Method Article

同步无标记自发荧光多谐波显微镜

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议提供了同步无标记自发荧光多谐波（SLAM）显微技术的分步指南，包括有关如何生成激光光源，制备组织样本，进行成像和分析数据的详细信息。SLAM 通过测量四种互补的无标记对比度来研究组织微环境，从而推进了非线性显微镜的发展。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非线性光学显微镜通过检测超短激光脉冲与内源性分子的非线性相互作用信号来对生物样品进行成像。该方法允许以标记或无标记和无损的方式以亚细胞分辨率快速鉴定化学和结构，从而成为研究细胞和组织的强大方法。这些独特的非线性对比度包括多光子激发自发荧光和谐波产生。由于这些对比度中的每一种都具有独特的优点和局限性，因此它们的组合和时空共配准提供了一个互补的对比调色板，增强了非线性光学显微镜的分析能力。因此，我们小组开发了同步无标记自发荧光多谐波（SLAM）显微镜，这是一种测量四个或更多同时产生的非线性光信号的成像技术，旨在识别生物标本中不同的形态、代谢和功能特征。在这里，我们提出了一种用于组织SLAM成像的协议，重点关注该技术的基本组成部分，包括激光源，脉冲压缩和显微镜。此外，我们还讨论了样本制备并概述了 SLAM 数据的数据处理管道。所提出的工作流程适用于研究人类和动物组织的代谢状态、排列、细胞反应和组成，而无需依赖外源性标记。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非线性光学显微镜利用标本对强光辐射（电场大于 3 × 103 V/cm 的光）的响应来得出图像对比度，其中感应偏振（以及产生的信号）非线性地取决于入射强度 1,2,3。由于这些多重对比度都是由不同的光-物质相互作用介导的，因此非线性显微镜可以同时访问有关样品1,2,3的形态和化学景观的独特信息。虽然涉及与照明光线性相互作用的传统显微镜技术也可以实现定量成像，但非线性显微镜允许采用更加多模态的方法，通常具有改进的成像深度和光学切片，同时也对样品造成的光损伤较小4。在生物医学应用的背景下，例如组织的术中组织学样评估 5,6，该技术能够直接探测天然生物分子，促进活细胞的无缝研究，而无需外部标记或修饰。这种方法避免使用标签、标记7、外源分子、基因表达的荧光蛋白或纳米颗粒，这些不仅需要大量的劳动力，而且有可能破坏标本的天然生物化学并对靶细胞或组织产生负面影响8,9,10.因此，非线性显微镜是一种强大而真正的分析工具，可以在不改变样品的化学和结构完整性的情况下提供微观结构的连续成像。这种能力开辟了广泛的应用，从诊断和药物发现到细胞信号传导和系统生物学。

双光子自发荧光 （2PAF）、三光子自发荧光 （3PAF）、二次谐波产生 （SHG） 和三次谐波发生 （THG） 等多光子对比度在表征样品时都具有分析优势。2PAF 由内源性黄素产生，其中黄素腺苷二核苷酸 （FAD） 在生物系统中含量最高11。3PAF 利用近红外激发来可视化 NAD（P）H 等内在发色团，并实现代谢成像，同时规避与紫外线相关的光毒性和衰减问题12。SHG 特异性揭示了非中心对称分子结构，例如纤维状胶原蛋白（I、II 和 III 型）和蛋白质阵列 13,14,15,16,17，提供结构见解 1。最后，THG 对界面和小结构特征敏感，在脂质分布和细胞外囊泡成像方面表现出色 18,19,20,21,22。

这些对比信号中的每一个都已被研究小组独立探索，为多光子非线性显微镜建立了利基市场，成为生物应用的可靠和多功能工具23,24,25,26。这些努力是由 2PAF 显微镜的发明者带头的，他们利用他们的创新技术对组织形态、细胞代谢，甚至阿尔茨海默病和癌症等病理的形态功能特征有了新的见解23。他们的工作最终推动了神经科学领域的突破性应用27,28。在接下来的几年里，几位研究人员强调了 SHG 对细胞外基质变化的敏感性，细胞外基质是为细胞提供结构支持的支架，并在癌症发病机制期间发生重大改变29。值得注意的是，Campagnola 等人 14,24,30,31 证明 SHG 显微镜能够可视化大分子和超分子组装体，揭示胶原蛋白的排列、浓度和类型等细节，这些细节是传统荧光技术无法检测到的。这些结果强调了 SHG 显微镜作为临床环境中可行诊断工具的潜力。最后，THG显微镜成功应用于以亚细胞分辨率25可视化啮齿动物的视网膜层，绘制大脑结构图32，并捕获黑色素瘤细胞侵袭的多界面形貌33。

