本研究建立了一种使用布比卡因进行角膜感觉神经耗竭的优化模型，揭示了其对角膜神经及细菌黏附的影响。该模型可模拟神经病理性状态，有助于深入理解眼部感染中的神经-免疫相互作用，并可应用于药物递送、神经保护、免疫调节以及基因修饰等研究领域。
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摘要
摘要
角膜感觉神经在维持眼表完整性和免疫防御机制中起着关键作用。这种神经支配的丧失与微生物侵袭风险增加相关，但神经耗竭对角膜细菌黏附的具体影响仍缺乏充分表征。本文介绍一种可重复且时间可控的角膜感觉神经选择性抑制方法，使用长效钠通道阻滞剂布比卡因。通过结合结膜下注射与局部给药途径，这种双重给药策略可实现稳定且持续的去神经化，从而精确研究感觉输入改变如何影响角膜上皮对细菌定植的易感性。
利用该模型，我们研究感觉去神经支配如何影响微生物黏附动力学 金黄色葡萄球菌, 表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌 三种具有不同黏附机制的临床相关病原体。通过实验室擦拭印迹法进行标准化细菌接种，确保细菌均匀沉积于角膜表面，随后定量评估细菌黏附情况。布比卡因诱导的神经耗竭与角膜神经密度降低及细菌黏附增加相关，证实了感觉神经耗竭与微生物易感性之间的功能关联。
通过模拟糖尿病神经病变和神经营养性角膜炎等神经性病理状况，该方法为研究眼感染中的神经免疫相互作用提供了新的框架。除了感染模型之外，这种结膜下注射策略还为研究眼部药物的药代动力学、神经保护干预措施以及免疫调节提供了一个多功能平台。此外，该方法还可用于基因修饰研究，包括结膜下递送CRISPR/Cas载体或病毒载体，从而拓宽其在眼科研究与治疗中的应用范围。
引言
角膜感觉神经支配在维持眼表完整性和免疫稳态中起着关键作用。角膜是体内神经支配最密集的组织之一，主要由三叉神经的眼支提供神经支配1。这些感觉神经不仅介导痛觉和眨眼反射，还调控上皮细胞增殖、伤口愈合以及免疫监视2,3。因此，任何感觉神经支配的破坏都可能损害角膜屏障，改变眼表微环境，并增加对微生物感染的易感性。
角膜感觉功能障碍与糖尿病等全身性疾病相关，并可导致多种眼部病理改变，包括干眼症、糖尿病性角膜病变、神经营养性角膜炎以及术后并发症3,4,5,6,7,8,9,10。感觉神经受损会导致泪液分泌减少、上皮变薄以及伤口愈合延迟，这些因素均有利于细菌定植11,12。然而，感觉神经缺失与细菌黏附之间的具体作用机制尚未被充分阐明。尽管已有研究证实角膜去神经化后细菌黏附增加，但目前仍缺乏可标准化的模型以对这一关系进行可控性研究。
为弥补这一空白，我们开发了一种使用布比卡因靶向耗竭角膜感觉神经的模型。布比卡因是一种长效钠通道阻滞剂，可模拟临床神经病变但不会造成永久性神经损伤13,14,15。这种药理学方法为研究角膜神经耗竭及其对眼表的影响提供了可控且可重复的手段15。通过将该模型与细菌黏附实验相结合，我们能够系统评估感觉神经耗竭对微生物定植的影响，从而模拟糖尿病性角膜病变和神经营养性角膜炎的关键特征。
微生物黏附是角膜感染中的关键早期事件，受泪膜成分、上皮表面特性及宿主免疫反应的影响。在能够定植于眼表的多种病原体中， 金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌， 和 P. aeruginosa 代表三种具有不同黏附机制的临床重要细菌。 P. aeruginosa一种高毒力的革兰氏阴性菌，利用菌毛、鞭毛及分泌的毒力因子迅速黏附并侵入角膜上皮细胞，常导致严重的溃疡性角膜炎16,17相比之下， S. epidermidis一种革兰氏阳性共生细菌，主要利用受损的上皮表面和泪膜改变来形成生物膜，从而导致持续性且常为亚临床的感染18,19这些物种间黏附策略的差异凸显了深入理解角膜神经耗竭如何改变眼部微环境以利于细菌定植的必要性。
研究细菌黏附的一个关键挑战在于选择合适的接种模型。传统的划痕损伤模型在感染研究中被广泛使用，该模型通过造成上皮缺损以促进细菌黏附。尽管该方法在模拟创伤诱导的感染方面有效，但会引入显著的混杂因素，包括过度的组织损伤和过度的炎症反应，这些并不能准确反映神经麻痹性角膜上细菌定植的早期阶段。此外，机械性损伤的变异性使得实验结果难以重复。为了克服这些局限性，需要一种更为可控且具有生理相关性的细菌接种方法。
