本文介绍一种从共转导的T细胞混合物中选择性纯化双转导T细胞的实验方案。该方法结合使用两种逆转录病毒载体，每种载体编码基于成对亮氨酸拉链的细胞分选技术中的一个组分，从而实现对双载体转导细胞的选择性免疫磁珠纯化。
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本文介绍一种从共转导的T细胞混合物中选择性纯化双转导T细胞的实验方案。该方法结合使用两种逆转录病毒载体，每种载体编码基于成对亮氨酸拉链的细胞分选技术中的一个组分，从而实现对双载体转导细胞的选择性免疫磁珠纯化。
包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞在内的过继性T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面已显示出显著的临床疗效，并在实体瘤治疗中展现出良好前景。尽管取得了这些成功，但仍发现多种限制T细胞免疫治疗疗效的耐药机制，包括靶抗原的缺失或弱表达、T细胞耗竭的发生以及免疫抑制性肿瘤微环境的存在。目前已开发出多种细胞工程策略以克服这些耐药机制。然而，多种耐药机制可能同时发生，因此需要联合应用多种工程策略以优化抗肿瘤活性。载体包装容量的限制阻碍了向T细胞递送大量遗传信息，使得多种工程化结构的共表达面临挑战。本文介绍一种利用两种载体共转导T细胞以编码多个转基因的实验方案，从而增加工程化功能的数量。通过共表达一种基于亮氨酸拉链的细胞分选方法（称为Zip-sort），我们实现了对已整合两种不同载体的双转导细胞进行选择性免疫磁珠纯化。
CAR T细胞疗法彻底改变了B细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗1,2。目前，CAR T细胞也正在被研究用于实体肿瘤恶性疾病3。然而，已发现CAR T细胞疗法失败的多种反复出现的机制，包括CAR靶向抗原分子表达低下或丢失、T细胞功能障碍（耗竭）的发生、肿瘤微环境的主动免疫抑制，以及T细胞向肿瘤微环境迁移受限和在其中的持续性不足3,4,5,6。尽管已针对每种CAR T细胞耐药机制设计了单独的工程化解决方案3，但由于逆转录病毒和慢病毒载体系统的遗传包装容量有限，将多种工程化功能同时引入细胞治疗产品以克服多种耐药机制仍具有挑战性7。
为了克服载体包装容量的限制，越来越多地采用多种载体共转导T细胞的方法。在临床前研究中，载体共转导已被用于研究逻辑门控和药物调控的T细胞工程策略8,
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动物实验在希望之城（COH）Parvin动物研究实验室进行，实验方案#23145已获希望之城机构动物护理与使用委员会批准；同时在纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）动物饲养室进行，实验方案#99-07-025已获纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理与使用委员会批准。人源T细胞从去标识化的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离获得，这些PBMCs来源于希望之城血液捐献中心的白细胞减少滤器，并经Ficoll-Paque法纯化，使用过程遵循实验方案#24427，已获希望之城机构审查委员会批准。所有操作均按照机构生物安全标准执行。
1. Zip-sort 载体设计
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在本实验方案中，我们展示了使用两种不同的逆转录病毒载体双重转导T细胞后的共转导及单步免疫磁珠筛选方法（称为Zip-sort，图1）13。每个载体编码一个异源二聚化亮氨酸拉链对中的一个组分，该拉链对选择性地展示在双重转导T细胞的表面（图1A）。载体1表达可分泌的亲和标签拉链，其在细胞内与由载体2表达的膜结合捕获拉链配对。本文评估了具有短铰链间隔区的Zip-sort捕获拉链设计（图1A-B）以及具有较长延伸间隔区的设计，如Thy1.1、EGFR、PD-1和CD200R（图1B）。具有短铰链间隔区的捕获拉链不会与可分泌拉链在胞外显著配对。然而，对于具有延伸间隔区的捕获拉链，我们发现有必要进一步设计阻断型拉链修饰，以防止非特异性的胞外拉链配对（图1B-D.......