非线性显微镜的这些历史实施通常涉及锁模飞秒（fs）激光器耦合到高数值孔径（NA）物镜以产生和收集非线性信号，然后用二向色镜引导到带通滤光片并用光电倍增管（PMT）34收集。尽管实现类似，但大多数应用程序只专注于获取一个或最多两个对比度，而忽略了其他对比度。为了充分发挥多光子显微镜的潜力，Boppart等首先实现了多个非线性对比度的顺序采集21,35,36,37，然后同时检测它们4,22,38,39,40,41.由此产生的技术被称为同步无标记自发荧光多谐波 （SLAM） 显微镜，通过单次激发和多重检测在空间和时间上共配准非线性 2PAF、3PAF、SHG 和 THG 信号，从而实现卓越的分析能力。这四个通道的时空共定位提供了高度排名和特征丰富的数据42，通过消除运动伪影并确保改进图像配准，与顺序采集的数据相比具有优势。因此，SLAM能够产生复合特征，例如光学还原氧化比，从而有效地表征代谢特性43,44,45。此外，跨模态信号的组合分析有助于基于信道的相关性和共定位的附加特征的工程设计。例如，Shi等人证明了SLAM显微镜的共定位特征在准确分类药品生产中使用的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞方面的重要性42。通过这种方式，SLAM 为现在被认为是最先进的多光子显微镜奠定了基础，为该领域的未来进步铺平了道路46.

在本协议中，我们概述了SLAM显微镜的关键组件（图1），并描述了其实施的分步方法。这包括激发脉冲的生成和成型、代表性组织标本制备、成像程序和处理，以及结果数据的显示。通过利用现成的技术和成熟的技术，该协议是通用的、可转移的，并且可以在不同实验室中使用类似的光学系统轻松复制。

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图 1：同步无标记自发荧光多谐波 （SLAM） 显微镜的光学设计。 飞秒激光器以 10 MHz 的重复率以 370 fs 脉冲输出 1040 nm 光。在泵浦光子晶体以产生超连续谱之前，激光的强度和偏振受到仔细控制。然后脉冲被脉冲整形器压缩并引导到定制的激光扫描显微镜（虚线框）中。二向色反射镜和带通滤光片在光电倍增管 （PMT） 或混合光电探测器 （HPD） 等高灵敏度光子探测器检测到样品产生的非线性信号之前隔离它们。光学设计基于先前描述的系统41。 请点击此处查看此图的大图。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有动物研究均按照伊利诺伊大学机构动物护理和使用委员会批准的方案 UIUC#23031 进行，并严格遵守所有相关指南和规定。