实验室擦拭印迹技术为细菌沉积提供了一种标准化的方法，可在不破坏上皮屏障的情况下确保细菌均匀黏附20。该方法高度模拟了现实世界中的易感情况，即在无明显机械损伤的情况下，细菌黏附发生在泪液成分改变和上皮稳态失衡的条件下。通过消除机械损伤带来的变异性，实验室擦拭印迹法能够更准确地评估神经病变角膜中微生物黏附的动力学过程。此外，该方法还可对泪膜在细菌定植中的作用进行可控性评估，这在角膜感觉功能障碍导致泪液分泌受损的情况下尤为重要。
鉴于角膜感觉神经在调节泪液分泌和上皮稳态中的关键作用，建立一个可重复的研究感觉神经耗竭对微生物黏附影响的模型至关重要。本研究旨在优化一种使用布比卡因（一种长效局部麻醉药）靶向耗竭角膜感觉神经的实验方案，以评估其对泪液分泌和细菌黏附的影响。通过结合结膜下注射与局部应用布比卡因的方法，该策略可在预定的时间点实现局部且持续的感觉神经功能抑制。利用此模型，我们研究了感觉神经去神经化如何改变金黄色葡萄球菌（S. aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的黏附动力学，从而深入揭示神经耗竭、泪膜改变与微生物易感性之间的关系。这些发现对于理解糖尿病性角膜病变和神经营养性角膜炎等神经病变状态下感染易感性的机制具有重要意义，并为未来关于眼表神经免疫相互作用及治疗干预的研究奠定了基础。
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方案
所有涉及动物的实验程序均遵循视觉与眼科研究协会制定的标准，并经新英格兰视光学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，同时遵守美国公共卫生服务部（PHS）关于实验动物人道护理与使用的政策。实验所用6至8周龄的雄性和雌性C57BL/6J（野生型；品系编号000664）小鼠购自杰克逊实验室，小鼠在正常的昼夜节律（12小时光照/12小时黑暗循环）条件下饲养，并自由供应食物和饮水。所有操作过程中均需保持无菌技术。
1. 结膜下注射的动物准备
- 使用经校准的蒸发器，通过氧气输送 2-3% 的异氟烷以诱导麻醉。通过轻捏脚趾检查是否存在反射性反应，以监测麻醉深度。
- 持续观察动物是否出现严重不适或痛苦的迹象。
- 若观察到痛苦迹象，使用 5% 异氟烷诱导深度麻醉，并确认动物无反应。
- 实施颈椎脱位以确保安乐死。
- 否则，立即使用弯头摘眼球镊进行眼球摘除，用于后续分析。
2. 采用结膜下注射的角膜神经阻滞
注意：采用两步法方案，包括布比卡因的结膜下注射和局部应用，以实现角膜感觉神经的靶向耗竭。结膜下注射和局部应用需在15分钟内完成，以尽量减少全身麻醉药物暴露。
- 术前准备与切口
- 使用30 G针头在颞上方角膜缘区域制作一个微小（约0.5 mm）的切口。避免损伤血管，尽量减少组织创伤。利用该切口进入结膜下间隙，以实现可控的药物递送。
- 布比卡因注射
- 在无菌条件下配制0.5%盐酸布比卡因溶液。
- 用Hamilton 10 µL注射器（配备33 G小柄钝针，针型3）吸取5 µL上述溶液。
- 以15–20°角将溶液注入结膜下间隙，以减少反流并确保药物均匀分布。
- 观察注射部位是否形成隆起（bleb）；使其持续存在5–10秒，并在结膜下腔隙内扩散直至完全吸收。
- 角膜表面脱敏的加强处理
- 在完成结膜下注射后，立即在中央角膜表面再滴加5 µL的0.5%布比卡因。
注：此步骤用于增强角膜表面神经的脱敏效果，并延长局部麻醉作用时间。
- 在完成结膜下注射后，立即在中央角膜表面再滴加5 µL的0.5%布比卡因。
- 对照组处理
- 对对照组动物，在相同时间点通过结膜下注射和表面滴加方式给予5 µL磷酸盐缓冲液（PBS）。操作步骤和给药体积需与实验组一致，以排除注射操作本身的影响。
- 治疗周期与终点分析
- 每间隔一天给予一次布比卡因处理，持续15天，以实现持续的感觉神经耗竭，同时最小化毒性作用。
