基于亮氨酸拉链的细胞分选，用于纯化双载体转导的细胞

摘要

在这里，我们描述了一种从共转导的T细胞混合物中选择性纯化双转导的T细胞的方案。该方法结合了两种逆转录病毒载体，每种载体编码基于亮氨酸拉链的配对细胞分选方法的一个组分，该方法能够对双载体转导的细胞进行选择性免疫磁纯化。

摘要

过继性 T 细胞疗法，包括嵌合抗原受体 （CAR） T 细胞，已显示出对血液系统恶性肿瘤的令人印象深刻的临床活性，并在治疗实体瘤恶性肿瘤方面显示出前景。尽管取得了这些成功，但已经确定了限制治疗成功的多种 T 细胞免疫疗法耐药机制，包括靶抗原的丧失或表达减弱、T 细胞耗竭的发展以及免疫抑制肿瘤微环境的存在。已经开发了多种细胞工程策略来克服这些耐药机制。然而，多种耐药机制可能同时发生，因此需要结合多种工程策略来优化抗肿瘤活性。载体包装限制限制了向 T 细胞传递大量遗传信息，并为共表达多种工程构建体带来了挑战。在这里，我们描述了一种用两个载体共转导T细胞以编码多个转基因的方案，从而增加工程功能的数量。通过共表达基于亮氨酸拉链的细胞分选方法，称为 Zip-sort，我们指导了包含两种不同载体的双转导细胞的选择性免疫磁纯化。

引言

CAR T 细胞疗法彻底改变了 B 细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗 ^1,2。CAR T 细胞也在研究实体瘤恶性肿瘤³。然而，已经确定了CAR T细胞治疗失败的复发机制，包括CAR靶抗原分子表达不良或丢失，T细胞功能障碍（耗竭）的发展，肿瘤微环境的主动免疫抑制，以及有限的T细胞运输到肿瘤微环境中并持续存在3,4,5,6 .虽然已经设计了单独的工程解决方案来尝试克服这些 CAR T 细胞耐药机制中的每一种³，但由于逆转录病毒和慢病毒载体系统的基因包装能力有限，将多种工程功能引入细胞治疗产品以同时克服多种耐药机制具有挑战性⁷。

为了克服载体包装能力的限制，T细胞与多个载体的共转导已被越来越多地使用。载体共转导已用于临床前研究 ^8,9,10 和最近的一项评估 CD19/CD22 双 CAR T 细胞克服载体包装限制的临床试验中研究逻辑门控和药物调节的 T 细胞工程策略¹¹。然而，共转导产生含有单转导和双转导 T 细胞组合的混合细胞产物，如果它依赖于两种载体编码的成分，这可能会损害产物的功能，并且还可能导致单转导 T 细胞之间的竞争¹²。

为了克服这些挑战，我们开发了一种称为 Zip-sort 的方法，该方法使用异二聚化亮氨酸拉链（每个拉链均由两个共转导载体之一表达）来指导双转导细胞的单步免疫磁纯化¹³。在本协议中，我们描述了构建逆转录病毒载体的方法，该载体结合了我们的 Zip 排序方法、逆转录病毒上清液的产生和浓缩、T 细胞活化和共转导以及双转导细胞的免疫磁纯化（Zip 排序）。

方案

动物研究是在希望之城 （COH） Parvin 动物研究实验室根据 COH 机构动物护理和使用委员会批准的协议 #23145 进行的，并在纪念斯隆凯特琳癌症中心 （MSKCC） 动物饲养室根据协议 #99-07-025 进行的经 MSKCC 机构动物护理和使用委员会批准。人 T 细胞是从去识别化的外周血单核细胞 （PBMC） 中分离出来的，这些细胞是从希望之城献血中心获得的白细胞减少过滤器中 Ficoll-Paque 纯化的，并根据希望之城机构审查委员会批准的协议 #24427 使用。所有程序均按照机构生物安全标准进行。