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本文描述了一种用于生成Zip-sort载体组合、制备逆转录病毒、共转导小鼠和人T细胞以及通过免疫磁珠法纯化双转导细胞（Zip-sort）的实验方案。上述方案已针对逆转录病毒载体以及小鼠和人T细胞进行了优化。尽管Zip-sort方法尚未在其他载体系统中进行评估，但原则上，其他载体系统也可能兼容，包括慢病毒17、转座子18或位点特异性同源定向修复模板整合19，前提是能够实现足够高的表面表达水平。对于需要更大包装容量的用户，可根据各载体系统报道的最大载荷能力7，考虑采用这些替代性包装策略。我们发现，当亲和标签拉链在细胞表面以低密度或高密度表达时，Zip-sort方法均能获得高度纯化的细胞，但高产量分选需要亲和标签在细胞表面高密度表达。Zip-sort载体应优化设计，将拉链序列置于多顺反子转录本中高表达的位置，因为由2A肽分隔的多个转基因序列中，外源基因的位置可能影响其表达效率20。应特别注意确保多顺反子mR.......
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A.R.、S.C.、S.E.J. 和 M.v.d.B. 是与 Zip-sort 技术相关的专利申请的共同发明人。A.P.B. 为 Abbvie 和 Bristol Myers Squibb 提供咨询顾问服务。M.v.d.B. 曾获得 Seres Therapeutics 的科研资助，并持有 Seres Therapeutics 和 ThymoFox 的股票期权；他从 Wolters Kluwer 获得过版税；他曾为 Seres Therapeutics、Vor Biopharma、Rheos Medicines、Frazier Healthcare Partners、Nektar Therapeutics、Notch Therapeutics、Ceramedix、Lygenesis、Pluto Therapeutics、GlaskoSmithKline、Da Volterra、ThymoFox、Garuda、Novartis（配偶）、Synthekine（配偶）、Beigene（配偶）、Kite（配偶）、MustangBio（配偶）和 Cellectar（配偶）提供咨询、获取过酬金或参与其顾问委员会；他与 Seres Therapeutics 和 Juno Therapeutics 拥有知识产权许可协议；他在 DKMS（一家非营利组织）基金会董事会中担任受托人职务；同时，他还是 Smart Immune 科学顾问委员会的主席。
S.C. 获得了德国研究基金会（研究奖学金；Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的支持。S.E.J. 获得了美国国家癌症研究所（NCI）职业发展奖（资助编号 K08-CA252157）的支持。S.E.J. 还获得了美国临床肿瘤学会（青年研究者奖）、国家骨髓捐赠计划（Amy 计划奖）以及帕克癌症免疫治疗研究所（Bridge Scholar 奖）的支持。van den Brink 实验室的研究得到了美国国家癌症研究所资助项目 P01-CA023766、R35-CA284024、R01-CA228308；国家心肺血液研究所资助项目 R01-HL164902，以及国家老龄化研究所资助项目 P01-AG052359 的支持。本研究部分得到了 Deana 和 Steve Campbell 首席医师执行官杰出讲席基金的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肿瘤细胞系相关 | |||
| C1498 | ATCC | TIB-49 | |
| BM185-CD19 | 参考文献13 | ||
| BM185-CD20 | 参考文献13 | ||
| 4D-Nucleofector核心单元 | Lonza | AAF-1003B | |
| 4D-Nucleofector X单元 | Lonza | AAF-1003X | |
| Lonza SF缓冲液试剂盒 | |||
| 病毒生产 | |||
| 10 cm组织培养（TC）处理细胞培养皿 | Corning | 353003 | |
| 50 mL锥形管 | Thermo Scientific | 339652 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | |
| pENTR1a质粒 | Addgene | 17398 | |
| LZRS-Rfa | Addgene | 31601 | |
| PB MMLV puro（小鼠T细胞病毒载体） | 参考文献13 | ||
| PB SFG blastR（人T细胞病毒载体） | 参考文献13 | ||
| pCMV-hyPBase | Sanger研究所 | ||
| Phoenix-Eco | ATCC | CRL-3214 | |
| Phoenix-Eco alpha V beta 3 | 参考文献13 | 经修饰的Phoenix-Eco，可更高效地黏附于培养瓶 | |
| PB-EF1a内含子WPRE mCD4 P2A MCS整合素beta 3 | 参考文献13 | 可选，用于增强包装细胞系对培养瓶的黏附能力 | |
| PB-EF1a内含子WPRE hCD8a 2A整合素alpha V | 参考文献13 | 可选，用于增强包装细胞系对培养瓶的黏附能力 | |
| Biovec-RD113 | Biovec Pharma | ||
| Biovec-RD113 alpha V beta 3 | Biovec Pharma | 本研究，转染了alpha V beta 3载体 | |
