫染色通过将荧光染料偶联的活染色抗体以适当的浓度添加到 E8 培养基中，复制 TRA-1-60 或 TRA-1-81 抗原的孔 30 分钟。
   2. 吸出培养基。用 E8 培养基（每孔 2 mL）洗涤两次。
   3. 在E8培养基或无酚红培养基中进行显微照片和计数。
      注意：或者，在室温下使用 2% 多聚甲醛/PBS 溶液固定细胞 10 分钟，并使用标准抗体对 TRA-1 抗原进行免疫染色。
4. 通过流式细胞术验证 XF-hiPSC 免疫表型。
   1. 在生物安全柜中，吸出培养基。
   2. 在PBS中洗涤细胞（每孔2mL）。吸出PBS。加入酶解离试剂（例如，Accutase，每孔1mL）。将板在 CO₂ 培养箱（5% CO₂，潮湿气氛）中在 37°C 下孵育 5 分钟。
   3. 通过加入等体积的培养基收集细胞并通过细胞过滤器（40-70μm过滤器）。以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
   4. 将细胞沉淀重悬于含有 5% FBS 的 PBS 中（每个孔当量 1 mL）。使用血细胞计数器或自动细胞计数器计算细胞数量。每次FACS测定将约100,000-200,000个细胞分布在圆底管中（每次测定将体积保持在约100μL）。
   5. 对于细胞外染色，在使用纯小鼠血清进行可选封闭步骤（每次测定添加 5 μL，在室温下 5 分钟）后，根据制造商的说明与荧光染料偶联抗体（例如 TRA-1-81 PE、SSEA4 APC）孵育。用 3 mL PBS 洗涤。以 300 x g 离心 5 分钟。重悬于 FACS 缓冲液（例如，含有 5% FBS 的 PBS）中并使用 FACS 仪器获取。
      注意：始终使用适当的同种型对照并染色平行样品以验证免疫检测蛋白质的特异性。
   6. 对于细胞内染色（例如 NANOG-PE、OCT3/4-PE、SOX2-PE），请遵循制造商的固定/透化步骤说明。与荧光染料偶联抗体或匹配的同种型对照一起孵育。使用 FACS 仪器采集。

4. XF-hiPSC克隆的冷冻保存和解冻

1. 在长期冷冻保存和应用于功能研究之前，将XF-hiPSC克隆扩展至少5-7代，以进行初始验证（图2）。记录每个冷冻保存瓶上的传代次数。
   1. 在生物安全柜中吸出培养基。
   2. 用PBS（每孔2mL）洗涤细胞。吸出PBS。 加入基于EDTA的细胞分离溶液（每孔1mL）以将XF-hiPSC集落解离成细胞团块。将板在 CO₂ 培养箱（37°C，5% CO₂，潮湿气氛）中孵育 5 分钟。使用显微镜检查细胞是否松散附着（例如，闪亮的圆形细胞）。
   3. 轻轻吸出解离溶液，不破坏细胞单层集落，并将细胞收集在1-2 mL E8培养基中，并进行非剧烈移液以维持细胞团块（每个团块10-50个细胞）。将 XF-hiPSC 收集到无菌 15 mL 锥形管中。以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
   4. 在生物安全柜中吸出上清液。将细胞沉淀重悬于冷冻溶液中（表2，~1孔当量/mL）。
   5. 将细胞转移到长期储存的低温管中。将试管放入缓慢冷冻容器中，让样品在-80°C冰箱中冷冻过夜。第二天，将冷冻管放入液氮冷冻机中长期储存。
2. 解冻时，通过预涂玻连蛋白来制备板（见第 1.3.11 节）。
   1. 将冷冻小瓶放入 37 °C 水浴中，将细胞解冻 ~1-2 分钟。灭菌（即乙 醇喷雾）。
   2. 将 XF-hiPSC 缓慢转移到含有 9 mL 解冻培养基的无菌 15 mL 锥形管中（表 2），以在无菌生物安全罩柜内缓慢稀释细胞 10 倍。
      注意：不要用力移液。
   3. 以 200 x g 离心 5 分钟。
   4. 在生物安全柜中吸出无细胞上清液。将细胞沉淀重悬于补充有ROCK抑制剂（终浓度5mM）的E8培养基（1-2mL）中。
      注意：排除 Y-27632 将导致解冻后恢复效率差。
   5. 将解冻的细胞转移到 6 孔板的 1 或 2 个玻连蛋白包被孔中。第二天，用不含ROCK抑制剂的常规E8培养基更换培养基以进行细胞扩增。

