本实验方案描述了利用免疫透射电子显微镜研究神经元微形态变化及线粒体细胞色素c转位的方法。
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本实验方案描述了利用免疫透射电子显微镜研究神经元微形态变化及线粒体细胞色素c转位的方法。
蛋白质在微结构中的定位变化常常表现为病理状态下细胞器水平的精确调控机制。准确捕捉这种细胞器蛋白质转位的位置信息，对于疾病的诊断与治疗具有积极的意义和价值。线粒体在坏死以及细胞凋亡的内源性通路中发挥核心作用。在正常情况下，细胞色素c（Cyt c）仅存在于线粒体内外膜之间以及细胞核内。当细胞发生凋亡时，线粒体内膜通透性发生改变，Cyt c从线粒体释放至细胞质中。本研究建立了大鼠脑缺血-再灌注损伤模型，利用免疫透射电镜技术展示了发生凋亡的神经元的微形态学变化，并更精确地呈现了脑缺血-再灌注损伤后免疫胶体金标记的Cyt c从线粒体基质向细胞质转位的可视化图像。本方案所介绍的免疫透射电镜技术适用于在微观水平上展示任何蛋白质定位的动态变化。
根据2021年全球疾病负担研究，卒中是第三大rd 主要死亡原因和第4位th 伤残调整生命年的首要原因。脑卒中新增病例达1190万例，其中缺血性脑卒中占65.3%（780万例）。1神经元死亡发生在脑缺血之后，包括坏死和凋亡。受损最严重的脑组织随后发生坏死性细胞死亡。缺血半暗带或梗死周围区域的神经元可能在数小时或数天后发生凋亡。2除了生物能量和代谢功能外，线粒体还在细胞凋亡的内在途径中发挥核心作用3,4,5,6.
细胞色素C（Cyt C）是一种由核基因编码的蛋白质。在正常情况下，细胞色素C仅存在于线粒体内外膜之间以及细胞核内。其释放所介导的凋亡通路与Bcl-2家族成员的调控密切相关。当细胞受到凋亡刺激后，Bax/Bak寡聚体形成并插入线粒体外膜孔道，导致线粒体渗透压改变及跨膜电位丧失。细胞色素C从线粒体释放至细胞质中，与凋亡激活因子1结合形成凋亡复合体，并激活前体caspase-9。随后，caspase-3和caspase-7被激活，从而启动caspase级联反应，诱导细胞凋亡
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动物实验已获得SLAS伦理委员会批准（IACUC批件号：SYST-2024-018）。实验中使用6只无特定病原体的雄性SD大鼠（体重200–220 g），饲养于独立通风笼具中，实验室环境维持在22–25 °C，相对湿度45%–65%。所有大鼠在实验前适应性喂养1周，期间可自由饮水和进食。
1. 建立大脑中动脉闭塞（MCAO）模型
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根据Longa评分标准，神经功能评分评估证实了大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的成功建立，MCAO组大鼠至少出现向左侧转圈的行为（神经功能评分为2分），而假手术组大鼠未表现出明显的神经功能缺损（神经功能评分为0分）。手术当天未观察到动物死亡。动物的神经功能评分列于表1中。
MCAO组的透射电镜分析显示，神经元细胞核皱缩，胞质电子密度升高，并伴有部分线粒体结构破坏。关键的是，免疫胶体金标记的细胞色素c（Cyt c）表现出显著的重新分布：与假手术组主要定位于线粒体相比，MCAO样本中线粒体内的金颗粒明显减少，而胞质和细胞核中则出现大量标记信号。Cyt c从线粒体向胞质和细胞核的空间转移，直接可视化了线粒体外膜通透化的发生，并证实了脑缺血-再灌注损伤后内在性凋亡通路的激活。这些超微结构改变与Cyt c转位之间的关联，为细胞亚水平上凋亡启动提供了确凿证据。
透射电镜显示，假手术组大鼠海马神经元的超微结构正常，线粒体和内质网未见病变。MCAO组部分神经元出现核固缩和变性，呈现坏死前改变的特征，伴有线粒体肿.......
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急性缺血性卒中再灌注治疗的主要目标是恢复缺血区域的血液灌注。目前，我们可以通过静脉溶栓、血管内治疗和抗血栓治疗来实现这一目标。然而，血液灌注的恢复会导致缺血-再灌注损伤，加重神经元坏死和凋亡，从而引起神经功能障碍。在缺血-再灌注过程中，线粒体电子传递链中电子异常泄漏，导致大量线粒体活性氧的产生，进而损伤线粒体膜，释放细胞色素c（Cyt c）和线粒体DNA13。研究表明，Bax通道抑制剂和胰岛素可激活细胞存活信号通路，阻止细胞色素c的凋亡性释放，发挥神经保护和抗凋亡作用14,15。
免疫组织化学技术使我们能够可视化并定位细胞区室和组织中的特定生化成分。结合透射电子显微镜（TEM），我们可以精确捕捉蛋白质在超微结构中的位置变化。免疫胶体金技术已在细胞生物学、免疫学、组织学和病理学的细胞超微结构水平研究中取得显著进展，并成功应用于多个领域16,
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作得到了四川省中医药管理局中医药专项科研项目（2021MS414）的支持。
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