光学透明技术，例如吸收性分子溶液，可暂时减少光散射，以增强生物成像效果，并具有生物相容性和可逆性 体内 用于深层器官成像的策略。本方案提供了详细的实验步骤以及先进的图像处理方法，以实现对活体动物实时动态的高质量动态成像。
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本文内容
摘要
摘要
动态成像技术是生物学与医学研究中的基础工具，但其在活体组织中的应用受到光散射的限制，这种散射源于组织内部折射率不匹配所导致的光散射效应，从而降低了光在生物组织中的穿透深度与分辨率。先前的研究提出了一种新颖的方法，通过利用强吸收性分子实现在活体动物中获得光学透明性。当这些吸收性分子（如食品中常用的美国食品药品监督管理局批准染料酒石黄）溶解于水中时，可通过克拉默斯-克勒尼希关系（Kramers-Kronig relations）调节水相介质的折射率。这种调节能够减小组织中不同组分之间因折射率差异而产生的不匹配程度，从而减轻光散射。本文报道了采用基于酒石黄的水溶液进行组织透明化处理的详细实验方法，该技术已应用于 离体 和 体内 样本。该方法可逆地使活体小鼠在可见光光谱范围内变得透明，从而实现对内部结构和过程更清晰、更深层的成像。随后采用先进的图像处理算法，以提高目标器官的对比度和分割效果。此外，高透明度在 离体 样品，例如鸡胸肉， 经酒石黄溶液处理后的结果如图所示。该方法提供了一种通用且易于实施的增强策略 多种成像模式下的成像能力，为深入理解复杂的生物系统奠定了基础。
引言
生物成像长期受到光散射的困扰，这种散射会遮蔽感兴趣的结构1光学透明技术旨在减少光散射并提高视觉清晰度，从而实现对以往难以观察结构的可视化2这些技术的发展催生了多种旨在改进光学成像的方法 离体 生物组织，甚至整个动物，无需对样本进行物理解剖3。然而，类似技术的发展对于 体内 应用一直具有挑战性。诸如CLARITY等技术 C学习 L脂质交换 Acrylamide-杂交 R刚性成像 / 我免疫染色 / 原位杂交兼容 T问题 hY水凝胶（drogel）可实现高分辨率成像，但缺乏可逆性，因此不适用于活体动物研究4Constantini 等人已表明进展较慢 体内 成像与……相比 离体 成像清晰度，这是因为在维持组织活性的同时，难以避免用于组织透明化的试剂达到毒性水平5Genina 强调，光学组织透明化的未来依赖于非侵入性和可逆的方法6近期研究表明....
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方案
所有动物实验均经德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》的规定。所用试剂和设备列于材料表中。图像处理代码可在 GitHub 获取： https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing
1. 柠檬黄溶液的配制
- 对于离体（ex vivo）样品
- 配制染料溶液时，计算所需染料粉末（酒石黄）的质量，以配制所需体积的溶液。使用以下公式：
质量 (g) = 摩尔浓度 (M) × 分子量 (g/mol) × 体积 (L)
注：为校准实际摩尔浓度，使用紫外-可见分光光度计测量所配溶液的吸光度，并应用比尔-朗伯定律19。
警告：使用分析天平精确称量粉末。操作染料粉末时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和护目镜。避免吸入或皮肤接触。 - 将染料粉末转移至洁净的玻璃小瓶中，并使用容量移液管加入所需体积的去离子水（DI水），以确保体积精度。
- 若粉末在室温下未能完全溶解，将玻璃小瓶置于预热至40 °C的实验室烘箱或炉中加热10分钟，或直至粉末完全溶解（
- 配制染料溶液时，计算所需染料粉末（酒石黄）的质量，以配制所需体积的溶液。使用以下公式：
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结果
光学透明性的演示 离体 鸡胸组织
为了研究光在组织中的传播 离体 组织，我们使用了厚度分别为1.5 mm、2.5 mm和3.5 mm的生鸡胸肉去骨切片（图2B）。组织被沿胶原纤维方向平行切割，以确保肌纤维取向一致。在用不同浓度溶液处理前后，均在组织下方放置网状网格图案和“UT Dallas”标志，并拍摄图像。图 2B）。图像采集使用了配备焦距为3.5 mm、光圈为f/1.4镜头的CMOS相机，并采用LED光源对样品进行背向照明。随后，使用紫外-可见-近红外（UV-VIS-NIR）光谱仪测量每种组织对应的透射数据（图2C).
