需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用吸收性分子实现短暂光学透明化 离体 和 体内 成像

6.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68629

⸱

2025年7月11日

 ,  ,  , 
1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

本文内容

摘要

光学透明技术，例如吸收性分子溶液，可暂时减少光散射，以增强生物成像效果，并具有生物相容性和可逆性 体内 用于深层器官成像的策略。本方案提供了详细的实验步骤以及先进的图像处理方法，以实现对活体动物实时动态的高质量动态成像。

摘要

动态成像技术是生物学与医学研究中的基础工具，但其在活体组织中的应用受到光散射的限制，这种散射源于组织内部折射率不匹配所导致的光散射效应，从而降低了光在生物组织中的穿透深度与分辨率。先前的研究提出了一种新颖的方法，通过利用强吸收性分子实现在活体动物中获得光学透明性。当这些吸收性分子（如食品中常用的美国食品药品监督管理局批准染料酒石黄）溶解于水中时，可通过克拉默斯-克勒尼希关系（Kramers-Kronig relations）调节水相介质的折射率。这种调节能够减小组织中不同组分之间因折射率差异而产生的不匹配程度，从而减轻光散射。本文报道了采用基于酒石黄的水溶液进行组织透明化处理的详细实验方法，该技术已应用于 离体 和 体内 样本。该方法可逆地使活体小鼠在可见光光谱范围内变得透明，从而实现对内部结构和过程更清晰、更深层的成像。随后采用先进的图像处理算法，以提高目标器官的对比度和分割效果。此外，高透明度在 离体 样品，例如鸡胸肉， 经酒石黄溶液处理后的结果如图所示。该方法提供了一种通用且易于实施的增强策略 多种成像模式下的成像能力，为深入理解复杂的生物系统奠定了基础。

引言

生物成像长期受到光散射的困扰，这种散射会遮蔽感兴趣的结构1光学透明技术旨在减少光散射并提高视觉清晰度，从而实现对以往难以观察结构的可视化2这些技术的发展催生了多种旨在改进光学成像的方法 离体 生物组织，甚至整个动物，无需对样本进行物理解剖3。然而，类似技术的发展对于 体内 应用一直具有挑战性。诸如CLARITY等技术 C学习 L脂质交换 Acrylamide-杂交 R刚性成像 / 我免疫染色 / 原位杂交兼容 T问题 hY水凝胶（drogel）可实现高分辨率成像，但缺乏可逆性，因此不适用于活体动物研究4Constantini 等人已表明进展较慢 体内 成像与……相比 离体 成像清晰度，这是因为在维持组织活性的同时，难以避免用于组织透明化的试剂达到毒性水平5Genina 强调，光学组织透明化的未来依赖于非侵入性和可逆的方法6近期研究表明，水溶性吸收性染料在活体光学透明化中具有显著效果。例如，Miller 等人证明，在活体小鼠皮肤的光学相干断层扫描（OCT）和光声显微成像（PAM）中，局部应用柠檬黄可显著提高成像深度，其机制在于降低组织散射并提高间质组织成分的折射率7Jia 等人使用15% w/w的酒石黄溶液以增强 体内 小鼠耳部和腹部组织的PAM成像，揭示了亚细胞分辨率下的精细微血管结构，而这些结构在其他成像方式中往往被掩盖8Zuo 等人进一步证明了使用 0.6 M 塔塔红可通过活体小鼠完整的头皮和颅骨实现脑部成像，与未经处理的组织相比，信号强度提高了四倍，分辨率提高了 3.5 倍9在另一项应用中，Narawane 等人通过使用酒石黄实现了猪眼的深层经巩膜光学相干断层扫描成像，清晰地可视化了脉络膜上腔，该区域此前因巩膜强烈散射而无法观察。10。尽管 离体 诸如CLARITY和iDISCO（免疫标记辅助的溶剂清除器官三维成像）等组织透明化方法通过去除脂质或基于溶剂的透明处理，可实现高光学透明度和亚细胞分辨率，但通常不适用于 体内 活体动物成像4,11,12这一局限性影响了动态成像，而动态成像对于活体动物内部动态过程（如疾病发展和治疗反应）的生物医学成像至关重要。