1. 压缩排序矢量设计

1. 选择用于基因修饰目标细胞的表达载体。
   注意：zip-sort方法包括分泌拉链和捕获拉链，两者都由不同的载体表达，并且在细胞内配对并运输到细胞表面，以能够选择性纯化包含两种载体的细胞（图1A-D）¹³。分泌的拉链由载体 1 表达并包含亲和标签。捕获拉链由载体 2 表达，并将分泌的拉链保留在细胞表面。阻断拉链修饰由共价连接的第二拉链组成，该拉链阻断分泌拉链的非特异性细胞外拉链配对。当将捕获拉链添加到具有细长细胞外结构域（通常是大于短铰链结构域的细胞外结构域）的蛋白质时，需要进行封闭拉链修饰，以防止细胞外配对。
2. 从 补充表 1 和补充 文件 1 中选择一组分泌和捕获拉链来测试和构建载体。
3. 使用标准分子生物学技术13将拉链序列克隆到配对表达载体中，¹³-两个载体中的每一个都将编码亲和标签分泌拉链或捕获拉链（图1D）。
   1. 有关拉链构建体序列，请参阅 补充表 1 和 补充文件 1 。拉链序列已放置在多顺反子信息的 5'（N 末端）以增强其表达，从而提高分选产量。将后续转基因置于下游，由自裂解的2A肽分开（图1D）。然而，如果保持高表达，先前的实验已经成功地将拉链置于 3' 配置中。

