基于亮氨酸拉链的细胞分选，用于纯化双载体转导的细胞

Katerina Su; Bintao Wang; Adhithi Rajagopalan; Sophia Chen; Alexander P. Boardman; Marcel R. M. van den Brink; Scott E. James

doi:10.3791/68628

方法文章

基于亮氨酸拉链的细胞分选，用于纯化双载体转导的细胞

DOI：

10.3791/68628

⸱

2025年10月24日

Katerina Su^*¹ , Bintao Wang^*¹ , Adhithi Rajagopalan¹ , Sophia Chen¹ , Alexander P. Boardman² , Marcel R. M. van den Brink^*¹ , Scott E. James^*¹^,³

¹City of Hope Los Angeles and National Medical Center, ²Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, ³Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

^* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在这里，我们描述了一种从共转导的T细胞混合物中选择性纯化双转导的T细胞的方案。该方法结合了两种逆转录病毒载体，每种载体编码基于亮氨酸拉链的配对细胞分选方法的一个组分，该方法能够对双载体转导的细胞进行选择性免疫磁纯化。

摘要

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过继性 T 细胞疗法，包括嵌合抗原受体（CAR） T 细胞，已显示出对血液系统恶性肿瘤的令人印象深刻的临床活性，并在治疗实体瘤恶性肿瘤方面显示出前景。尽管取得了这些成功，但已经确定了限制治疗成功的多种 T 细胞免疫疗法耐药机制，包括靶抗原的丧失或表达减弱、T 细胞耗竭的发展以及免疫抑制肿瘤微环境的存在。已经开发了多种细胞工程策略来克服这些耐药机制。然而，多种耐药机制可能同时发生，因此需要结合多种工程策略来优化抗肿瘤活性。载体包装限制限制了向 T 细胞传递大量遗传信息，并为共表达多种工程构建体带来了挑战。在这里，我们描述了一种用两个载体共转导T细胞以编码多个转基因的方案，从而增加工程功能的数量。通过共表达基于亮氨酸拉链的细胞分选方法，称为 Zip-sort，我们指导了包含两种不同载体的双转导细胞的选择性免疫磁纯化。

引言

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CAR T 细胞疗法彻底改变了 B 细胞白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗 ^1,2。CAR T 细胞也在研究实体瘤恶性肿瘤³。然而，已经确定了CAR T细胞治疗失败的复发机制，包括CAR靶抗原分子表达不良或丢失，T细胞功能障碍（耗竭）的发展，肿瘤微环境的主动免疫抑制，以及有限的T细胞运输到肿瘤微环境中并持续存在3,4,5,6 .虽然已经设计了单独的工程解决方案来尝试克服这些 CAR T 细胞耐药机制中的每一种³，但由于逆转录病毒和慢病毒载体系统的基因包装能力有限，将多种工程功能引入细胞治疗产品以同时克服多种耐药机制具有挑战性⁷。

为了克服载体包装能力的限制，T细胞与多个载体的共转导已被越来越多地使用。载体共转导已用于临床前研究 ^8,9,10<....

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方案

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动物研究是在希望之城（COH） Parvin 动物研究实验室根据 COH 机构动物护理和使用委员会批准的协议 #23145 进行的，并在纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）动物饲养室根据协议 #99-07-025 进行的经 MSKCC 机构动物护理和使用委员会批准。人 T 细胞是从去识别化的外周血单核细胞（PBMC）中分离出来的，这些细胞是从希望之城献血中心获得的白细胞减少过滤器中 Ficoll-Paque 纯化的，并根据希望之城机构审查委员会批准的协议 #24427 使用。所有程序均按照机构生物安全标准进行。

1. 压缩排序矢量设计

选择用于基因修饰目标细胞的表达载体。
注意：zip-sort方法包括分泌拉链和捕获拉链，两者都由不同的载体表达，并且在细胞内配对并运输到细胞表面，以能够选择性纯化包含两种载体的细胞（图1A-D）¹³。分泌的拉链由载体 1 表达并包含亲和标签。捕获拉链由载体 2 表达，并将分泌的拉链保留在细胞表面。阻断拉链修饰由共价连接的第二拉链组成，该拉链阻断分泌拉链的非特异性细胞外拉链配对。当将捕获拉链添加到具有细长细胞外结构域（通常是大于短铰链结构域的细胞外结构域）的蛋白质时，....