具有高水溶性和独特吸收光谱形状的吸收性分子（如食品级染料酒石黄）在实现活体动物光学透明方面展现出良好的应用前景13通过特异性引入酒石黄，由于该染料独特的光谱特性，组织选择性吸收紫外光和蓝光波长，从而形成经修饰的折射率分布，减少长波长处的光散射。这种反直觉的光学组织透明化技术专为 体内 成像，而克拉默斯-克勒尼希关系为使用酒石黄等强吸收性分子时观察到的透明现象提供了科学依据14,15。对于 体内 成像过程中，将酒石黄与加热的琼脂糖颗粒和水混合，形成一种更易粘附于皮肤的均一溶液。酒石黄的水溶性也有助于从活体动物上轻松去除染料溶液，从而减少染料溶液长期暴露可能带来的影响。此外，该方法已被改进并应用于多种生物医学领域，以提高成像深度、分辨率和灵敏度，包括光学相干断层成像7,16 和光声成像7,9，展示了其在更广泛的生物医学成像领域的应用潜力。

随着吸收性分子在生物医学成像中应用的兴趣日益增长17,18，该方案详细介绍了利用食用染料的步骤 离体 和 体内 应用，以及图像处理和可逆的 体内 成像。本方案以鸡胸组织为例进行演示 离体 透明度，然后进行修饰以 体内 小鼠头部与腹部成像，显示可逆性。应用于小鼠皮肤的溶液 体内 在不损害皮肤或组织完整性的前提下实现临时、可逆的透明化。该技术可与图像处理流程相结合，包括去噪等步骤，从而建立优化的成像方案 体内 内脏器官的光学成像。结合使用这些技术可实现更优的非侵入性、纵向成像，用于生物过程的实时观察。采用具有可逆性且更安全的成像剂，克服了以往的局限性，为动态生物成像提供了更为适宜的方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均经德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》的规定。所用试剂和设备列于材料表中。图像处理代码可在 GitHub 获取： https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. 柠檬黄溶液的配制

  1. 对于离体（ex vivo）样品
    1. 配制染料溶液时，计算所需染料粉末（酒石黄）的质量，以配制所需体积的溶液。使用以下公式：
      质量 (g) = 摩尔浓度 (M) × 分子量 (g/mol) × 体积 (L)
      注：为校准实际摩尔浓度，使用紫外-可见分光光度计测量所配溶液的吸光度，并应用比尔-朗伯定律19。
      ​警告：使用分析天平精确称量粉末。操作染料粉末时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、手套和护目镜。避免吸入或皮肤接触。
    2. 将染料粉末转移至洁净的玻璃小瓶中，并使用容量移液管加入所需体积的去离子水（DI水），以确保体积精度。
    3. 若粉末在室温下未能完全溶解，将玻璃小瓶置于预热至40 °C的实验室烘箱或炉中加热10分钟，或直至粉末完全溶解（图1A）。
      注：低摩尔浓度溶液在室温下可完全溶解并保持液态，而高浓度（>0.37 M）溶液则需加热。
      警告：过度加热会导致水分蒸发，从而改变溶液的实际浓度。
    4. 在涡旋混合器上搅拌30秒至1分钟，以确保完全溶解。
    5. 配制0.65 M溶液时，将427.5 mg酒石黄粉末溶于1 mL去离子水中19。对于其他浓度，请参考表1。
      注：未使用的染料溶液及受污染材料应按照标准化学废弃物处理程序进行处置。
  2. 对于活体（in vivo）样品
    1. 计算所需低熔点琼脂糖微粒和酒石黄的质量，以配制含0.4%（4 mg/mL）琼脂糖水凝胶的0.65 M溶液。
      注：处理所有试剂时，请遵循步骤1.1.1中所述的标准安全预防措施。
    2. 将称量好的粉末转移至洁净的玻璃小瓶中，并使用容量移液管加入去离子水。
    3. 将小瓶置于预热至75 °C的实验室烘箱或炉中，加热约10–15分钟，或直至琼脂糖颗粒完全溶解。
    4. 加热过程中定期使用涡旋混合器混合，以确保溶解均匀。
    5. 使用前让溶液冷却至室温。若其凝固成凝胶状，使用涡旋混合器搅拌30秒以重新液化。
    6. 配制0.65 M水凝胶溶液时，将427.5 mg酒石黄粉末和4 mg琼脂糖溶于1 mL去离子水中。配制其他浓度溶液时，保持琼脂糖浓度为0.4%（4 mg/mL），并参考表1确定相应的酒石黄质量17。