2. 逆转录病毒的产生

1. 在转染前1天准备Phoenix-Eco细胞（ATCC CRL-3214，小鼠嗜病毒）或Phoenix-Eco ɑ-V β-3细胞¹³ （添加ɑ-V β-3，旨在增强Phoenix-Eco的粘附）或293Vec-RD114¹⁴ （人-嗜病毒）或293Vec-RD114 ɑ-V β-3细胞（添加ɑ-V β-3，旨在增强293Vec-RD114的粘附性）。
   注意：该协议不需要用ɑ-V β-3整合素修饰包装线，但这种修饰提高了该细胞系对组织培养瓶的粘附力，并促进逆转录病毒上清液的收集。
   1. 在含有凤凰或 293Vec-RD114 细胞的 T175 烧瓶中与 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 以 ~80% 汇合度对细胞进行胰蛋白酶消化。
      1. 取出培养基，用 10 mL PBS 洗涤贴壁细胞，保持细胞不受干扰以去除抑制胰蛋白酶的血清成分，加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，并将细胞在 37 °C 下孵育 5 分钟。
      2. 将细胞解离并收集在补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉素/链霉素和 1% GlutaMAX（称为完全 DMEM）的 5 mL DMEM 中。
      3. 通过在4°C下以340 x g 离心5分钟，将细胞沉淀在15mL锥形管中。 倾析介质。
   2. 将离心沉淀细胞重悬于 10 mL 完全 DMEM 中，并接种在 10 cm 组织培养皿上约 1.5 x 10⁶ 个 Phoenix-Eco 细胞、Phoenix-Eco ɑ-V β-3、293Vec-RD114 细胞或 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 细胞用血细胞计数计数。
   3. 轻轻摇晃或旋转板以均匀分布细胞，并在 37°C 下孵育过夜，以使细胞粘附在板上。
2. 大约 18-24 小时后，验证细胞是否汇合 60%-70%，健康的贴壁细胞表现出树突状突起。
3. 使用转染试剂盒（材料表）稳定转染逆转录病毒 LZRS 载体构建体（Addgene 质粒 #31601，基于 EBNA 的游离体稳定转染）或 PB 载体构建体¹³（基于 piggyBac 转座子的基因组稳定整合，补充文件 1）稳定转染 Phoenix-Eco、Phoenix-Eco ɑ-V β-3 细胞、293Vec-RD114 或 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 细胞。
   1. 将 2 μg LZRS 载体 DNA 或 PB 载体 DNA 和 16 μL 增强子试剂混合在微量离心管中的 300 μL EC 缓冲液中，用于每个转染反应。
   2. 为了稳定整合PB载体构建体，还加入1μg过度活跃的piggyBac转座酶载体pCMV-hyPBase¹⁵ （桑格研究所）。
   3. 轻轻涡旋5秒，在室温下孵育5分钟。加入20μL转染试剂，涡旋10秒，室温孵育10分钟，生成DNA胶束复合物。
   4. 将 300 μL 完全 DMEM 加入试管中，移液数次以充分混合，然后使用 1 mL 移液器将胶束悬浮液滴加到铺板的包装线细胞中。
   5. 轻轻旋转以确保胶束均匀沉积。24小时后，胰蛋白酶消化转染的细胞，并通过流式细胞术评估初始逆转录病毒编码的构建体表达。
   6. 将胰蛋白酶消化的细胞转移到装有 20 mL 完全 DMEM 的 T75 烧瓶中，并根据抗生素耐药基因加入 2 μg/mL 嘌呤霉素或 10 μg/mL 杀稻瘟菌素，以选择转染的细胞。一旦细胞达到 70%-75% 汇合度，胰蛋白酶消化并转移到装有 40 mL 完整 DMEM 的 T175 烧瓶中。在包装线扩展期间保持培养基中抗生素的选择。
   7. 当细胞汇合度为80%-85%时，再次胰蛋白酶消化并通过流式细胞术确认构建体表达。使用冷冻培养基（50% 完全 DMEM、40% FBS、10% DMSO）冷冻等分试样的细胞，并将细胞传代到两个 T175 烧瓶（1：10-1：12 分裂比）中，并含有 40 mL 完全 DMEM。
4. 当细胞达到 80%-85% 汇合度时，从完全选择的稳定包装线中收集并浓缩在 T175 烧瓶中生长的逆转录病毒上清液。
   1. 在第一次收获前，在第一次预期收集前 24 小时用 40 mL 新鲜、完整的 DMEM 替换 T175 中的培养基，从培养基中去除抗生素。
   2. 在更换培养基后 24 小时，通过将收集的上清液通过装有注射器过滤器（0.45 μm，聚偏二氟乙烯）的 50 mL 注射器来收集和过滤上清液。收集在 50 mL 锥形管中。
   3. 加入5x聚乙二醇（PEG）浓缩液（40%（wt/vol）PEG 8,000 MW，含2.4%（wt/vol）NaCl）过滤的上清液，并将试管倒置数次以充分混合（PEG沉淀步骤）。
   4. 将 40 mL 完全 DMEM 加入原始收获的 T175 烧瓶中，再孵育 24 小时，每天收集病毒上清液，总共连续 2 天。
   5. 在4°C下沉淀病毒1-2天。 沉淀的病毒将表现为絮状、漂浮或沉淀物质。
   6. 将PEG沉淀的病毒悬浮液在4°C下以2,100 x g 离心15分钟。 丢弃未沉淀的上清液。
   7. 将每个PEG沉淀的病毒沉淀重悬于500μLRPMI中，补充有10%FBS，1%青霉素/链霉素，1%谷氨酸MAX，1%丙酮酸钠，1%非必需氨基酸和0.1%β巯基乙醇（称为完全RPMI）。
   8. 立即使用重悬的病毒进行转导或转移到微量离心管中并储存在-80°C。