5. XF-hiPSC的无异种血血管分化

1. 使用我们优化的无异种血血管分化方案区分XF-hiPSC（图3）⁴。
   注意：该协议是从¹⁵.
   1. 在~40-50%汇合处制备XF-hiPSC（传代后1-3天）。
   2. 吸出培养基并在生物安全柜中加入2mL中胚层测定培养基（表2）。
   3. 2天后，吸出培养基并在生物安全柜中加入2mL /孔的血管分化培养基（表2）。如果在此步骤中可以看到大量死细胞或漂浮细胞，请用 2 mL PBS 洗涤一次。
   4. 在生物安全柜中每隔一天更换一次血管分化培养基，直至第 11 天。
      注意：如果培养基由于高细胞密度和低 pH 值而变黄，请添加 1 mL 新鲜培养基或每天更换。
2. 在血管分化培养基中培养7-10天后，用磁珠细胞分选法从贴壁单层中纯化CD31⁺ 或CD34⁺ 血管细胞。
   注意：每个单独的克隆可能显示出不同的分化动力学。通过FACS分析确定CD31 / CD34表达的峰值时间点（图4A）。需要磁珠富集前和富集后 FACS 分析。造血祖细胞 （HP） 可以在此阶段从上清液中回收并使用 CD34 微珠富集。CD34⁺ XF-hiPSC衍生的HP可以使用甲基纤维素测定法进一步验证（图4B-C）¹⁶。
   1. 在生物安全柜中，吸出培养基并在PBS（每孔2mL）中洗涤细胞。通过添加酶解离试剂（例如，Accutase，每孔 1 mL），吸出 PBS 并将 hiPSC 集落解离到单细胞中。将细胞在 CO₂ 培养箱（5% CO₂，潮湿气氛）中在 37°C 下孵育 5 分钟。
   2. 在生物安全柜中，通过添加等体积的培养基来收集细胞。以 200 x g 离心细胞 5 分钟。
   3. 将细胞沉淀重悬于血管分化培养基中（表2）。使用血细胞计数器或自动细胞计数器计算细胞数量。留出约 50,000-100,000 个细胞，使用直接偶联的抗 CD31 或抗 CD34 抗体进行预磁珠富集 FACS 测定。
   4. 将剩余的细胞以300×g 离心5分钟。将细胞沉淀重悬于生物安全柜中的磁珠富集缓冲液（PBS pH 7.2、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA）中。
   5. 将细胞通过细胞过滤器（40-70μm过滤器）。以300×g离心5分钟。重悬于 60 μL 磁珠富集缓冲液中。
   6. 加入 20 μL FcR 封闭试剂，然后加入 20 μL CD31 或 CD34 微珠，并在 4 °C 下孵育 15-20 分钟。
   7. 在生物安全柜中用 2 mL 磁珠富集缓冲液洗涤细胞并离心（300 x g，5 分钟）。
   8. 将细胞沉淀重悬于生物安全柜中的 1 mL 磁珠富集缓冲液中。
   9. 将LS色谱柱放置在生物安全柜内磁性细胞分离器的磁场中。用 3 mL 磁珠富集缓冲液洗涤柱。
   10. 将单元格应用到列。 将未标记的细胞收集到 15 mL 锥形管中。用 3 mL 磁珠富集缓冲液洗涤色谱柱 3 次。
   11. 从分离器中取出色谱柱，并将其放在新的 15 mL 锥形管上。
   12. 通过加入 3-5 mL 内皮生长培养基冲洗出磁性标记的细胞。以 200 x g 离心 5 分钟。
   13. 重悬于生物安全柜中的 1 mL 内皮生长培养基中。使用血细胞计数器或自动细胞计数器计算细胞数量。留出约 50,000 个细胞，通过使用直接偶联的抗 CD31 或抗 CD34 抗体进行 FACS 分析，进行磁珠富集后分选纯度。
   14. 分离的VP可以在内皮生长培养基中纤连蛋白包被（10μg/mL）组织培养处理的烧瓶板上进一步扩增。