1. 切割和对准光子晶体光纤 （PCF）

  1. 使用光纤切割器或线切割器，将一段光子晶体光纤（PCF， 材料表）切割成略高于 15 厘米的长度。
    注意：至少 1.5 厘米的长度将从 PCF 的每一端切割，因为需要这个长度在切割过程中牢固地夹紧 PCF。本研究中使用的 PCF 的最终长度 （12 cm） 是根据先前使用广义非线性薛定谔方程47 的模拟和实证检验确定的。一般来说，最佳 PCF 长度可能会因 PCF 类型、泵浦激光输入和所需的超连续介质而异。
    注意：切割 PCF 时，请穿戴个人防护装备 （PPE） 以保护实验者的眼睛和皮肤。立即将纤维废料丢弃到锐器处理容器中。
  2. 使用剥离剂（材料表）或剃须刀片从PCF的每一端剥去约3厘米的塑料涂层，并用薄纸（材料表）和100%甲醇清洁任何残留的塑料。
  3. 将 PCF 的一端放入精密光纤切肉刀（材料表）上的支架中，并将刀片对齐距 PCF 末端 1.5 厘米。小心地关闭夹子并按下 劈开 按钮。
    注意：仔细遵循光纤切割器的用户手册，包括切割 PCF 的具体指南。这些设置（例如纤维张力）可能需要微调，以实现每种类型的 PCF 的一致和高质量的切割。
  4. 在玻璃纤维加工工作站上使用集成显微镜（10×放大倍率）检查PCF的裂解面和侧面（材料表），确保裂解质量良好（图2A，C）。如果有碎屑（图2D），划痕（图2E）或切割表面不平坦且垂直于PCF的长度（图2B），则重新切割。
    注意：在此步骤和后续步骤中应格外小心，避免将 PCF 的裂解端接触任何表面，以免造成损坏。
  5. 切割 PCF 的第二端，确保所需的最终长度。
    注意：本协议中使用的PCF被切割成12厘米。
  6. 与前面的步骤一样，检查PCF新切割的末端（请参阅步骤1.4）。如果劈裂出现故障或不一致，请丢弃当前的 PCF 并使用新的 PCF 重复该过程。
  7. 将 PCF 的输入端夹在 3 轴载物台（材料表）上，大约与用尺子测量的光纤耦合透镜的焦距相同。用临时柱子或支架牢固地支撑 PCF 的另一端。
    注意： 不要 clamp 输出，以免在粗调整过程中损坏 PCF。
    注意： 支撑输出端并用足够的光束块包围它，对于降低激光照射的风险是必要的。
  8. 将光功率计（材料表）放置在 PCF 之前的光束路径中以测量输入功率。在打开激光器之前，确保飞秒激光器（材料表）被快门 1 阻挡。
    注意： 始终完成任何必需的激光安全培训计划，以了解与激光使用相关的风险。
    注意：作激光器时，请佩戴专门针对所用激光器的波长和功率额定的适当激光安全眼镜。在作激光器之前，请取下所有可能导致危险杂散反射的珠宝、手表和其他反光物品。
  9. 打开激光器并让它预热激光器指定的“冷预热时间”。打开快门 1 并使用偏振分束器前的半波板 （HWP1） 调整功率，直到功率计读数为 260 mW 或更低。
    注意：根据经验确定，使用 260 mW 进行对准足够低，以避免损坏 PCF（即使未对准），同时仍为红外观察器或荧光目标上的可视化提供明亮的光束。
  10. 使用快门 1 阻挡激光器，并将功率计移动到 PCF 的输出端。
  11. 解锁激光器并使用 3 轴平台调整 PCF 输入面的光轴，直到功率计上出现信号，表明一些光耦合到 PCF 的磁芯、包层或塑料涂层中。如果将 PCF 输入定位在光束焦点处超出 3 轴载物台的范围，请阻挡激光器，然后调整并重新夹紧 PCF。
    注意：红外 （IR） 观察器或荧光目标可用于可视化光束聚焦的位置。
  12. 使用 3 轴载物台，调整 PCF 光轴的一个维度，以找到光耦合的范围，计算该范围的中间，然后将载物台移动到那里。对第二个维度重复此作，以使梁在 PCF 的核心上大致居中。
    注意：3轴载物台上的μm刻度线可以帮助测量距离并找到PCF的中心。
  13. 以重复顺序迭代调整 3 轴载物台的三个维度，同时优化耦合效率，以精确地将光束居中并聚焦到 PCF 的核心中。
    注意： 如果功率计测量的最大耦合效率明显低于输入功率的 80% 关闭快门 1，请松开 PCF 并检查其是否损坏。如果损坏，请从步骤 1.1 重新启动，否则，阻挡激光器，重新夹紧 PCF 并从步骤 1.11 重新开始对准。
  14. 用快门 1 阻挡光束并将激光功率增加到 1.6 W。
    注意：1.6 W 的使用是通过模拟和实证测试确定的，以生成足够宽的超连续谱，同时保持在 PCF 的损伤阈值以下。
  15. 打开快门 1 并再次迭代调整 3 轴级以调整 PCF 输入位置以优化耦合效率。
    注意：根据经验，最大效率通常约为 80%。
  16. 关闭快门 1 并将 PCF 的输出夹在大约抛物面镜的焦距处。在抛物面镜的输出端放置一个光束块。
  17. 再次将激光功率降低到 260 mW 或更低。
  18. 打开快门 1 并使用抛物面镜的 3 轴平台对准抛物面镜的光轴，以最大限度地减少光束的失真。接下来，调整焦点并在远场中准直光束。
    注意： 使用红外 view或荧光目标 view 输出光束。
  19. 调整抛物面镜之后的反射镜，以确保光束与光学系统的其余部分对齐。
    注意：安装永久翻转对齐目标或虹膜以使此步骤可重复。
  20. 关闭快门 1 并将激光功率增加到 1.6 W。打开快门 1 并验证光束路径是否保持不变。
  21. 使用功率计测量脉冲整形器（材料表）的输出功率。旋转脉冲整形器（HWP3）前面的半波板，以优化脉冲整形器的传输效率。