3. 第 0 天：小鼠 T 细胞富集和激活

1. 用每孔含有 2 μg/mL 抗 CD3（克隆 145-2C11）和 2 μg/mL 抗 CD28（克隆 37.51）的 1.5 mL PBS 包覆经过组织培养处理的 6 孔板。在37°C下孵育2小时。
2. 从供体小鼠中收获脾脏，通过40μm过滤器解离细胞，并在完整的RPMI中收集脾细胞。通过在4°C下以340 x g 离心5分钟来沉淀脾细胞。
   注意：在本研究中，6-8周龄的雌性BALB / cJ小鼠用作供体小鼠。
3. 弃去上清液，轻轻涡旋沉淀，加入1mL红细胞裂解缓冲液，移液3x-5x混合，在室温下孵育1分钟，用10mL完全RPMI淬灭，并在4°C下以340× g 离心5分钟旋转细胞。
4. 弃去上清液，加入 800 μL 含有 0.5% BSA 和 2 mM EDTA（称为 MACS 缓冲液）的 PBS，并加入 200 μL 小鼠 CD19 微珠。移液混合并在 4 °C 下孵育 15 分钟。
5. 每个小鼠脾脏准备1个LD柱。将 LD 列固定为 MACS 分隔符。在下方放置一个 15 mL 锥形管以收集 CD19 耗尽的脾细胞。用 2 mL MACS 缓冲液润湿色谱柱。
6. 与CD19微珠孵育后，用5mL冷MACS缓冲液洗涤细胞，在4°C下以340× g 离心5分钟沉淀细胞，并弃去上清液。重悬于 1 mL MACS 缓冲液中，并将细胞添加到 LD 柱中。等待悬浮液通过，然后用 1 mL 洗涤，然后用 2 mL MACS 缓冲液洗涤。
7. 收集 CD19 耗尽脾细胞的流经以用于下游。丢弃LD色谱柱，通过在4°C下以340× g 离心5分钟来旋转CD19耗尽的脾细胞。 弃去上清液并重悬于 18 mL 完全 RPMI 中。加入重组人IL-2（rhIL-2）至终浓度为50 IU / mL。
8. 从抗体包被的 6 孔板中弃去抗体溶液。将 3 mL 重悬的 B 细胞耗尽脾细胞添加到抗体包被的 6 孔板的每个孔中。

4. 第 1 天：小鼠 T 细胞的逆转录病毒转导

1. 用每孔含有 2 μg/mL 抗 CD3（克隆 145-2C11）、2 μg/mL 抗 CD28（克隆 37.51）和 20 μg/mL RetroNectin 的 PBS 包覆未经组织培养处理的 6 孔板。
   注意：根据制造商的建议，在RetroNectin包衣过程中使用非组织培养板。
2. 在37°C下孵育2小时。 丢弃包衣溶液或保存以备重复使用（可重复使用一次）。每孔用 1 mL 含有 2% BSA 的 PBS 封闭板，在 37 °C 下孵育 10 分钟，然后丢弃封闭溶液。
3. 同时，在37°C水浴中解冻PEG沉淀的病毒上清液。
   注意：从T175烧瓶产生的每个共转导的PEG浓缩逆转录病毒500μL应足以每孔双转导多达2 x 10⁶ 个活化的T细胞，双转导效率>20%。
4. 根据所需条件将共转导病毒上清液添加到6孔板孔中，使最终体积至少达到2mL，完全RPMI和50 IU / mL rhIL-2，并在2,100x g和32°C下旋转1小时。
5. 每孔加入 0.5-2 x 10⁶ 个活化的 T 细胞，并在 32°C 下以 340 x g 旋转板 10 分钟。 如果细胞不粘附，则在32°C下以340× g 重复旋转10-20分钟。 在37°C下孵育过夜。