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结果

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在该协议中，我们展示了用两种不同的逆转录病毒载体（称为 Zip-sort，图 1）¹³ 双转导的 T 细胞的共转导和单步免疫磁选择。每个载体编码异二聚化亮氨酸拉链对的一部分，该拉链对选择性地显示在双转导的T细胞表面（图1A）。亲和标签分泌的拉链从载体 1 表达，并在细胞内与从载体 2 表达的膜结合捕获拉链配对。这里评估了带有短铰链垫片（图1A-B）和更大的细长垫片（如Thy1.1，EGFR，PD-1和CD200R）（图1B）的拉链分类捕获拉链设计。带有短铰链垫片的捕获拉链不会在细胞外与分泌拉链明显配对。然而，为了捕获带有细长垫片的拉链，我们发现有必要进一步设计阻塞拉链修饰以防止非特异性细胞外拉链配对（图1B-D）

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讨论

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在这里，我们描述了一种用于生成 Zip 排序载体集、生产逆转录病毒、共转导小鼠和人 T 细胞以及免疫磁纯化双转导细胞（Zip-sort）的方案。上述方案针对逆转录病毒载体以及小鼠和人T细胞进行了优化。虽然 Zip-sort 方法没有与其他载体系统进行评估，但原则上，其他载体系统可能是兼容的，包括慢病毒¹⁷、转座子¹⁸ 或位点特异性同源定向修复模板整合¹⁹，前提是实现了足够高的表面表达。需要更大包装尺寸的用户可以考虑根据各自载体系统⁷的报告最大载货能力使用这些替代包装策略。我们发现，当亲和标签拉链以低密度或高密度显示在细胞上时，Zip 排序方法会产生高度纯化的细胞，但高产量分选需要亲和标签的高密度表面表达。应优化 Zip 排序载体，以将 zipper 序列放置在多顺反子转录本中的高表达位置，因为转基因在由 2A 肽分离的一系列转基因中的位置会影响表达效率

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披露

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A.R.、S.C.、S.E.J. 和 M.V.D.B. 是与 Zip-sort 技术相关的专利申请的共同发明人。A.P.B. 为艾伯维和百时美施贵宝提供咨询。MVDB 已获得 Seres Therapeutics 的研究支持，以及 Seres Therapeutics 和 ThymoFox 的股票期权;他从 Wolters Kluwer 获得了版税;他曾为 Seres Therapeutics、Vor Biopharma、Rheos Medicines、Frazier Healthcare Partners、Nektar Therapeutics、Notch Therapeutics、Ceramedix、Lygenesis、Pluto Therapeutics、GlaskoSmithKline、Da Volterra、ThymoFox、Garuda、Novartis（配偶）、Synthekine（配偶）、百济神州（配偶）、Kite（配偶）、MustangBio（配偶）和 Cellectar（配偶）提供咨询、接受酬金或参与顾问委员会;他拥有 Seres Therapeutics 和 Juno Therapeutics 的知识产权许可;他在 DKMS（非营利组织）基金会董事会担任受托人;他是 Smart Immune 的科学顾问委员会主席。