组织的光.......
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讨论
本研究提出了一种全面且可重复的实验方案，利用吸收性分子实现生物组织的光学透明化，所用分子为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的食用色素酒石黄（批准用于食品产品，不适用于医疗用途）。该方法通过改变组织微环境中的折射率，有效降低组织固有的光散射，从而增强光学透明度。本研究通过以下两方面验证了该方法的有效性 离体 和 体内 成像。对于 离体 成像，通过不同厚度的生物样品研究了不同浓度酒石黄对鸡胸组织的影响。结果表明，适当浓度的酒石黄可使鸡胸组织在肉眼观察下呈现透明状态。透射光谱测量进一步显示，尽管入射光在550 nm以下波长几乎被完全吸收，但在可见光谱的较长波长区域及近红外区域，光通过组织的透射率显著提高。这些波长常用于深层组织成像，因此该方法与多种成像模式高度兼容。一个成功实验的关键参数是 离体 透明化过程中染料浓度的选择至关重要，必须在最大化光学透明度的同时避免染料饱和或结晶。当前方案依赖于染料分子向组织内的被动扩散，这限制了其在较大样本中的应用，因为所需的扩散时间与样本厚度的平方成正比。2.
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
ZO 感谢德克萨斯大学达拉斯分校提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 分析天平 | HZK | FA220S | |
| 动物麻醉机 | RWD life science co | TAIJI-IE | 吸入性麻醉剂 |
| 阿替美唑盐酸盐注射液 5 mg/mL | Covertus | 82124 | 注射用麻醉剂 |
| CMOS 相机 | Thor labs | CS165CU/M, Zelux | |
| 右美托咪定盐酸盐注射液 5 mg/10 mL | Covertus | 72960 | 注射用麻醉剂 |
| 光纤光源照明器 | RWD life science co | 76301 | 顶部照明光源 |
| 载玻片 | CravitySci | 0303-2122 | 超优质显微镜载玻片 |
| 恒温毯 | RWD life science co | 69027 | 动物体温控制器 |
| 图像处理 | OpenCV | Python | 软件 |
| 胰岛素注射器 0.5 mL 29 G | Comfort point | 26028 | 注射用麻醉剂 |
| 异氟烷 | Covertus | SKU 029405 | 吸入性麻醉剂 |
| 氯胺酮盐酸盐注射液 100 mg/mL | Dechra | 20042240 | 注射用麻醉剂 |
| LED 光源 | GGE corp | TLB-01 | 顶部照明光源 |
| 镜头 | Thor labs | MVL4WA | 焦距 3.5 mm，光圈 f/1.4 |
| Nair | Church & Dwight | L 1224 | 脱毛膏 |
| PBS pH 7.4 (1x) | Gibco | 2902869 | 注射用麻醉剂 |
| 棉签 | Puritan medical products company | 806-wc hospital | |
| SeaPlaque 琼脂糖 | Lonza | 50101 | 化学试剂 |
| 酒石黄 | MilliporeSigma | CAS 编号: 1934-21-0 | 化学试剂 |
| 移液管 | Fisherbrand | 13-711-9AMMD | |
| 紫外-可见-近红外分光光度计 | Shimadzu | SolidSpec-3700i | 仪器 |
| 样品瓶 | Qorpak | 242633 | |
| 刻度移液管 | Eppendorf research plus | 3123000063 | 100-1000µL |
| 水纯化系统 | Avidity science | SOLO S | 仪器 |
参考文献
- Yun, S. H., Kwok, S. J. J. Light in diagnosis, therapy and surgery. Nat Biomed Eng. 1 (1), 0008(2017).
- Tuchin, V. V. Optical clearing of tissues and blood. , SPIE Publications. (2005).
- Ertürk, A.
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重印与许可