5. 第 2 天：载体表达评估和可选的再转导

1. 从转导板中每个条件破坏 100-200 μL 贴壁细胞进行流式细胞术。用户应为每个单独的载体和亲和标签确定流式细胞术可检测的标记物，并使用它们使用流式细胞术评估载体单载体转导效率、双载体转导效率和亲和标签呈递。
2. 如下所述对共转导的细胞进行流式细胞术。
   1. 设置采集参数轴以显示载体 1 和载体 2 的载体报告基因（图 1C）。
   2. 绘制四个载体 1 和载体 2 表达象限中的每一个的亲和标签拉链染色直方图（例如 FLAG 或 CD34），以确保亲和标签染色仅限于共表达载体 1 和载体 2 转导报告基因的细胞。
3. 如果细胞有足够的双转导以确保有足够的细胞用于下游实验（通常为20%或更多的双转导），请执行以下步骤。
   1. 用含有 2 μg/mL 抗 CD3 和抗 CD28 抗体的 PBS 包被用于转导每个 T 细胞系的初始孔数量的两倍，以维持 T 细胞刺激。在37°C下孵育2小时。
   2. 将细胞转移到具有 50 IU/mL rhIL-2 的完整 RPMI 的新孔中（维持 T 细胞刺激）。
4. 如果细胞的双转导不足以确保有足够的细胞用于下游实验（通常< 20% 的双转导），请执行以下步骤。
   1. 使用与第 1 天相同的方案重新转导，但增加到最初用于解释 T 细胞扩增的孔数量的两倍。
   2. 在37°C下孵育过夜。24小时后重复流式细胞术。
      注意：载体编码的构建体，包括亲和标签拉链，在初始转导后2天显示最大表达。

6. 第 3 天：T 细胞免疫磁性选择（Zip-sort）

1. 将使用相同共转导条件产生的细胞孔汇集到 15 mL 锥形管中。
2. 在4°C下以340× g 离心细胞5分钟。 弃去上清液，将细胞在每 1 x 10⁷ 细胞含有 30 μL 微珠（DYKDDDDK （FLAG） 或人 CD34）的 500 μL MACS 缓冲液中孵育，在 4 °C 下孵育 30 分钟。
3. 孵育后，用 5 mL 冷 MACS 缓冲液洗涤细胞。在4°C下以340× g 离心细胞5分钟。 弃去上清液并将沉淀重悬于 1 mL MACS 缓冲液中。
4. 如下所述，使用LS柱积极选择转导的T细胞。
   1. 用 2 mL MACS 缓冲液润湿色谱柱。将细胞悬液涂在磁架中的 LS 色谱柱上。
   2. 用 MACS 缓冲液（1 mL、2 mL、3 mL）依次洗涤。通过从磁支架上取下色谱柱，向色谱柱中加入 5 mL 完整 RPMI，然后插入细胞柱塞，从色谱柱中洗脱保留的细胞。
   3. 在 15 mL 锥形管中或直接在 T25 烧瓶中捕获细胞。用 50 IU/mL rhIL-2 在完全 RPMI 中以 0.5 x 10⁶ 个细胞/mL 平衡细胞。
   4. 如果从 20% <双转导开始，则可选择将细胞洗脱到第二根 LS 色谱柱上进行顺序阳性选择，以提高分选后纯度。
5. 在T25或T75烧瓶中以大约0.5 x 10⁶ 个细胞/ mL的完整RPMI和50 IU / mLrhIL-2培养CAR T细胞。
6. 可选：如果 T 细胞将用于体内实验，请考虑在 1 μM 达沙替尼中培养，以减弱初始培养期间遇到的 CAR T 细胞强直信号诱导的功能障碍^13,16。
7. 按照上述步骤 2.1 和 2.2 对预分选和后分选的 T 细胞进行流式细胞术，以评估 Zip 分选后的产量和纯度（双转导百分比）。
   产量 = 100 x 回收的双转导细胞总数 / 分选前群体中存在的双转导细胞总数）

7. 第 4 天：继续 T 细胞培养

1. 为整个培养体积添加新鲜的完整RPMI和50 IU / mL rhIL-2，以将T细胞浓度保持在0.5-1 x 10⁶ 个细胞/ mL。
2. 可选：如果 T 细胞将用于 体内 实验，请添加新鲜的 1 μM 达沙替尼。

8. 第 5 天：Zip 分选 T 细胞的表征

1. 可选：每种条件制备 100-200 μL T 细胞悬液，用抗体染色，以使用流式细胞术检测 Zip 分选载体编码的 CAR 或其他蛋白质产物。
2. 用CAR T细胞进行 体外 或 体内 实验。
3. 可选：如果 T 细胞将用于 体内 实验，请洗涤细胞以去除达沙替尼。根据机构指南，将细胞重悬于眶后或尾静脉注射所需的浓度。