2. 组织透明化处理 离体 组织

  1. 样品制备
    1. 准备 离体 组织，将鸡胸肉组织平行于胶原纤维方向切成所需厚度。
    2. 用清水轻轻清洗切好的组织。
    3. 将组织置于两片干净的显微镜载玻片之间测量厚度。轻轻压紧载玻片，使用游标卡尺测量组织中心位置处两片载玻片之间的距离。
    4. 将组织浸泡在染色液中。
      注意：确保溶液的体积大于样品体积，并使组织完全浸没在溶液中。
    5. 将容器置于摇床中，以每分钟100转的速度振荡10分钟。
    6. 组织在低浓度（≤0.4 M）条件下于室温下静置60分钟，在高浓度条件下于40 °C静置60分钟 >0.4 M
  2. 成像
    1. 使用干净的镊子将组织从染色液中取出。
    2. 将样品置于两片透明玻璃载玻片之间，使用具备适当分辨率和放大倍数设置的数字相机或科学相机拍摄图像。
    3. 在受控光照环境中进行成像，以尽量减少外界光线干扰。
    4. 对不同厚度的组织样本和不同染料溶液浓度的样本重复成像过程（图2B).
      注意：使用LED光源进行背光照明。然而，该方法同样适用于顶部照明光源，工作原理完全相同。
  3. 光学透射测量
    1. 使用紫外-可见-近红外分光光度计，将鸡组织夹在两片透明玻璃载片之间，测量其光学透过率图2C).
    2. 确保系统已正确基线校准，并且在使用染料溶液处理组织前后，光束均穿过组织的相同区域，以保持一致性。
      注意：使用中等扫描速度和1.0 nm的数据间隔，在400 nm至2000 nm波长范围内记录透射光谱。每个样品的完整光谱扫描约需5分钟。

3. 活体动物中的光学透明性

  1. 动物准备
    1. 实验前，测量动物体重并记录其一般活动水平，以建立生理基线。
    2. 使用温度设定为 37 °C 的加热垫，在实验过程中维持动物体温。
      注意：持续监测动物，防止过热。
    3. 根据机构批准的适用于腹部和脑部成像的麻醉方案实施麻醉。
    4. 对于吸入麻醉，成像实验前约 5 分钟以 1.5%–3% 异氟烷、流速 0.8 L/min 诱导麻醉，并在实验全程维持 1%–2% 的浓度。
      注意：持续监测动物的呼吸频率和深度。在通风良好的区域操作，以尽量减少操作人员接触麻醉气体。
    5. 对于注射麻醉，配制含有盐酸氯胺酮（16 mg/mL）和盐酸右美托咪定（0.2 mg/mL）的混合麻醉剂。根据动物体重及机构批准的方案给药。
    6. 使用小型动物电推剪，将拟成像区域的毛发剪除。
    7. 在已剪毛的皮肤区域涂抹脱毛膏，停留时间不超过 60 秒，以去除残留毛发。随后立即清除脱毛膏，并用酒精棉片清洁皮肤，避免皮肤刺激。
    8. 若使用含 α-2 肾上腺素能受体激动剂（如右美托咪定或赛拉嗪）的注射麻醉剂，实验结束后应给予阿替美唑作为逆转剂。在动物恢复期间密切监测，确保其恢复正常呼吸和活动能力后，再放回饲养笼中。
  2. 组织透明化操作步骤
    1. 通过在动物下方放置设定为 37 °C 的加热垫来准备成像装置，以防低体温。调整光源和相机位置，以获取清晰图像。
    2. 使用 0.65 M 酒石黄水凝胶溶液与 0.3%–0.4% 琼脂糖凝胶混合后进行应用（步骤 1.2）。
    3. 用滴管将溶液滴加至皮肤（腹部或头部，根据实验性质而定），静置数秒以启动吸收过程（图 3A）。
    4. 使用棉签轻轻擦拭该区域，使染料溶液均匀分布，并促进经皮吸收。
    5. 用洁净棉签轻柔按摩该区域，并继续添加溶液，直至皮肤开始呈现透明状态且内部器官可见。在吸收过程中，皮肤首先出现橙红色小点，随后逐渐融合为均匀色泽。此颜色变化是染料充分渗透及光学透明化启动的关键视觉指标。
      注意：确保溶液在应用区域不发生结晶——结晶可能阻塞皮肤通道，阻碍染料分子在皮肤中的吸收，而充分吸收对实现透明化至关重要。染料分子充分吸收后，皮肤将变为橙红色。
    6. 持续轻柔按摩，直至皮肤开始透明、内部器官清晰可见。该过程通常需对小面积区域按摩约 3–5 分钟，但具体时间可能因动物体型和皮肤厚度而异。
    7. 使用已对准的相机拍摄图像。调节焦距、曝光和白平衡，以优化图像质量。
    8. 将载玻片或盖玻片轻轻置于皮肤上，以减少反光和眩光，提高图像质量。
      注意：操作所有化学溶液时应穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜），并按照机构的化学废弃物处理规程处置使用过的材料。