| Millex-HV注射器滤器（0.45 μm） | Millipore | SLHVR33RRS | |
| 聚乙二醇8000（PEG） | Fisher Scientific | BP233-1 | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | S271-500 | |
| 嘌呤霉素 | Santa Cruz Biotech | sc-108071B | |
| 杀稻瘟菌素 | Santa Cruz Biotech | sc-204655 | |
| T175 TC处理培养瓶 | Corning | 353112 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Gibco | 25200056 | |
| 细胞培养基 | |||
| 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| RPMI1640 | Gibco | 11-875-119 | |
| DMEM | Gibco | 11-965-118 | |
| FBS | Sigma | F2442 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-163 | |
| 丙酮酸钠 | Gibco | 11360070 | |
| T细胞刺激/转导 | |||
| 15 mL锥形管 | Thermo Scientific | 339650 | |
| 6孔非TC板 | Gibco | 351146 | |
| 6孔TC板 | Gibco | 353046 | |
| 抗CD19微珠 | Miltenyi Biotec | 130-121-301 | |
| InVivoMab抗小鼠CD28（克隆37.51） | BioXCell | BE0015-1 | |
| InVivoPlus抗小鼠CD3ε（克隆145-2C11） | BioXCell | BE0001-1 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A4737-1G | |
| 达沙替尼 | Cayman Chemical | 11498 | |
| Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28 | Gibco | 11131D | |
| EDTA（0.5 M），pH 8.0，无RNase | Invitrogen | AM9260G | |
| HybriMax红细胞裂解缓冲液 | Sigma | R7757-100ML | |
| LD柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| 人Pan T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-535 | |
| Dynamag-15磁力架 | Invitrogen | 12301D | |
| 磷酸盐缓冲液（1X） | Corning | 21040CV | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| rhIL-2 | Proleukin（阿地白介素） | ||
| T25细胞培养瓶 | Corning | 353109 | |
| Zip-sort | |||
| µMACS DYKDDDDK分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-101-591 | |
| 人CD34微珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | |
| QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| LS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 流式细胞术与细胞监测 | |||
| 抗CD90.1 Thy1.1 APC（克隆OX-7） | BD Biosciences | 货号# 561409；RRID:AB_10683163 | |
| 抗V5标签抗体（克隆4C12E11）iFluor 488 | GenScript | 货号# A01803，RRID:AB_2925231 | |
| Myc PE | Cell Signaling Technology | 货号# 2233；RRID:AB_823474 | |
| Myc Alexa 647 | Cell Signaling Technology | 货号# 2233；RRID:AB_823474 | |
| APC抗DYKDDDK标签（克隆L5） | BioLegend | 货号# 637307；RRID:AB_2561496 | |
| 小鼠抗CD34抗体，Alexa Fluor 647（克隆QBEnd/10） | Novus Biologicals | 货号# NBP2-34713AF647；RRID:AB_2925234 | |
| Streptag FITC | GenScript | 货号# A01736；RRID:AB_2622221 | |
| Incucyte SX5 | Sartorius | ||
| Penteon流式细胞仪 | Agilent |
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