9. 第 0 天：人 T 细胞的纯化和刺激

1. 在水浴中快速解冻一瓶冷冻保存的人外周血单核细胞 （PBMC）（或使用新鲜分离的 PBMC）。将解冻的PBMC加入含有5mL MACS缓冲液的15mL锥形管中，制备等分试样进行计数，并通过在4°C下以340 x g 离心5分钟来沉淀细胞。
2. 弃去上清液并将细胞重悬于 MACS 缓冲液中（每 1 x 10⁷ 个总细胞使用 40 μL 缓冲液）。根据制造商的说明，使用人用 Pan T 细胞分离试剂盒进行 T 细胞分离。
   1. 简而言之，每 1 x 10⁷ 个细胞总共添加 10 μL Pan T 细胞生物素抗体混合物。在4°C下孵育5分钟。
   2. 每 1 x 10⁷ 个细胞加入 30 μL MACS 缓冲液。每 1 x 10⁷ 个细胞加入 20 μL Pan T 细胞微珠混合物。
   3. 在4°C下孵育10分钟。 使用 MACS 缓冲液将细胞悬液的体积填充到至少 500 μL。
   4. 使用 LS 色谱柱进行磁性细胞分离，并收集流过含有富集（未接触）T 细胞的血流。
3. 通过在4°C下以340 x g 离心5分钟来计数T细胞产量和沉淀细胞。 弃去上清液。将人 T 细胞以 1 x 10^{6 个细胞} /mL 的完全 RPMI 重悬于人 T 细胞中，并以 50 IU/mL 的 rhIL-2 重悬。
4. 在含有 2 mL PBS 的 15 mL 锥形管中，加入所需体积的 Dynabeads 人 T 激活剂 CD3/CD28 用于 T 细胞扩增和激活（每 1 x 10⁶ 个细胞 25 μL 磁珠，使用 1：1 磁珠与 T 细胞的比例），并在 4°C 下以 340 x g 旋转 5 分钟以洗涤磁珠。弃去上清液。
5. 将重悬的 T 细胞与洗涤的珠子混合，然后转移到 T25 烧瓶中进行培养。

10. 第 3 天：人 T 细胞的逆转录病毒转导

1. 用每孔含有 20 μg/mL RetroNectin 的 1.5 mL PBS 包被非组织培养 6 孔板。
2. 在37°C下孵育2小时。 丢弃包衣溶液或保存以备重复使用（可重复使用一次）。
3. 同时，解冻PEG沉淀的病毒上清液，在37°C水浴中进行共转导。
4. 根据所需的转导条件，将共转导病毒上清液添加到RetroNectin包被的6孔板的孔中，计数并添加所需量的T细胞（通常为0.5-2 x 10⁶ T细胞/孔），使体积达到3mL，含有rhIL-2的完整RPMI，并在32°C下以340 x g 旋转45分钟。
5. 24小时后，用50 IU / mL rhIL-2在完全RPMI中将T细胞维持在1 x 10 6^个细胞/ mL。
6. 如果维持所需 T 细胞浓度所需的体积超过 6 孔板的体积容量，则将细胞从 6 孔板转移到 T25 烧瓶中。

