方法文章

利用免疫透射电子显微镜揭示线粒体细胞色素C的转位过程

DOI：

10.3791/68633

⸱

2025年8月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案描述了利用免疫透射电子显微镜研究神经元微形态变化及线粒体细胞色素c转位的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质在微结构中的定位变化常常表现为病理状态下细胞器水平的精确调控机制。准确捕捉这种细胞器蛋白质转位的位置信息，对于疾病的诊断与治疗具有积极的意义和价值。线粒体在坏死以及细胞凋亡的内源性通路中发挥核心作用。在正常情况下，细胞色素c（Cyt c）仅存在于线粒体内外膜之间以及细胞核内。当细胞发生凋亡时，线粒体内膜通透性发生改变，Cyt c从线粒体释放至细胞质中。本研究建立了大鼠脑缺血-再灌注损伤模型，利用免疫透射电镜技术展示了发生凋亡的神经元的微形态学变化，并更精确地呈现了脑缺血-再灌注损伤后免疫胶体金标记的Cyt c从线粒体基质向细胞质转位的可视化图像。本方案所介绍的免疫透射电镜技术适用于在微观水平上展示任何蛋白质定位的动态变化。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

根据2021年全球疾病负担研究，卒中是第三大rd 主要死亡原因和第4位th 伤残调整生命年的首要原因。脑卒中新增病例达1190万例，其中缺血性脑卒中占65.3%（780万例）。1神经元死亡发生在脑缺血之后，包括坏死和凋亡。受损最严重的脑组织随后发生坏死性细胞死亡。缺血半暗带或梗死周围区域的神经元可能在数小时或数天后发生凋亡。2除了生物能量和代谢功能外，线粒体还在细胞凋亡的内在途径中发挥核心作用3,4,5,6.

细胞色素C（Cyt C）是一种由核基因编码的蛋白质。在正常情况下，细胞色素C仅存在于线粒体内外膜之间以及细胞核内。其释放所介导的凋亡通路与Bcl-2家族成员的调控密切相关。当细胞受到凋亡刺激后，Bax/Bak寡聚体形成并插入线粒体外膜孔道，导致线粒体渗透压改变及跨膜电位丧失。细胞色素C从线粒体释放至细胞质中，与凋亡激活因子1结合形成凋亡复合体，并激活前体caspase-9。随后，caspase-3和caspase-7被激活，从而启动caspase级联反应，诱导细胞凋亡7。

透射电子显微镜（TEM）可清晰观察细胞在凋亡不同阶段的结构变化。电子显微镜形态学观察是判定细胞凋亡的可靠方法8。然而，该方法无法观察线粒体细胞色素C（Cyt C）在超微结构中的变化。目前有多种技术可用于检测超微结构中的特定蛋白质，包括流式细胞术、酶联免疫吸附测定（ELISA）、分光光度法和蛋白质印迹（Western blotting）。但这些方法均无法准确捕捉蛋白质在微观结构中的定位变化。胶体金具有不同粒径，且电子密度高，免疫胶体金技术特别适用于免疫电子显微镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身具有从浅色到深红色的显色特性，也可用于光学显微镜下的观察。当特定蛋白质被免疫胶体金标记后，可通过透射电子显微镜在亚细胞分辨率下直观显示其定位变化9。

本方案描述了通过免疫透射电子显微镜（IEM）技术标记线粒体细胞色素C（Cyt C）的转位过程。该方法的总体目标是利用IEM在缺血诱导的细胞凋亡过程中可视化Cyt C的亚细胞转位。IEM的原理是用胶体金标记Cyt C，并通过透射电子显微镜（TEM）在亚细胞分辨率下观察其定位变化9。IEM能够在空间水平上观察蛋白质的动态变化，为阐释生理和病理活动提供了强有力的手段10。

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方案

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动物实验已获得SLAS伦理委员会批准（IACUC批件号：SYST-2024-018）。实验中使用6只无特定病原体的雄性SD大鼠（体重200–220 g），饲养于独立通风笼具中，实验室环境维持在22–25 °C，相对湿度45%–65%。所有大鼠在实验前适应性喂养1周，期间可自由饮水和进食。