- 第15天，在最后一次布比卡因处理4小时后，使用校准挥发器以5%异氟烷混合氧气对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
- 立即从小鼠的一组中采集角膜（见步骤5.5），用于通过免疫组织化学方法评估神经密度变化（参见图1及方案第6节），并从另一组采集角膜用于细菌黏附分析（参见图1及方案第5节）。
3. 细菌接种前的动物准备
- 在第15天最后一次布比卡因注射和局部应用后4小时，对小鼠腹腔注射氯胺酮（80–100 mg/kg）和右美托咪定（0.25–0.5 mg/kg）以进行麻醉。
- 通过检测脚趾夹捏后无反射性反应，确认小鼠处于深麻醉状态。
- 使用移液器以5 µL无菌PBS冲洗眼表3次，以去除残留的泪液和碎屑，确保角膜表面清洁，便于进行细菌黏附研究（见图1）。
- 在指定的实验组中，使用无尘实验室擦拭纸以标准化方式轻拭角膜表面。
- 将擦拭纸折叠，以确保握持牢固。
- 轻轻擦拭麻醉小鼠的角膜4次，从中央角膜开始，以旋转动作向左右两侧移动，覆盖周边区域20。
注意：施加最小压力，以避免机械性损伤，同时有效去除泪液，促进细菌黏附。
4. 细菌接种物的制备与角膜接种
- 细菌培养与制备
- 在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上培养S. aureus ATCC 25923、S. epidermidis ATCC 12228 和 P. aeruginosa O1，并于37 °C培养箱中孵育，同时在培养箱内放置无菌水以维持湿度。
- 挑取单菌落并悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中。将菌悬液在5,000 × g 条件下离心5分钟，以去除死菌及代谢副产物。
- 将菌体沉淀重新悬浮于PBS中，并调整浓度至约10¹¹ CFU/mL，以确保黏附实验中具有较高的细菌载量。
- 角膜接种方案
- 在持续麻醉条件下，每小时向角膜表面滴加5 µL制备好的细菌悬液，共进行4次。
- 将小鼠置于轻微倾斜的位置，防止液体流失，确保接种物与角膜接触的一致性。
- 按小时间隔重复接种，以模拟临床上持续细菌暴露的感染情况。
- 接种后安乐死及细菌黏附评估
- 接种4小时后，通过腹腔注射给予氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg），确保深度麻醉。
- 采用颈椎脱位法人道处死小鼠。
- 在严格无菌条件下，使用无菌弯头镊摘除眼球，避免污染。
- 将眼球置于含2 mL无菌PBS的培养皿中，轻轻振荡冲洗5–6次，彻底去除未黏附的细菌。
- 使用机械组织匀浆器将摘除的眼球在1 mL无菌PBS中匀浆，确保细菌回收的一致性，并维持无菌条件以防污染。
- 将匀浆液用无菌PBS进行连续六倍梯度稀释。
- 取各稀释度的等分试样接种于TSA平板，于37 °C过夜培养，以促进菌落生长。
- 计数菌落形成单位（CFU），并将结果表示为每角膜的log CFU值，用于定量比较。
5. 免疫组织化学
- 在处理后第15天通过颈椎脱位法处死小鼠。
- 小心摘除眼球，并在室温下轻轻旋转，用PBS冲洗一次。
- 将摘除的眼球置于2%多聚甲醛（PFA）中固定1小时，以保持结构完整性。
- 在室温下轻轻旋转，用1 mL PBS对固定后的眼球清洗3次，每次10分钟。
- 按照先前描述的角膜解剖方案21,22
- 在直径35 mm的培养皿中进行角膜解剖，皿内加入少量PBS。
- 使用直头镊子固定摘除的眼球，用手术剪在眼球后部制造一个小切口。
- 以该小切口为起点，沿眼球后部小心地环绕切割360°。
- 弃去小鼠的视网膜、视神经、晶状体、虹膜色素以及非角膜的其他组织结构。
- 使用直头镊子或小心地用手术剪切除多余组织，同时保持角膜完整。
- 将解剖后的角膜置于微量离心管中，加入1 mL PBS，在室温下轻轻旋转清洗3次，每次10分钟。
- 将角膜置于1 mL封闭液（含3% BSA和Triton X-100的PBS溶液）中，在室温下持续旋转孵育1小时。