致谢

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南卡罗来纳州得到了德国研究基金会（研究奖学金;Deutsche Forschungsgemeinschaft， DFG）。S.E.J. 获得 NCI 颁发的职业发展奖（奖项编号 K08-CA252157）的支持。S.E.J. 还得到了美国临床肿瘤学会（青年研究者奖）、国家骨髓捐献者计划（艾米计划奖）和帕克癌症免疫治疗研究所（桥梁学者奖）的支持。van den Brink 实验室的研究得到了美国国家癌症研究所 P01-CA023766、R35-CA284024、R01-CA228308 奖的支持;国家心肺血液研究所奖 R01-HL164902，国家老龄化研究所奖 P01-AG052359。这项研究部分得到了 Deana 和 Steve Campbell 首席医师执行杰出主席捐赠基金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
<强>肿瘤细胞系相关
C1498	ATCC	TIB-49 型
BM185-CD19	参考文献 13
BM185-CD20	参考文献 13
4D-Nucleofector 核心单元	龙沙	AAF-1003B
4D-Nucleofector X 单元	龙沙	AAF-1003X型
Lonza SF 缓冲液试剂盒
病毒生产
10 cm 组织培养（TC）处理的细胞培养皿	康宁	353003
50 mL锥形管	Thermo Scientific	339652
效应烯	洽根	301425
pENTR1a 质粒	阿德基因	17398
LZRS-Rfa	阿德基因	31601
PB MMLV puro（小鼠 T 细胞病毒载体）	参考文献 13
PB SFG blastR（人 T 细胞病毒载体）	参考文献 13
pCMV-hyPBase	桑格研究所
凤凰生态	ATCC	CRL-3214型
Phoenix-Eco alpha V beta 3	参考文献 13		Phoenix-Eco 经过改性，可粘附在具有更高亲和力的培养瓶上
PB-EF1a 内含子 WPRE mCD4 P2A MCS 整合素 β 3	参考文献 13		可选，以增强包装线细胞与培养瓶的附着力
PB-EF1a 内含子 WPRE hCD8a 2A 整合素 α V	参考文献 13		可选，以增强包装线细胞与培养瓶的附着力
百维克-RD113	百维克制药
Biovec-RD113 α V β 3	百维克制药	本研究用 alpha V β 3 载体转染
Millex-HV 针头过滤器（0.45 &m)	米利孔	SLHVR33RRS
聚乙二醇 8000 （PEG）	费雪科学	BP233-1型
氯化钠	费雪科学	S271-500型
嘌呤霉素	圣克鲁斯生物技术	SC-108071B
杀稻瘟菌素	圣克鲁斯生物技术	SC-204655
T175 TC处理烧瓶	康宁	353112
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	吉布科	25200056
细胞培养基
2-巯基乙醇	吉布科	21985023
RPMI1640	吉布科	11-875-119
DMEM的	吉布科	11-965-118
FBS的	西格马	F2442型
谷氨酸	吉布科	35050061
MEM 非必需氨基酸	吉布科	11140050
青霉素-链霉素	吉布科	15140-163
丙酮酸钠	吉布科	11360070
<强>T细胞刺激/转导
15 mL锥形管	Thermo Scientific	339650
6 孔非 TC 板	吉布科	351146
6 孔 TC 板	吉布科	353046
抗CD19微珠	米尔特尼生物科技	130-121-301
InVivoMab 抗小鼠 CD28（克隆 37.51）	BioXCell	BE0015-1型
InVivoPlus抗小鼠CD3&εsilon;（克隆 145-2C11）	BioXCell	BE0001-1型
Bovine Serum Albumin	西格玛·奥尔德里奇	A4737-1G
达沙替尼	开曼化学	11498
Dynabeads 人 T 激活剂 CD3/CD28	吉布科	11131D
EDTA （0.5 M），pH 8.0，不含 RNase	Invitrogen	AM9260G
HybriMax 红细胞裂解缓冲液	西格马	R7757-100毫升
LD色谱柱	米尔特尼生物科技	130-042-901
Pan T 细胞分离试剂盒，人用	米尔特尼生物科技	130-096-535
Dynamag-15 磁铁	Invitrogen	12301D
磷酸盐缓冲盐水（1X）	康宁	21040CV
雷通蛋白	宝	T100B 型
rhIL-2	白细胞介素（aldesleukin）
T25细胞培养瓶	康宁	353109
Zip-sort
&微;MACS DYKDDDDK 隔离套件	米尔特尼生物科技	130-101-591
CD34 MicroBead Kit，人用	米尔特尼生物科技	130-046-702
四边形MACS	米尔特尼生物科技	130-090-976
MACS 多支架	米尔特尼生物科技	130-042-303
LS色谱柱	米尔特尼生物科技	130-042-401
流式细胞术和细胞监测
抗 CD90.1 Thy1.1 APC（克隆 OX-7）	BD生物科学	货号# 561409;RRID：AB_10683163
抗 V5 标签抗体，（克隆 4C12E11）iFluor 488	金斯瑞	货号# A01803， RRID：AB_2925231
Myc PE	细胞信号传导技术	货号# 2233;RRID：AB_823474
Myc Alexa 647	细胞信号传导技术	货号# 2233;RRID：AB_823474
APC 抗 DYKDDDK 标签（克隆 L5）	生物传奇	Cat# 637307;RRID：AB_2561496
小鼠抗 CD34 抗体，Alexa Fluor 647，（克隆 QBEnd/10）	诺武斯生物制品	货号# NBP2-34713AF647;RRID：AB_2925234
链菌 FITC	金斯瑞	货号# A01736;RRID：AB_2622221
Incucyte SX5	缝纫机
Penteon 流式细胞仪	安捷伦

参考文献

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June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
Labanieh, L., Mackall, C. L.

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