1. 建立大脑中动脉闭塞（MCAO）模型

  1. 将大鼠随机分为MCAO组和假手术组，每组三只大鼠。实验流程图见图1。
  2. 根据图2中的清单核对本方案所涉及的设备。
  3. 为建立大鼠缺血-再灌注损伤的MCAO模型，采用血管内线栓法。
  4. 术前禁食12小时，可自由饮水。
  5. 使用2%异氟烷（见材料表）与空气-氧气混合气体（流速0.6 L/min）对SD大鼠进行麻醉。用镊子夹捏肢体皮肤以确认麻醉效果；大鼠应无回缩或腿部反射。将完全失去意识的大鼠固定于手术台上，使用动物体温维持仪保持体温在37 °C。手术期间用胶带闭合眼睛，防止干燥。
  6. 使用电动剃刀去除颈部周围毛发，并用聚维酮碘消毒皮肤。用手术剪在颈部正中做1.5 cm切口（见材料表），钝性分离肌肉和血管周围筋膜，暴露气管以定位右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。手术器械应灭菌以防止感染。
  7. 用6-0手术缝线结扎ECA远端，并在ECA近端至分叉处松松地绕置另一根缝线。操作时注意避免损伤迷走神经。
  8. 用血管夹夹闭CCA和ICA，并在两根缝线之间的ECA上做一个小切口。
  9. 将单丝缝线经ECA管腔插入并朝向CCA方向推进，收紧围绕ECA残端的缝线以固定血管内缝线并防止出血。确保所用单丝缝线的规格与动物体重相匹配，以最小化损伤并实现同侧半球目标梗死体积为40%。
  10. 剪除剩余的ECA部分，释放残端，并将ECA残端置于分叉点下方，使其大致与ICA成一直线。
  11. 移除ICA上的微血管夹，继续推进缝线直至感到轻微阻力，表明大脑中动脉已被阻塞；此插入深度通常约为2 cm。将缝线在单丝上牢固结扎。随后移除CCA上的另一微血管夹。
  12. 用手术缝线缝合切口，将大鼠放入恢复笼中，在缺血后最多2小时内进行动物护理。

2. 恢复大脑中动脉血流

  1. 再次麻醉前，使用Longa评分量表检查神经功能评分，以评估步骤3中所述手术的成功情况。
  2. 按上述方法麻醉大鼠并重新打开切口。在颈总动脉（CCA）上放置一个微血管夹，将阻塞缝线从颈内动脉（ICA）中部分撤出，直至缝线末端在ICA中可见。
  3. 在ICA上位于血管内缝线位置的近端再放置另一个微型夹，完全移除阻塞缝线，并结扎颈外动脉（ECA）残端。再灌注24小时。
  4. 移除CCA和ICA上的夹子，用外科缝线关闭切口，并皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg；参见材料表）。
  5. 将大鼠放回笼中，提供水和软质食物，并在其恢复意识前进行看护。在整个实验过程中，维持大鼠体温在37±0.5 °C。

3. 神经功能评分评估

  1. 手术后及再灌注24小时后，使用Longa评分量表11评估神经功能缺损：(0) 无缺损；(1) 不能完全伸展左侧（瘫痪侧）前爪；(2) 向左侧（瘫痪侧）转圈；(3) 向左侧（瘫痪侧）倾倒；(4) 无自主行走，意识水平下降；(5) 死亡。
    注意：由三名操作人员根据上述标准进行评估。

4. 脑组织采集

  1. 在评估神经功能缺损评分后24小时再灌注时采集脑组织。
  2. 按照上述方法麻醉大鼠。剪开皮肤暴露头颈部，用手术剪（见材料表）从颈椎处剪断脊髓。
  3. 分离并去除后颈部肌肉。使用弯头镊子（见材料表）小心去除颅骨。分离颅骨时需注意保护硬脑膜，避免划伤脑组织。完全取出脑组织。
  4. 将脑组织置于预冷至4 °C的透射电镜（TEM）和免疫电镜（IEM）固定液中，并于4 °C冰箱中保存。