6. XF-hiPSC功能验证的实验设计指南

1. 使用既定的非整合方法（例如游离体 ^7,17、仙台病毒¹⁸ 或 mRNA¹⁹ 重编程）在最早传代建立经过验证的 XF-hiPSC 储备。
   注意：非重编程方法的效率和可靠性的比较见其他地方⁶。可以使用PCR方法^在初始传代期间验证游离体或仙台病毒重编程方法中的转基因材料清除^7,20。转基因保留与 TIRN-SC 生成不兼容。
2. 通过 G 条带或基于全基因组阵列的覆盖测定验证 XF-hiPSC 克隆中的正常核型⁹。
3. 使用 DNA 甲基化和基因表达阵列或测^{序方法验证} XF-hiPSC 系的基因表达和表观基因组完整性（即亲本印记、X 激活）^5,11,14。
4. 使用畸胎瘤分化方案（图2E），使用RT-PCR阵列¹⁴进行定量胚体（EB）分化测定，或针对3个胚层9的定向分化测定来验证基本功能多能^性。
   注意：使用显微镜组织学表征进行畸胎瘤测定的多系分化能力和系内增殖指数的定量方法在其他地方提供⁴。先前^详细介绍了针对中胚层谱系和血液血管规格的定向分化方案（图4A-C）^4,5,9，^以及针对最终内胚层的定向分化测定（图4D）⁵。外胚层定向分化测定的示例在其他地方提供 ^4,5。