4. 通过图像处理增强器官可见性

  1. 图像处理步骤
    1. 使用 OpenCV 的 Python 用于图像处理。导入 OpenCV numpy, matplotlib，以及 PyWavelets.
    2. 上样并 标准化 原始图像。加载原始的高比特深度 .tif 图像。如果任何像素值超过 255，则将所有像素归一化至 [0, 255] 范围内。
    3. 裁剪感兴趣区域（ROI）。调用 OpenCV 的 感兴趣区域 使用选择器在器官区域周围绘制边界框。后续所有步骤仅使用裁剪后的版本进行。
      注意：确保边界框紧密包围目标区域，且不裁剪任何相关结构。
    4. 拆分至 实验室频道将裁剪后的彩色图像转换为LAB色彩空间，并分割为L（亮度）、A和B三个通道。
      注意：图像以彩色模式进行处理，因此使用了Lab色彩空间，图像处理技术仅应用于L通道，该通道包含像素强度信息。
    5. 分析 像素强度分布. 绘制L通道的直方图以评估对比度和强度分布。
      注意：使用直方图验证是否需要进行对比度增强，并指导对比度增强参数的选择。您希望直方图的分布覆盖 [0, 255] 范围。
    6. 应用 CLAHE （对比度受限的自适应直方图均衡化）用于局部对比度增强。创建一个 CLAHE 对象，其 clipLimit = 5.0，tileGridSize = (16,16)。执行 CLAHE 在L通道上进行处理，并将CLAHE增强的L通道与原始的A和B通道合并。转换 CLAHE 从 实验室 到 RGB 如有需要，可用于可视化。
      注意：如果直方图显示过度放大噪声（尖峰），请调整“clipLimit”或“tileGridSize”参数并重新应用，以获得均衡的局部对比度。
    7. 对增强对比度的图像进行去噪。对归一化后的图像执行两级离散小波分解 CLAHE L 通道（缩放至[0, 1]范围）设置0.1的软阈值。重建去噪后的L通道，将其重新缩放至[0, 255]，然后将去噪后的L通道与原始的A和B通道合并。显示原始裁剪彩色图像与小波去噪结果的对比。
      注意：小波去噪可减少均匀区域中可能被误判为前景的微小波动。
    8. 分割感兴趣的器官 通过 大津自适应阈值法计算去噪后L通道的Otsu阈值。从该阈值中减去15的偏置，以包含低强度的器官区域。
      1. 使用偏置值应用二值化阈值，以获得器官像素的掩膜。将该掩膜与原始的A通道和B通道合并，并转换为RGB格式以供观察。
        注意：偏置调整会强制包含血管下方的器官区域。若用于不同的数据集，可根据需要重新调整偏置。
    9. 按需进行分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

光学透明性的演示 离体 鸡胸组织
为了研究光在组织中的传播 离体 组织，我们使用了厚度分别为1.5 mm、2.5 mm和3.5 mm的生鸡胸肉去骨切片（图2B）。组织被沿胶原纤维方向平行切割，以确保肌纤维取向一致。在用不同浓度溶液处理前后，均在组织下方放置网状网格图案和“UT Dallas”标志，并拍摄图像。图 2B）。图像采集使用了配备焦距为3.5 mm、光圈为f/1.4镜头的CMOS相机，并采用LED光源对样品进行背向照明。随后，使用紫外-可见-近红外（UV-VIS-NIR）光谱仪测量每种组织对应的透射数据（图2C).

组织的光...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本研究提出了一种全面且可重复的实验方案，利用吸收性分子实现生物组织的光学透明化，所用分子为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的食用色素酒石黄（批准用于食品产品，不适用于医疗用途）。该方法通过改变组织微环境中的折射率，有效降低组织固有的光散射，从而增强光学透明度。本研究通过以下两方面验证了该方法的有效性 离体 和 体内 成像。对于 离体 成像，通过不同厚度的生物样品研究了不同浓度酒石黄对鸡胸组织的影响。结果表明，适当浓度的酒石黄可使鸡胸组织在肉眼观察下呈现透明状态。透射光谱测量进一步显示，尽管入射光在550 nm以下波长几乎被完全吸收，但在可见光谱的较长波长区域及近红外区域，光通过组织的透射率显著提高。这些波长常用于深层组织成像，因此该方法与多种成像模式高度兼容。一个成功实验的关键参数是 离体 透明化过程中染料浓度的选择至关重要，必须在最大化光学透明度的同时避免染料饱和或结晶。当前方案依赖于染料分子向组织内的被动扩散，这限制了其在较大样本中的应用，因为所需的扩散时间与样本厚度的平方成正比。2.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

