通过结膜下注射实现角膜感觉神经特异性耗竭：一种用于研究细菌黏附与神经免疫相互作用的模型

摘要

本研究建立了一种使用布比卡因进行角膜感觉神经耗竭的优化模型，揭示了其对角膜神经及细菌黏附的影响。该模型可模拟神经病理性状态，有助于深入理解眼部感染中的神经-免疫相互作用，并可应用于药物递送、神经保护、免疫调节以及基因修饰等研究领域。

摘要

角膜感觉神经在维持眼表完整性和免疫防御机制中起着关键作用。这种神经支配的丧失与微生物侵袭风险增加相关，但神经耗竭对角膜细菌黏附的具体影响仍缺乏充分表征。本文介绍一种可重复且时间可控的角膜感觉神经选择性抑制方法，使用长效钠通道阻滞剂布比卡因。通过结合结膜下注射与局部给药途径，这种双重给药策略可实现稳定且持续的去神经化，从而精确研究感觉输入改变如何影响角膜上皮对细菌定植的易感性。

利用该模型，我们研究感觉去神经支配如何影响微生物黏附动力学 金黄色葡萄球菌, 表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌 三种具有不同黏附机制的临床相关病原体。通过实验室擦拭印迹法进行标准化细菌接种，确保细菌均匀沉积于角膜表面，随后定量评估细菌黏附情况。布比卡因诱导的神经耗竭与角膜神经密度降低及细菌黏附增加相关，证实了感觉神经耗竭与微生物易感性之间的功能关联。

通过模拟糖尿病神经病变和神经营养性角膜炎等神经性病理状况，该方法为研究眼感染中的神经免疫相互作用提供了新的框架。除了感染模型之外，这种结膜下注射策略还为研究眼部药物的药代动力学、神经保护干预措施以及免疫调节提供了一个多功能平台。此外，该方法还可用于基因修饰研究，包括结膜下递送CRISPR/Cas载体或病毒载体，从而拓宽其在眼科研究与治疗中的应用范围。

引言

角膜感觉神经支配在维持眼表完整性和免疫稳态中起着关键作用。角膜是体内神经支配最密集的组织之一，主要由三叉神经的眼支提供神经支配¹。这些感觉神经不仅介导痛觉和眨眼反射，还调控上皮细胞增殖、伤口愈合以及免疫监视^2,3。因此，任何感觉神经支配的破坏都可能损害角膜屏障，改变眼表微环境，并增加对微生物感染的易感性。

角膜感觉功能障碍与糖尿病等全身性疾病相关，并可导致多种眼部病理改变，包括干眼症、糖尿病性角膜病变、神经营养性角膜炎以及术后并发症^{3,4,5,6,7,8,9,10}。感觉神经受损会导致泪液分泌减少、上皮变薄以及伤口愈合延迟，这些因素均有利于细菌定植^11....

方案

所有涉及动物的实验程序均遵循视觉与眼科研究协会制定的标准，并经新英格兰视光学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，同时遵守美国公共卫生服务部（PHS）关于实验动物人道护理与使用的政策。实验所用6至8周龄的雄性和雌性C57BL/6J（野生型；品系编号000664）小鼠购自杰克逊实验室，小鼠在正常的昼夜节律（12小时光照/12小时黑暗循环）条件下饲养，并自由供应食物和饮水。所有操作过程中均需保持无菌技术。

1. 结膜下注射的动物准备

1. 使用经校准的蒸发器，通过氧气输送 2-3% 的异氟烷以诱导麻醉。通过轻捏脚趾检查是否存在反射性反应，以监测麻醉深度。
2. 持续观察动物是否出现严重不适或痛苦的迹象。
3. 若观察到痛苦迹象，使用 5% 异氟烷诱导深度麻醉，并确认动物无反应。
4. 实施颈椎脱位以确保安乐死。
5. 否则，立即使用弯头摘眼球镊进行眼球摘除，用于后续分析。