7. XF-hiPSC的化学TINN适应

1. 按照已发表的方案 ^9,21，^从 CF1 或 CF1 x DR4 杂交 E13.5 小鼠胚胎中购买或制备内部低传代 MEF 饲养器。在TINN适应步骤前至少一天，在糊化（0.1%水明胶，每孔1mL）组织培养处理的6孔板中，每孔接种200,000个MEF饲养器（详细的TINN方案在其他地方提供^4,5,9）。
2. 在无饲养层培养系统（例如，E8培养基，内部配方见 表1 ）中维持和扩增具有经过验证的正常核型的无转基因XF-hiPSC培养物。
3. 用LIF-5i培养基替换E8培养基（每孔2mL; 表1）XF-hiPSC 培养物在生物安全柜中达到 ~50% 汇合度（即初始接种后 3-5 天）后。
4. 第二天，吸出培养基并在生物安全柜中用PBS（每孔2mL）洗涤一次适应LIF-5i的XF-hiPSC。吸出上清液，向每个孔中加入1mL酶促细胞解离试剂。在 CO₂ 培养箱中在 37 °C 下孵育 5 分钟。
5. 用移液器轻轻研磨到生物安全柜中的单细胞悬液中。用LIF-5i培养基（每孔1mL）中和。将细胞悬液收集到无菌的 15 mL 锥形管中。 以 200 x g 离心 5 分钟。
6. 在生物安全柜中吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 2 mL LIF-5i 培养基中。
   注意：如果可能，取等分试样进行细胞计数。可以用LIF-5i / LIF-3i培养基中和酶活性，而无需补充抑制剂或生长因子。
7. 用 PBS 洗涤 MEF 板两次（6 孔板中每孔 2 mL），并加入细胞（1 孔当量的 LIF-5i 适应细胞到 2 mL LIF-5i 培养基中的 1 孔 MEF 饲养器上）。
   注意：优化每个单独的 XF-hiPSC 系的初始铺板密度是可选的。如果在上一步中对细胞进行了计数，则将每孔至少接种 1x10⁶ 个细胞接种到饲养器上。 将板转移到 CO₂ 培养箱（37 °C，5% CO₂，潮湿气氛）中。
8. 在 CO₂ 培养箱（37°C，5% CO₂，潮湿气氛）中的 MEF 上的 LIF-5i 中培养并维持 XF-hiPSC 3-5 天。每天更换 LIF-5i 培养基。
9. 当形成圆顶形TIRN-SC菌落时（在饲养器上培养3-5天后），在生物安全柜中吸出培养基。用 2 mL PBS 洗涤每个孔。
10. 吸出PBS。向每个孔中加入 1 mL 细胞分离溶液（例如 Accutase）。在 CO₂ 培养箱（5% CO₂，潮湿气氛）中在 37 °C 下孵育 5 分钟。
11. 将 1 mL LIF-3i 培养基（表 1）添加到生物安全柜中的每个孔中，以中和解离试剂。轻轻研磨并将细胞收集到 15 mL 锥形管中。以 200 x g 离心 5 分钟。
12. 在生物安全柜中吸出上清液。重悬于 LIF-3i 培养基（每孔 1 mL）中，使用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行细胞计数。将 ~5 x 10⁵ 个细胞接种在每孔 2 mL LIF-3i 培养基中，接种到生物安全柜中糊化 6 孔板中辐照的 MEF 上。
    注意：对所有后续段落重复步骤 7.12 5o 7.16。 在初始LIF-5i适应培养后，以较低密度（2x10⁵ 细胞/孔）接种LIF-3i培养物，每3-4天传代一次。
13. 在用于功能研究或冷冻保存之前，在 LIF-3i 培养基中传代 TIRN 恢复的 XF-hiPSC 至少连续传代 6-7 次。记录无异种引发培养基（例如 E8）或 LIF-5i/LIF-3i TIRN 培养基中的传代次数。
    注意：高传代（例如，>p40）XF-hiPSC 系的 TIRN 恢复效率低下，不推荐使用。高传代系通常存在染色体或亚染色体缺陷，这与有效的TINN逆转不兼容，会导致逆转效率差和培养稳定性有限。此外，不建议使用在LIF-3i培养基中经过超过15次传代的TINN培养物进行功能研究。XF-hiPSC 的 TIRN 逆转的功能影响在 LIF-3i 培养基中的 7 至 15 代之间最为突出。

8. XF/FF hiPSC 衍生的 TIRN-SC 定向分化的实验设计指南。

1. 将 XF/FF hiPSC 衍生的 TIRN-SC 直接利用到既定的定向分化方案中，无需任何“重新启动”步骤（即， 在用于定向分化测定之前，无需将 TIRN 干细胞切换回常规“启动”条件）。
2. 为了评估 TIRN 对 XF-hiPSC 影响的功能，请以相同的传代数并行设置同亲同基因培养物。在各自的培养基中并行维持引发/TIRN 兄弟同基因 XF-hiPSC 培养物（例如，玻连蛋白上的 E8 与MEF上的LIF-3i），并同时进行畸胎瘤测定（图5），或使用相同的胚样体或定向分化方案和材料进行区分（图6）。
3. 如果可能，对终末分化谱系进行功能评估。例如，可以通过蛋白质表达、DiI偶联乙酰化低密度脂蛋白（LDL）摄取测定和基质胶管测定来评估血管祖细胞（图7）。
   注意：CB-hiPSC和TIRN-SC衍生的VP的其他功能测定（即DiI-Ac-LDL摄取/衰老/增殖/迁移测定，体外基质胶管测定，动物基质胶插入测定，异种移植测定）详见其他地方^3,4。
4. 在每次分化测定中调整和优化每个单独的 XF-hiPSC 克隆的初始铺板密度和动力学（图 6）。
   注意：与引发的 XF-hiPSC 相比，TIRN 恢复的 XF-hiPSC 在定向分化测定中具有更强大的增殖和分化能力。TIRN 培养物通常需要比 E8 培养物更低的初始铺板密度，并且不需要使用抗细胞凋亡补充剂来提高克隆存活率。