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图 2：光子晶体光纤 （PCF） 的切割端。 （甲、乙）劈开侧面的图像。（C-F）劈开的面部图像。（A） 切割良好的 PCF 具有平坦且垂直的面。（B）裂解不良的PCF，具有倾斜和碎裂的表面。（C）切割良好且表面干净的PCF。（D） 处理不当的 PCF，其表面有污垢。（E） 裂解不良的 PCF，其表面有划痕。（F） 更换的旧 PCF。PCF 中心有明显的损伤，如 PCF 中心的黑点所示。 请点击此处查看此图的大图。

2. 脉冲表征和优化

  1. 使用光谱仪或光谱分析仪（OSA， 材料表），测量抛物面镜后的激光，以验证 PCF 的超连续产生。
  2. 在偏振分束器（HWP2）之后旋转半波板，以优化超连续体的宽度。
  3. 打开显微镜自相关器（材料表）。使用软件，将检测器设置为内部检测器，并将扫描范围设置为 5 ps，以确保捕获脉冲自相关的整个宽度。
    注意：对于具有较长脉冲宽度的设置（例如ample，由于长 PCF 中的色散），应适当增加扫描范围。请记住，强度自相关器测量的脉冲宽度不是真实的脉冲持续时间，但它仍然可以作为脉冲压缩的有用参考。为了准确、完整地表征脉冲幅度和相位，应使用频谱分辨技术，例如频率分辨光学门控（FROG）48 。
  4. 解锁激光器并将自相关器对准离开脉冲整形器的光束，直到出现信号。
    注意：放置临时反射镜（两个在自相关器的输入端，两个在输出端）将使光束与自相关器对准，而不会影响光学系统的其余部分。
  5. 确保快门 2 已关闭，并在物镜上涂抹适当的浸入介质（例如水或油）（材料表）。将自相关器外部检测器放在显微镜载物台上（材料表）并调整载物台以将检测器定位在物镜正上方。
    注意：与典型的显微镜物镜不同，用于SLAM显微镜的推荐物镜是紫外透射的，以提高THG38的检测。
  6. 打开扫描振镜（材料表）以将其电压设置为零。打开快门并使用红外观察器或荧光目标来验证光束是否到达外部检测器。
  7. 将自相关器检测器设置为外部检测器。调整 stage 位置，直到信号出现。
    注意：如果检测器饱和，请使用中性密度滤波器降低功率。
  8. 调整脉冲整形器的多项式系数（色散阶数），以迭代最小化自相关器测量的脉冲宽度。随着脉冲宽度的减小，适当减小自相关器扫描范围，以提高自相关函数的准确性和可视化。
    注意：使用高斯拟合测量的最佳脉冲宽度应为几十飞秒 （fs）。

3. 样品制备

注意：为简单起见，该协议描述了 离体 组织成像。然而，由于SLAM的无标记性质， 体内 成像程序很容易适应38。

  1. 通过 CO2 窒息或其他 IACUC 批准的安乐死方法对动物实施安乐死。
  2. 在死后 10 分钟内使用标准尸检程序49 收获感兴趣的器官，并用预冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗以去除血液。
    注意：在这项研究中，收获了肝脏和肺。
  3. 使用刀片垂直或水平解剖器官，具体取决于分析所需的方向。确保解剖精确进行，以保持组织结构的完整性。
  4. 将组织片放入装有无酚红完全细胞培养基的无菌组织培养皿中。如果不立即收集图像，请将组织冷藏在4°C。
    注意：本研究中使用的细胞培养基是HEPES缓冲-Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM），补充有10%胎牛血清（FBS），4mM谷氨酰胺和内皮细胞生长培养基补充剂（材料表）。经过精心选择的培养基，以在成像持续时间50 期间维持驻留在肾组织样本中的上皮细胞和内皮细胞的生理活力。
  5. 要制备荧光校准标准品，请将精密秤归零到防静电称重船的重量，并测量约5mg黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐（FAD， 材料表）或5mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（NADH， 材料表）。
  6. 使用单通道移液器将适当体积的 1 M HEPES 缓冲液分配到装有预称重的 FAD 或 NADH 粉末的称量船中，以制备 5 mM 储备溶液。反复上下移液以溶解粉末。
  7. 从储备溶液中以 1：5 稀释制备 1 mM 工作溶液，进入 HEPES 缓冲液中。
    注意：本研究中使用的 1 mM 工作浓度是根据经验确定的，以产生高信号，同时避免检测器饱和。
  8. 将储备的FAD和NADH溶液储存在4°C的微量离心管中。
    注意：溶液标准品可以冷藏保存数天，但建议为每次实验制备新鲜的溶液。
  9. 在收集SLAM显微镜图像之前，将组织样本放入35毫米玻璃底成像皿中（材料表）。或者，使用玻璃盖玻片。将 FAD 和 NADH 溶液等分到相同的培养皿或盖玻片中。
    注意：由于背景信号降低，强烈建议使用未镀膜玻璃或聚 D-赖氨酸涂层玻璃。确保玻璃厚度适合所使用的显微镜物镜（本研究使用#0）。