11. 第 6 天：快速分选人 CAR T 细胞

1. 在基于亲和标签的免疫磁纯化（Zip-sort）之前，从T细胞中去除Dynabeads，以避免Dynabead相关的在磁柱中可能滞留，并在流式细胞术之前避免对流式细胞术分析的潜在干扰。
2. 短暂涡旋以解离 Dynabeads 并将 T 细胞转移到 15 mL 锥形管中并插入 Dynabead 磁铁中。将管子倒置几次，等待 5 分钟，直到 Dynabeads 与磁铁结合。
3. 通过用移液器抽吸，小心地将不含 Dynabeads 的细胞悬液转移到新的 15 mL 锥形管中。计算回收的细胞浓度并使用体积计算总细胞产量。
4. 根据上述小鼠转导方案，使用流式细胞术评估CAR表达。
5. 通过在 4°C 下以 340 x g 离心 5 分钟来旋转细胞，并在每 1 x 10⁷ 个细胞含有 30 μL 微珠（DYKDDDDK （FLAG） 或人 CD34）的 500 μL MACS 缓冲液中孵育。
6. 按照步骤 6.3-6.5 获得 Zip 分选的人 CAR T 细胞。
7. 使用台盼蓝排除通过血细胞计数器活力检查评估分选后活力。预分拣活力预计> 80%。在 Zip 排序后，这可能会降至 80% 以下，但在 4-5 天内恢复。
8. 用 50 IU/mL rhIL-2 在完全 RPMI 中扩增人 T 细胞，并将 T 细胞浓度维持在大约 1 x 10⁶ 个细胞/mL。分选后T细胞扩增和维持可根据用户的标准扩增和使用方案进行调整。
9. 通常在第 8 天后使用 T 细胞进行下游实验测试，例如杀伤测定、细胞因子生产、 体内 分析。

结果

在该协议中，我们展示了用两种不同的逆转录病毒载体（称为 Zip-sort，图 1）¹³ 双转导的 T 细胞的共转导和单步免疫磁选择。每个载体编码异二聚化亮氨酸拉链对的一部分，该拉链对选择性地显示在双转导的T细胞表面（图1A）。亲和标签分泌的拉链从载体 1 表达，并在细胞内与从载体 2 表达的膜结合捕获拉链配对。这里评估了带有短铰链垫片（图1A-B）和更大的细长垫片（如Thy1.1，EGFR，PD-1和CD200R）（图1B）的拉链分类捕获拉链设计。带有短铰链垫片的捕获拉链不会在细胞外与分泌拉链明显配对。然而，为了捕获带有细长垫片的拉链，我们发现有必要进一步设计阻塞拉链修饰以防止非特异性细胞外拉链配对（图1B-D）

讨论

在这里，我们描述了一种用于生成 Zip 排序载体集、生产逆转录病毒、共转导小鼠和人 T 细胞以及免疫磁纯化双转导细胞 （Zip-sort） 的方案。上述方案针对逆转录病毒载体以及小鼠和人T细胞进行了优化。虽然 Zip-sort 方法没有与其他载体系统进行评估，但原则上，其他载体系统可能是兼容的，包括慢病毒¹⁷、转座子¹⁸ 或位点特异性同源定向修复模板整合¹⁹，前提是实现了足够高的表面表达。需要更大包装尺寸的用户可以考虑根据各自载体系统⁷的报告最大载货能力使用这些替代包装策略。我们发现，当亲和标签拉链以低密度或高密度显示在细胞上时，Zip 排序方法会产生高度纯化的细胞，但高产量分选需要亲和标签的高密度表面表达。应优化 Zip 排序载体，以将 zipper 序列放置在多顺反子转录本中的高表达位置，因为转基因在由 2A 肽分离的一系列转基因中的位置会影响表达效率