结果

该协议优化了已发表的方法，使用游离载体和基质信号将骨髓祖细胞高效重编程为高保真引发多能^状态7。该方案（图1）概述了将人CB CD34 ⁺ 祖细胞的XF / FF基质引发的游离体重编程为XF-hiPSC的定义方法，并指导如何通过定向血液血管规范 验证 其功能，然后在LIF-3i / MEF条件下将TINN恢复为卵裂球样TINN干细胞。

使用这种优化的方案，hiPSC集落在2-3周内以高频率（>7%）出现（图2A，B）。与其他无整合重编程方法⁶（例如仙台病毒，mRNA转染）相比，我们发现该方法更具成本效益，并且对后续的TINN逆转具有更高的重现性。通过 PCR 测定⁷ 传代 8-20 次后，确认使用游离体载体重编程的非 XF hiPSC 系中转基因...

讨论

Zambidis 小组最初报道了一种高度优化的四因子游离体方法，用于将谱系承诺的 CB 髓系祖细胞重编程为 CB-hiPSC，在纯化的表位体表达细胞中体积效率高达 50%⁷。在此，我们提出了在XF / FF基质引发条件下原始人CB祖细胞游位体重编程方案的修改版本。该方法采用谱系承诺的CD33 ⁺ CD45 ⁺ CD34⁻ 髓系细胞的增强重编程能力，在暴露于可溶性和接触依赖性间充质基质细胞信号后实现快速和几乎完全的非整合重编程。