- 在相同条件下，将角膜置于1 mL 20% EDTA中进一步孵育1小时，以增强组织通透性。
- 在4 °C下，将角膜与兔抗β-Tubulin III一抗在室温下轻轻旋转孵育过夜。
- 次日，在4 °C避光条件下，将组织与Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗及DAPI共同孵育2–3小时，用于核染色。
- 在室温下轻轻旋转，用PBS清洗角膜3次，每次10分钟。
- 按照先前所述的角膜平铺封片方案21,22
- 将染色后的角膜平铺于载玻片上，将角膜边缘置于载玻片边缘以去除多余液体。
- 将角膜重新定位至载玻片中央，上皮面朝下，与载玻片表面接触。
- 使用手术刀片从周边向中心做四个直线切口（长度1–2 mm），形成半象限结构。
- 加入20 µL封片剂，并将8 mm玻璃盖玻片覆盖于角膜上。
- 轻轻按压盖玻片，以去除气泡并防止角膜皱缩。
- 将样品在室温避光条件下存放，使其自然干燥。
- 用透明指甲保护剂密封盖玻片边缘，防止干燥，并将载玻片避光保存，直至成像前。
6. 成像
- 使用配备20倍/1.00数值孔径（NA）水浸式物镜的直立双光子共聚焦显微镜进行共聚焦显微成像。
- 将平铺样品放置于显微镜载物台上，并安装20倍/1.00 NA水浸物镜。
- 调暗室内光线，并用不透明黑色布料覆盖显微镜，以尽量减少成像过程中的外界光干扰。
- 使用Alexa Fluor 488 nm激光通道观察角膜神经，使用DAPI 405 nm激光通道检测细胞核。
- 将帧尺寸设置为1,536 × 1,536，针孔设置为1艾里单位（AU），扫描速度设置为1.02 µs。启用双向扫描并应用2倍平均。
- 调节主增益（约750 V），在确保图像清晰的前提下，尽量降低激光功率强度，以防止光漂白和光毒性。
- 进行Z轴层扫成像以获取完整的角膜厚度信息。将第一焦平面设置在样品最前部，最后焦平面设置在样品最后部。
- 以0.8 µm或1.0 µm步长间隔采集Z轴层扫图像，每个样品大约采集60–80层图像。
- 角膜神经密度评估
- 使用Imaris软件分析角膜神经密度。
- 通过检查体积尺寸确认图像的完整厚度。
- 启用体渲染选项以生成三维重建图像。
- 创建最大强度投影，将Z轴层扫图像转换为二维视图，用于可视化和定量分析。
- 由不知分组信息的评估者按照0–10分制对角膜神经密度进行评分，以确保评估的客观性。
7. 统计分析
- 使用 Shapiro-Wilk 检验和 Kolmogorov-Smirnov 检验评估数据分布。
- 若大部分数据符合正态分布，则以均值 ± 标准差（SD）表示结果。
- 对于两组之间的比较，采用 Student t 检验；对于三组或更多组的分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验。
- 将 p 值 < 0.05 视为具有统计学意义。
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结果
除非另有说明，所有实验均独立重复三次，每次重复每组包含3至4只小鼠。
布比卡因处理后角膜神经密度显著降低
为系统评估靶向角膜感觉神经耗竭的影响，采用免疫标记和共聚焦显微镜技术评估角膜神经密度。小鼠每隔一天接受一次结膜下注射布比卡因，持续15天，单独注射或联合局部用药，以比较不同给药途径对角膜神经完整性的调节效果。结膜下注射耐受性良好，未见出血、渗漏或反流现象。注射时可见一过性水泡形成，表明药物成功注入小鼠结膜下腔隙。该水泡通常在10至15秒内消退，证实注入此间隙的物质可围绕眼球扩散并分布至眼周组织，这与我们在实验模型中持续观察到的现象一致。
在第15天，采集角膜组织并针对神经元标志物β-tubulin III进行免疫染色，以可视化并定量角膜神经密度。采用共聚焦显微镜进行高分辨率成像，并进行盲法评分，以确保不同处理组间定量结果的客观性和可重复性。我们还评估了在相似处理方案下第7天的神经密度（数据未显示），结果显示在此时间点神经纤维无明显减少，支持我们采用延长至15天实验方案的合理性。如前...