2. 采用结膜下注射的角膜神经阻滞

注意：采用两步法方案，包括布比卡因的结膜下注射和局部应用，以实现角膜感觉神经的靶向耗竭。结膜下注射和局部应用需在15分钟内完成，以尽量减少全身麻醉药物暴露。

1. 术前准备与切口

结果

除非另有说明，所有实验均独立重复三次，每次重复每组包含3至4只小鼠。

布比卡因处理后角膜神经密度显著降低
为系统评估靶向角膜感觉神经耗竭的影响，采用免疫标记和共聚焦显微镜技术评估角膜神经密度。小鼠每隔一天接受一次结膜下注射布比卡因，持续15天，单独注射或联合局部用药，以比较不同给药途径对角膜神经完整性的调节效果。结膜下注射耐受性良好，未见出血、渗漏或反流现象。注射时可见一过性水泡形成，表明药物成功注入小鼠结膜下腔隙。该水泡通常在10至15秒内消退，证实注入此间隙的物质可围绕眼球扩散并分布至眼周组织，这与我们在实验模型中持续观察到的现象一致。

在第15天，采集角膜组织并针对神经元标志物β-tubulin III进行免疫染色，以可视化并定量角膜神经密度。采用共聚焦显微镜进行高分辨率成像，并进行盲法评分，以确保不同处理组间定量结果的客观性和可重复性。我们还评估了在相似处理方案下第7天的神经密度（数据未显示），结果显示在此时间点神经纤维无明显减少，支持我们采用延长至15天实验方案的合理性。如前.......

讨论

角膜感觉神经在维持眼表完整性、调节上皮稳态以及调控免疫反应中起着关键作用。角膜神经炎以神经变性和炎症为特征，常见于糖尿病等全身性疾病中，其中慢性高血糖可导致包括角膜神经丢失在内的周围神经病变。研究表明，糖尿病性神经病变可导致角膜敏感性下降、干眼、伤口愈合受损，并增加神经营养性角膜病变的风险^8,9,10,24，该病症表现为持续性上皮缺损及易受微生物感染^25,26。

糖尿病小鼠模型，包括瘦素缺乏（ob/ob）和瘦素受体缺乏（db/db）等遗传模型，已被广泛用于研究糖尿病相关的角膜神经炎^27,28

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 盐酸布比卡因溶液	Pfizer INC. USA	NDC 00409-1162-01
30 G 针头	制造商：BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖	305106
33 G 小柄钝头针（3 型针尖）	Hamilton Company，美国内华达州里诺	7803-05
4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	D1306
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	A7906
C57BL/6J（野生型）小鼠	Jackson Laboratory	. 000664
离心旋转仪	The Lab Depot, Inc.（美国佐治亚州道森维尔）	R2020
透明指甲保护剂	Wet and Wild	N/A
解剖显微镜（SMZ-160-TLED 立体（解剖）显微镜，带三目接口）	Stellar Scientific（美国马里兰州巴尔的摩）	1.1002E+12
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	E6511
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	A-11008
Hamilton 10-μL 注射器	Hamilton Company，美国内华达州里诺	7635-01
高精度解剖微型剪刀	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	08-953-1B
异氟烷	Patterson Veterinary，美国	07-890-8115
异氟烷蒸发器	Kent Scientific，美国	VETFLO1205S
盐酸氯胺酮	Dechra Veterinary Products，美国堪萨斯州欧弗兰帕克	DP00050
Kimwipe 无尘擦拭纸	Kimberly-Clark Professional，美国佐治亚州罗斯韦尔	34155
微解剖镊（弯头前端，用于摘除眼球）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	F4142-1EA
微解剖镊（直头前端）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	F4017
培养皿（100 mm）	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	263991
培养皿（35 mm）	Avantor，通过 VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺）	25373-041
磷酸盐缓冲液	Thomas Scientific，美国新泽西州斯韦兹伯勒	C987D24
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	P36930
兔抗-β-微管蛋白 III	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）	T2200
圆形盖玻片德国玻璃（8 mm）	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	50-949-314
手术刀柄	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）	S2896-1EA
载玻片	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）	S8902-1PAK
snap cap 低吸附微量离心管	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	3453
Sorvall Instruments RT6000B 台式离心机	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	3367898
手术用羽毛刀片	World Precision Instruments（美国佛罗里达州萨拉索塔）	504169
胰蛋白酶大豆琼脂	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）	22091
赛拉嗪	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	1236-20-8