使用传统的 hiPSC 系进行再生方法受到高度可变的分化效率和下游祖细胞的体内功能差的阻碍。影响传统hiPSC功能多能性的一个关键变量是它们与引发的小鼠植入后外胚层干细胞（mEpiSC）的共同性以及固有的谱系引发的受限功能多能性²²。传统的hiPSC采用一系列引发多能态，具有高度可变的谱系引发基因表达和mEpiSC...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amaxa Biosystems Nucleofector II	龙沙	AAB-1001型
抗CD143（BB9）抗体，APC偶联	BD生物科学	557929	使用 10-20 µ每次检测升 （FACS）
抗CD144抗体，PE偶联	BD生物科学	560410	使用 10-20 µ每次检测升 （FACS）
抗CD146抗体，PE偶联	BD生物科学	550315	使用 10-20 µ每次检测升 （FACS）
抗CD184/CXCR4抗体，APC偶联	BD生物科学	555976	使用 10-20 µ每次检测升 （FACS）
抗CD31抗体	BD生物科学	550389	在封闭溶液中稀释 1：100 用于免疫荧光测定
抗CD31抗体，APC偶联	电子生物科学	17-0319-42	使用2&微;每次检测升 （FACS）
抗CD34抗体，APC偶联	BD生物科学	555824	使用 5 & 微;每次检测升 （FACS）
抗CD45抗体，PE偶联	BD生物科学	555483	使用 10-20 µ每次检测升 （FACS）
抗 NANOG 抗体，PE 偶联	BD生物科学	560483	使用 10-20 µ每次检测升 （FACS）
抗OCT4抗体，PE偶联	R&D 系统	IC1759P	使用 10 & 微;每次检测升 （FACS）
抗SOX17抗体，Alexa488偶联	BD生物科学	562205	使用 5 & 微;每次检测升 （FACS）
抗 SOX2 抗体，PE 偶联	R&D 系统	IC2018P	使用 10 & 微;每次检测升 （FACS）
抗SSEA-4抗体，APC偶联	R&D系统	FAB1435A	使用 5 & 微;每次检测升 （FACS）
抗 SSEA-4 GloLIVE 抗体，NL493 偶联	R&D系统	NLLC1435G	以 1：50 稀释度使用（活免疫染色和固定免疫染色）
抗 TRA-1-60 A488 偶联试剂盒	赛默飞世尔科技	型号：A25618
抗 TRA1-60 抗体，PE 偶联	BD生物科学	560193	使用 10 & 微;每次检测升 （FACS）
抗TRA-1-60 GloLIVE抗体，NL557偶联	R&D 系统	NLLC4770R	使用 at 1：50 稀释液（活免疫染色和固定免疫染色）
抗 TRA-1-60 StainAlive 抗体，DyLight 488 偶联	斯特姆根特	09-0068	以 1：100 稀释度使用（活免疫染色和固定免疫染色）
抗 TRA1-81 抗体，PE 偶联	BD生物科学	560161	使用 10 & 微;每次检测升 （FACS）
抗 TRA-1-81 StainAlive 抗体，DyLight 488 偶联	斯特姆根特	09-0069	以 1：100 稀释度使用（活免疫染色和固定免疫染色）
CD31 微珠试剂盒，人	米尔特尼生物科技	130-091-935
CD34 MicroBead Kit，人用	米尔特尼生物科技	130-046-702
CD34+ 混合供体， 脐带血，100 万个细胞	所有细胞	CB、CR、CD34+、混合、PS、CS10、1M	细胞的替代来源包括胎儿肝脏、成人骨髓和动员的外周血
CF1 鼠标	查尔斯河	023
CHIR99021	R&D系统	L5283	在 DMSO 中以 100 mM 重构
康宁 Costar 组织培养处理的 6 孔板	康宁	3506
康宁 Synthemax II-SC 底物，10 mg 小瓶	康宁	3535	在 5 &MU 使用;g/cm2 作为康宁 3978 的替代品
康宁 Synthemax-R 6 孔板	康宁	3978	停产并替换为 3535
Costar 6 孔透明平底超低附着 6 孔板	康宁	3471
伯爵夫人 细胞计数室载玻片	赛默飞世尔科技	C10228
Countess 自动细胞计数仪	赛默飞世尔科技	AMQAX1000
冷冻商店 CS10	干细胞技术	100-1061
二硫-AC-低密度脂蛋白	赛默飞世尔科技	L3484	在 5-15 和微量下使用;克/毫升
DMEM（Dulbecco's Modified Eagle 培养基）	赛默飞世尔科技	11995065
DMEM/F-12 ， GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技	10565018
DMEM/F-12、HEPES	赛默飞世尔科技	11330032
DMSO（二甲基亚砜）	西格玛·奥尔德里奇	D2650型
DR4 鼠标	杰克逊实验室	3208
Essential 8 （E8） 培养基	干细胞技术	5940
胎牛血清 （FBS）	赛默飞世尔科技	SH30071.03
修复和PERM 细胞透化试剂盒	赛默飞世尔科技	气体004
毛喉素	斯特姆根特	04-0025	在 DMSO 中以 100 mM 重构
明胶（猪）	西格玛·奥尔德里奇	G1890-100G	重悬于水中并用高压灭菌器灭菌
人CD34+细胞核膜 工具箱	龙沙	VPA-1003型