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>肿瘤细胞系相关
C1498	ATCC	TIB-49 型
BM185-CD19	参考文献 13
BM185-CD20	参考文献 13
4D-Nucleofector 核心单元	龙沙	AAF-1003B
4D-Nucleofector X 单元	龙沙	AAF-1003X型
Lonza SF 缓冲液试剂盒
病毒生产
10 cm 组织培养 （TC） 处理的细胞培养皿	康宁	353003
50 mL锥形管	Thermo Scientific	339652
效应烯	洽根	301425
pENTR1a 质粒	阿德基因	17398
LZRS-Rfa	阿德基因	31601
PB MMLV puro（小鼠 T 细胞病毒载体）	参考文献 13
PB SFG blastR（人 T 细胞病毒载体）	参考文献 13
pCMV-hyPBase	桑格研究所
凤凰生态	ATCC	CRL-3214型
Phoenix-Eco alpha V beta 3	参考文献 13		Phoenix-Eco 经过改性，可粘附在具有更高亲和力的培养瓶上
PB-EF1a 内含子 WPRE mCD4 P2A MCS 整合素 β 3	参考文献 13		可选，以增强包装线细胞与培养瓶的附着力
PB-EF1a 内含子 WPRE hCD8a 2A 整合素 α V	参考文献 13		可选，以增强包装线细胞与培养瓶的附着力
百维克-RD113	百维克制药
Biovec-RD113 α V β 3	百维克制药	本研究用 alpha V β 3 载体转染
Millex-HV 针头过滤器（0.45 &m)	米利孔	SLHVR33RRS
聚乙二醇 8000 （PEG）	费雪科学	BP233-1型
氯化钠	费雪科学	S271-500型
嘌呤霉素	圣克鲁斯生物技术	SC-108071B
杀稻瘟菌素	圣克鲁斯生物技术	SC-204655
T175 TC处理烧瓶	康宁	353112
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	吉布科	25200056
细胞培养基
2-巯基乙醇	吉布科	21985023
RPMI1640	吉布科	11-875-119
DMEM的	吉布科	11-965-118
FBS的	西格马	F2442型
谷氨酸	吉布科	35050061
MEM 非必需氨基酸	吉布科	11140050
青霉素-链霉素	吉布科	15140-163
丙酮酸钠	吉布科	11360070
<强>T细胞刺激/转导
15 mL锥形管	Thermo Scientific	339650
6 孔非 TC 板	吉布科	351146
6 孔 TC 板	吉布科	353046
抗CD19微珠	米尔特尼生物科技	130-121-301
InVivoMab 抗小鼠 CD28（克隆 37.51）	BioXCell	BE0015-1型
InVivoPlus抗小鼠CD3&εsilon;（克隆 145-2C11）	BioXCell	BE0001-1型
Bovine Serum Albumin	西格玛·奥尔德里奇	A4737-1G
达沙替尼	开曼化学	11498
Dynabeads 人 T 激活剂 CD3/CD28	吉布科	11131D
EDTA （0.5 M），pH 8.0，不含 RNase	Invitrogen	AM9260G
HybriMax 红细胞裂解缓冲液	西格马	R7757-100毫升
LD色谱柱	米尔特尼生物科技	130-042-901
Pan T 细胞分离试剂盒，人用	米尔特尼生物科技	130-096-535
Dynamag-15 磁铁	Invitrogen	12301D
磷酸盐缓冲盐水 （1X）	康宁	21040CV
雷通蛋白	宝	T100B 型
rhIL-2	白细胞介素（aldesleukin）
T25细胞培养瓶	康宁	353109
Zip-sort
&微;MACS DYKDDDDK 隔离套件	米尔特尼生物科技	130-101-591
CD34 MicroBead Kit，人用	米尔特尼生物科技	130-046-702
四边形MACS	米尔特尼生物科技	130-090-976
MACS 多支架	米尔特尼生物科技	130-042-303
LS色谱柱	米尔特尼生物科技	130-042-401
流式细胞术和细胞监测
抗 CD90.1 Thy1.1 APC（克隆 OX-7）	BD生物科学	货号# 561409;RRID：AB_10683163
抗 V5 标签抗体，（克隆 4C12E11）iFluor 488	金斯瑞	货号# A01803， RRID：AB_2925231
Myc PE	细胞信号传导技术	货号# 2233;RRID：AB_823474
Myc Alexa 647	细胞信号传导技术	货号# 2233;RRID：AB_823474
APC 抗 DYKDDDK 标签（克隆 L5）	生物传奇	Cat# 637307;RRID：AB_2561496
小鼠抗 CD34 抗体，Alexa Fluor 647，（克隆 QBEnd/10）	诺武斯生物制品	货号# NBP2-34713AF647;RRID：AB_2925234
链菌 FITC	金斯瑞	货号# A01736;RRID：AB_2622221
Incucyte SX5	缝纫机
Penteon 流式细胞仪	安捷伦