5. 假手术操作

  1. 对于假手术操作，除不进行阻塞外，其余步骤均同上述操作。

6. 超薄切片制备与成像

  1. 透射电镜超薄切片制备
    1. 固定：确定新鲜组织的取样部位，尽量减少牵拉、挫伤和挤压等机械损伤，确保组织厚度不超过 2 mm，体积不超过 1 mm × 1 mm × 1 mm。
    2. 使用透射电镜固定液在 4 °C 下固定 24 小时。用 0.1 M 磷酸缓冲液（PB，pH 7.4；见材料表）洗涤 3 次，每次 15 分钟。
    3. 后固定：在室温（25 °C）下用 1% 锇酸·0.1 M PB（见材料表）处理 2 小时。
    4. 脱水：依次在 30% 乙醇中脱水 10 分钟、50% 乙醇中 10 分钟、70% 乙醇中 15 分钟、90% 乙醇中 15 分钟、无水乙醇中 15 分钟、100% 丙酮中 15 分钟。
    5. 浸透：将组织依次浸入 SPI-Pon 812 环氧树脂：丙酮 = 1:3 的溶液中 30 分钟，SPI-Pon 812：丙酮 = 1:1 的溶液中 30 分钟，SPI-Pon 812：丙酮 = 3:1 的溶液中 1 小时（见材料表）。
    6. 包埋与聚合：将样品在纯 SPI-Pon 812 中于 37 °C 浸泡过夜，更换新鲜 SPI-Pon 812 处理 8 小时，然后在 60 °C 下聚合 48 小时（见材料表）。
    7. 切片： 使用金刚石刀将包埋块切成 0.8 µm 厚的半薄切片，在 25 °C 下用甲苯胺蓝染色 5 分钟。在光学显微镜下定位并选择神经元密集区域用于高倍观察。用超薄切片机切成 90 nm 厚的超薄切片。将样品置于 200 目载有 Formvar 膜的铜网上（见材料表）。
    8. 后染色：在 25 °C 下用醋酸铀染色 15 分钟，然后在 25 °C 下用柠檬酸铅染色 5 分钟。
  2. 免疫电镜超薄切片制备
    1. 执行步骤 6.1.1–6.1.4。
    2. 浸透：将组织依次浸入 L. R. White 树脂：乙醇 = 1:3 的溶液中 2 小时，L. R. White 树脂：乙醇 = 1:1 的溶液中 2 小时，L. R. White 树脂：乙醇 = 3:1 的溶液中 2 小时。
    3. 包埋与聚合：将样品在纯 L. R. White 树脂中于 4 °C 浸泡过夜，更换新鲜 L. R. White 树脂在 25 °C 处理 4 小时，然后在 55 °C 下聚合 78 小时。
    4. 切片（同步骤 6.1.7）：将包埋块切成 0.8 µm 厚的半薄切片，在 25 °C 下用甲苯胺蓝染色 5 分钟。在光学显微镜下定位并选择神经元密集区域。切成 90 nm 厚的超薄切片。将样品置于铜网上。

7. 免疫金标记

  1. 在 25 °C 下用 PBS 漂洗 2 次，每次 5 分钟，再用甘氨酸缓冲液漂洗 1 次，每次 5 分钟，然后加入 2% 磷酸盐缓冲液配制的牛血清白蛋白（PBS-BSA），于 37 °C 孵育 30 分钟。
  2. 加入一抗（兔多克隆抗细胞色素 C 抗体）溶液，在 37 °C 孵育 2 小时。一抗用 PBS-BSA 按 1:50 的比例稀释。
  3. 在 25 °C 下用 PBS 漂洗 5 次，每次 5 分钟。然后在胶体金标记的二抗（金标羊抗兔 IgG）溶液中于 25 °C 孵育 1 小时。二抗用 PBS-BSA 按 1:20 的比例稀释（参见 材料表）。
  4. 在 25 °C 下用 PBS 漂洗 5 次，每次 5 分钟。再在 25 °C 下用蒸馏水漂洗 5 次，每次 5 分钟（参见 材料表）。
  5. 后染色：在 25 °C 下用醋酸铀染色 10 分钟，然后在 25 °C 下用柠檬酸铅染色 2 分钟（参见 材料表）。
  6. 在透射电子显微镜下观察超薄切片，并在 80 kV 下拍照成像。

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结果

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根据Longa评分标准，神经功能评分评估证实了大脑中动脉闭塞（MCAO）造模成功：MCAO组大鼠至少出现向左转圈的行为（神经功能评分为2分），而假手术组大鼠未见明显神经功能缺损（神经功能评分为0分）。手术当天未观察到动物死亡。动物的神经功能评分详见表1。