同型小鼠 IgG1 PE 偶联	BD生物科学	554680
同型小鼠 IgG2a PE 偶联	BD生物科学	558595
同种型大鼠 IgG2b PE 偶联	R&D 系统	IC013P
KnockOut 血清替代品	赛默飞世尔科技	10828-028
L-抗坏血酸	米利波尔西格玛	A8960
L-谷氨酰胺 （100X）	赛默飞世尔科技	25030-081
LS 色谱柱	米尔特尼生物科技	130-042-401
基质胶	康宁	356237	使用 200 & 微;48 孔板中的 L/孔
MEM 非必需氨基酸 （MEM NEAA） （100X）	赛默飞世尔科技	11140-050
MethoCult SF H4436	干细胞技术	04436
MidiMACS 分离器	米尔特尼生物科技	130-042-302
mTeSR1培养基	干细胞技术	85850
Nalgene 低温西林瓶	赛默飞世尔科技	5000-0020
多聚甲醛溶液，4% PBS 溶液	赛默飞世尔科技	J19943 年。K2	使用PBS稀释至所需浓度
PD0325901	西格玛·奥尔德里奇	PZ0162型	在 DMSO 中以 100 mM 重构
青霉素/链霉素 （10,000 U/mL）	赛默飞世尔科技	15140-122
pEP4 E02S EM2K 附加体	阿德基因	20923	质粒在TOP10 E. 大肠杆菌（Invitrogen）并用QIAGEN质粒Maxi试剂盒纯化。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	生物工业	02-023-1A
Poietics 人间充质干细胞	龙沙	PT-2501型	在第 2 代处的 750,000 个细胞可以根据制造商的说明解冻和扩增，在使用前进行 1-2 次传代或二次库
嘌呤胺	斯特姆根特	04-0009	在DMSO中以10 mM重构
重组激活素A	Peprotech	120-14E	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
重组人FGF2	Peprotech	100-18B	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
重组人FGF-碱性（bFGF）	Peprotech	100-18B	在 100 和微量处重新上位;PBS 中的 0.1% 牛血清/人白蛋白中的 g/mL
重组人 FLT3 配体	R&D 系统	308-FKHB或 308E-GMP认证	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
重组人胰岛素	生物宝石	10-365
重组人试剂盒配体	R&D 系统	BT-SCF 或 BT-SCF-GMP	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
重组人 LIF	Peprotech	300-05	在 100 和微量处重新上位;PBS 中的 0.1% 牛/人血清白蛋白中的 g/mL
重组人TGF&β;1	Peprotech	100-21	在 100 和微量处重新上位;PBS 中的 0.1% 牛/人血清白蛋白中的 g/mL
重组人血小板生成素 	R&D 系统	288-TPN 或 288E-GMP	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
重组人转铁蛋白	米利波尔西格玛	T3705型
共效人BMP4	Peprotech	120-05	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
SB431543	塞莱克化学	S1067	在DMSO中以10 mM重构
SIGMAFAST，碱性磷酸酶底物，显色剂，片剂	米利波尔西格玛	B5655	将 1 片溶解在 10 mL 纯净水中
亚硒酸钠 Sodium 亚硒酸盐 Sodium	米利波尔西格玛	S5261
溶液中的 Stemolecule Y27632	斯特姆根特	04-0012-02	溶液中的ROCK抑制剂（10 mM）
StemPro Accutase 细胞解离试剂	赛默飞世尔科技	A11105-01
StemPro MSC SFM 异种无菌 （XF-MSC）	赛默飞世尔科技	A1067501	通过将 5mL StemPro MSC SFM XenoFree 补充剂与 500 mL StemPro MSC SFM 基础培养基混合来制备 XF-MSC 培养基。等分培养基可在-20°C下冷冻保存。
StemSpan SFEM	干细胞技术	9600
Thermo Scientific Mr. Frosty 冷冻容器	赛默飞世尔科技	5100-0001
Ulex Europaeus 凝集素 I （UEA-1），生物钛化	载体实验室	B-1065-2型	在封闭溶液中稀释 1：200 用于荧光测定
VEGF	Peprotech	100-20	重悬 AT （100 &微;g/mL）在无菌PBS中，0.1%人或牛血清白蛋白
Versene 解决方案	赛默飞世尔科技	15040066
玻连蛋白 XF 基质	干细胞技术	7180	在 40 和微量下稀释;CellAdhere 稀释缓冲液中的 L/mL
XAV939	西格玛·奥尔德里奇	X3004型	在 DMSO 中以 100 mM 重构
&β;-巯基乙醇	赛默飞世尔科技	21985-023	光敏