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讨论
角膜感觉神经在维持眼表完整性、调节上皮稳态以及调控免疫反应中起着关键作用。角膜神经炎以神经变性和炎症为特征，常见于糖尿病等全身性疾病中，其中慢性高血糖可导致包括角膜神经丢失在内的周围神经病变。研究表明，糖尿病性神经病变可导致角膜敏感性下降、干眼、伤口愈合受损，并增加神经营养性角膜病变的风险8,9,10,24，该病症表现为持续性上皮缺损及易受微生物感染25,26。
糖尿病小鼠模型，包括瘦素缺乏（ob/ob）和瘦素受体缺乏（db/db）等遗传模型，已被广泛用于研究糖尿病相关的角膜神经炎27,28
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披露
作者声明无任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 盐酸布比卡因溶液 | Pfizer INC. USA | NDC 00409-1162-01 | |
| 30 G 针头 | 制造商：BD Biosciences，美国新泽西州富兰克林湖 | 305106 | |
| 33 G 小柄钝头针（3 型针尖） | Hamilton Company，美国内华达州里诺 | 7803-05 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | D1306 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | A7906 | |
| C57BL/6J（野生型）小鼠 | Jackson Laboratory | . 000664 | |
| 离心旋转仪 | The Lab Depot, Inc.（美国佐治亚州道森维尔） | R2020 | |
| 透明指甲保护剂 | Wet and Wild | N/A | |
| 解剖显微镜（SMZ-160-TLED 立体（解剖）显微镜，带三目接口） | Stellar Scientific（美国马里兰州巴尔的摩） | 1.1002E+12 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | E6511 | |
| 山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | A-11008 | |
| Hamilton 10-μL 注射器 | Hamilton Company，美国内华达州里诺 | 7635-01 | |
| 高精度解剖微型剪刀 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 08-953-1B | |
| 异氟烷 | Patterson Veterinary，美国 | 07-890-8115 | |
| 异氟烷蒸发器 | Kent Scientific，美国 | VETFLO1205S | |
| 盐酸氯胺酮 | Dechra Veterinary Products，美国堪萨斯州欧弗兰帕克 | DP00050 | |
| Kimwipe 无尘擦拭纸 | Kimberly-Clark Professional，美国佐治亚州罗斯韦尔 | 34155 | |
| 微解剖镊（弯头前端，用于摘除眼球） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | F4142-1EA | |
| 微解剖镊（直头前端） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | F4017 | |
| 培养皿（100 mm） | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 263991 | |
| 培养皿（35 mm） | Avantor，通过 VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺） | 25373-041 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thomas Scientific，美国新泽西州斯韦兹伯勒 | C987D24 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | P36930 | |
| 兔抗-β-微管蛋白 III | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯） | T2200 | |
| 圆形盖玻片德国玻璃（8 mm） | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 50-949-314 | |
| 手术刀柄 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯） | S2896-1EA | |
| 载玻片 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯） | S8902-1PAK | |
| snap cap 低吸附微量离心管 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 3453 | |
| Sorvall Instruments RT6000B 台式离心机 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 3367898 | |
| 手术用羽毛刀片 | World Precision Instruments（美国佛罗里达州萨拉索塔） | 504169 | |
| 胰蛋白酶大豆琼脂 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯） | 22091 | |
| 赛拉嗪 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | 1236-20-8 |
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