MCAO组的电镜分析显示，神经元细胞核皱缩，胞质电子密度升高，并伴有部分线粒体结构破坏。关键的是，免疫胶体金标记的细胞色素c（Cyt c）表现出显著的重新分布：与假手术组中Cyt c主要定位于线粒体不同，MCAO样本中线粒体内的金颗粒明显减少，而胞质和细胞核中则出现大量标记信号。Cyt c从线粒体向胞质和细胞核的空间转移，直接可视化了线粒体外膜通透化的发生，并证实了脑缺血-再灌注损伤后内在性凋亡通路的激活。这些超微结构改变与Cyt c转位之间的关联，为细胞亚水平上凋亡启动提供了确凿证据。

透射电镜显示，假手术组大鼠海马神经元的超微结构正常，线粒体和内质网未见病变。MCAO组部分神经元出现核固缩和变性，呈现坏死前改变的特征，伴有线粒体肿胀或破坏...

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讨论

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急性缺血性卒中再灌注治疗的主要目标是恢复缺血区域的血液灌注。目前，我们可以通过静脉溶栓、血管内治疗和抗血栓治疗来实现这一目标。然而，血液灌注的恢复会导致缺血-再灌注损伤，加重神经元坏死和凋亡，从而引起神经功能障碍。在缺血-再灌注过程中，线粒体电子传递链中电子异常泄漏，导致大量线粒体活性氧的产生，进而损伤线粒体膜，释放细胞色素c（Cyt c）和线粒体DNA13。研究表明，Bax通道抑制剂和胰岛素可激活细胞存活信号通路，阻止细胞色素c的凋亡性释放，发挥神经保护和抗凋亡作用14,15。

免疫组织化学技术使我们能够可视化并定位细胞区室和组织中的特定生化成分。结合透射电子显微镜（TEM），我们可以精确捕捉蛋白质在超微结构中的位置变化。免疫胶体金技术已在细胞生物学、免疫学、组织学和病理学的细胞超微结构水平研究中取得显著进展，并成功应用于多个领域16,

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了四川省中医药管理局中医药专项科研项目（2021MS414）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9%生理盐水四川科伦药业股份有限公司H20083400
200目铜网，覆有Formvar膜中精科技有限公司BZ10262a
220-230克 MCAO 单丝线栓北京赛诺腾科技有限公司A4-243250
无水乙醇成都 Kelong 化学 有限公司2023101201
丙酮成都 Kelong 化学 有限公司2023120501
动物麻醉系统Rayward Life Technology Co., Ltd.R500
动物体温维持器Rayward Life Technology Co., Ltd.69020
烘焙台深圳邦奇创源科技有限公司CT-946
骨剪切Fine Science Tools16102-11
胶囊包埋模具中精科技有限公司GP130-B
离心SCILOGEXD3024R
常规明场光学显微镜技术蔡司（德国）Primo Star
弯头眼科镊（10 cm）上海医疗器械有限公司211001
金刚石刀Diatome（瑞士）DU4530
解剖镊Rayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
解剖镊Rayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
电热鼓风干燥箱上海翼亨科学仪器有限公司DHG-9030A
电动剃须刀义乌市科美电器有限公司KM-PG5002
固定液四川科学家生物科技有限公司SC0001
载玻片南通美维德生命科学有限公司220518001
金标山羊抗兔IgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.D111094
止血钳（12.5 cm）安琪生科有限公司PL068
止血钳（14 cm）安琪生生物技术有限公司PL002
异氟烷Rayward Life Technology Co., Ltd.2024071201
L. R. White 树脂天津泰诺科技有限公司AGR1281A
柠檬酸铅SPI（美国）GA10701
持针器 佳驰医疗科技有限公司10044036898028
四氧化锇TED PELLA (美国)4008-220501
PBSServicebioG4202
兔多克隆抗细胞色素c抗体  Affinity Biosciences, Ltd.AF0146
大鼠北京华福康生物技术有限公司110322241102187881
SPI-Pon 812 包埋树脂试剂盒SPI(US)GS02660
体视显微镜舜宇光学科技（集团）有限公司Soptop SZMN
直头剪刀（10 cm）安琪生生物技术有限公司PL063
直式眼科镊（10 cm）上海医疗器械有限公司211001
手术剪Rayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
透射电子显微镜技术日立（日本）有限公司HT7800
超薄切片机徕卡（德国）UC7
醋酸铀SPI（美国）GS02624

参考文献

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