ZO 感谢德克萨斯大学达拉斯分校提供的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
分析天平HZKFA220S
动物麻醉机RWD life science coTAIJI-IE吸入性麻醉剂
阿替美唑盐酸盐注射液 5 mg/mLCovertus82124注射用麻醉剂
CMOS 相机Thor labsCS165CU/M, Zelux
右美托咪定盐酸盐注射液 5 mg/10 mLCovertus72960注射用麻醉剂
光纤光源照明器RWD life science co76301顶部照明光源
载玻片CravitySci0303-2122超优质显微镜载玻片
恒温毯RWD life science co69027动物体温控制器
图像处理OpenCVPython软件
胰岛素注射器 0.5 mL 29 GComfort point26028注射用麻醉剂
异氟烷CovertusSKU 029405吸入性麻醉剂
氯胺酮盐酸盐注射液 100 mg/mLDechra20042240注射用麻醉剂
LED 光源GGE corpTLB-01顶部照明光源
镜头Thor labsMVL4WA焦距 3.5 mm，光圈 f/1.4
NairChurch & DwightL 1224脱毛膏
PBS pH 7.4 (1x)Gibco2902869注射用麻醉剂
棉签Puritan medical products company806-wc hospital
SeaPlaque 琼脂糖Lonza50101化学试剂
酒石黄MilliporeSigmaCAS 编号: 1934-21-0化学试剂
移液管Fisherbrand13-711-9AMMD
紫外-可见-近红外分光光度计ShimadzuSolidSpec-3700i仪器
样品瓶Qorpak242633
刻度移液管Eppendorf research plus3123000063100-1000µL
水纯化系统Avidity scienceSOLO S仪器

参考文献

  1. Yun, S. H., Kwok, S. J. J. Light in diagnosis, therapy and surgery. Nat Biomed Eng. 1 (1), 0008(2017).
  2. Tuchin, V. V. Optical clearing of tissues and blood. , SPIE Publications. (2005).
  3. Ertürk, A. Deep 3D histology powered by tissue clearing, omics and AI. Nat Methods. 21 (7), 1153-1165 (2024).
  4. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  5. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In vivo and ex vivo optical clearing methods for biological tissues: Review. Biomed Opt Express. 10 (10), 5251-5267 (2019).
  6. Genina, E. A. Tissue optical clearing: State of the art and prospects. Diagnostics. 12 (7), 1534(2022).
  7. Miller, D. A., et al. Enhanced penetration depth in optical coherence tomography and photoacoustic microscopy in vivo enabled by absorbing dye molecules. Optica. 12 (1), 24-30 (2025).
  8. Jia, C., et al. Tartrazine-enabled optical clearing for in vivo optical resolution photoacoustic microscopy. Biomed Opt Express. 16 (6), 2504-2515 (2025).
  9. Zuo, T., Tao, C., Liu, X. Absorbing molecules as optical clearing agents improve the resolution and sensitivity of photoacoustic microscopy. Opt Lett. 50 (7), 2282-2285 (2025).
  10. Narawane, A., et al. Optical clearing with Tartrazine enables deep transscleral imaging with optical coherence tomography. J Biomed Photonics Eng. 29 (12), 120501(2024).
  11. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  12. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard IgG antibodies. Nat Biotechnol. 42, 617-627 (2024).
  13. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
  14. Sai, T., Saba, M., Dufresne, E. R., Steiner, U., Wilts, B. D. Designing refractive index fluids using the Kramers-Kronig relations. Faraday Discuss. 223, 136-144 (2020).
  15. Yu, T., Zhu, D. Strongly absorbing molecules make tissue transparent: A new insight for understanding tissue optical clearing. Light Sci Appl. 14 (1), 10(2025).
  16. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography: Technology and applications. Drexler, W., Fujimoto, J. G. , Springer International Publishing. Cham. 277-318 (2015).
  17. Wang, F., Zhou, C. Transparent mice': Deep-tissue live imaging using food dyes. Commun Biol. 7 (1), 1307(2024).
  18. Yu, H., Liu, J. -B., Ma, Y. -S., Fu, D. Transparent live mice offer more possibilities for biomedical research. Innov Med. 2 (4), 100098(2024).
  19. Shabbir, M. W., Biswas, S., Kajla, R., Nadella, S., Ou, Z. Designing refractive index fluids of food dye for light propagation through scattering media. MRS Commun. , (2025).
  20. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  21. Schmidt, E. L., et al. Near-infrared II fluorescence imaging. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 23(2024).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

利用吸收性分子实现短暂光学透明化 离体 和 体内 成像
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。