4. SLAM设置和作

  1. 验证 PCF 的激光输入是否被快门 1 阻挡，然后打开激光器。让激光预热到激光指定的“冷预热时间”。
    注意：在本研究中，激光使用了 30 分钟的冷热热时间。
  2. 验证光束路径是否没有障碍物，并将光功率计放置在 PCF 之前的光束路径中。打开快门 1 并测量输入功率。
  3. 关闭快门 1 并将功率计移至抛物面镜后面的 PCF 输出端。打开快门 1 并使用输入 3 轴级最大化 PCF 输出。
  4. 让 PCF 预热 10 分钟，然后再次最大化输出功率。记录 PCF 的传输。如果变速箱低于 50%，请更换 PCF。
    注意：在SLAM显微镜的整个作过程中（在以下步骤中），建议每小时测量一次PCF的输出功率，以确保数据一致。
  5. 将功率计移动到中性密度 （ND） 滤光片之后并旋转滤光片以控制到达样品的激光功率。
    注意： 将测量的功率乘以其余光学元件的透射率。透射率是通过将功率计放在物镜后面来测量的。在本研究中，样品的平均激光功率为 20 mW。根据经验确定给定样品、成像深度和显微镜系统的激光功率，以生成高质量的图像，同时避免样品损坏或探测器非线性。虽然没有明确的标准，但典型的无标记多光子成像仅限于几十到数百毫瓦 7,32,33,51,52。
  6. 打开检流计和载物台。打开采集软件并输入所需的成像参数。
    注意：本研究使用 512 × 512 像素和 13.65 μs 的像素停留时间对 360 × 360 μm2 视场进行成像。以 0.333 Hz 拍摄的五帧被平均成一个高质量帧。
  7. 将样品放置在载物台上，使用适合物镜的浸入介质，如之前在步骤 2.5 中使用的那样。
  8. 关掉房间的灯并拉上窗帘。
    注意： 为避免损坏探测器，切勿在探测器打开或探测器百叶窗打开时打开室内灯。
  9. 打开探测器电源和放大器。
  10. 关闭舞台周围的灯箱。
  11. 使用电子控制开关手动打开探测器百叶窗（S3、S4、S5、S6）。
  12. 在显微镜采集软件中，单击 单击开始采集 以开始采集 SLAM 图像。通过旋转显微镜载物台控制器（材料表）上的旋钮来调整显微镜的焦点，直到样品聚焦。
    注意：玻璃盖玻片产生强 THG 信号，可用于使用显微镜载物台控制器上显示的载物台位置准确确定成像深度。例如，本研究中拍摄的所有溶液标准品图像都是在盖玻片上方20 μm的焦平面上拍摄的。
  13. 使用显微镜载物台控制器上的纵杆在样品中找到所需的视野，然后单击 停止并重置。
    注意：如果图像饱和，请返回步骤 4.5，并降低功率。如果图像的信噪比低于 10，则可以小心地增加功率。
  14. 在 “保存” 选项卡下，单击 “保存数据” 将其切换为 “是”，然后单击 “单击开始采集”。等到采集完成后再继续。
  15. 要在成像过程中更改或作样品，请关闭探测器百叶窗并使用手电筒或前照灯照明。修改样品后，返回步骤 4.10。
    注意：为了实现可重复性和定量分析，请收集FAD和NADH溶液标准品的SLAM图像。确保视场、图像大小和激发功率与生物样品所用的一致。
  16. 要结束 SLAM 图像采集，请关闭探测器百叶窗，并在打开室内灯之前关闭探测器。
  17. 使用快门 1 阻挡激光，然后关闭激光。
  18. 关闭检流计和载物台。关闭显微镜采集软件。
  19. 妥善处理纸巾并清洁工作场所。

5. 数据可视化

注意：以下图像分析可能发生在图像分析软件（例如 ImageJ53 （材料表）或具有图像分析功能的编程语言（例如 Python 或 MATLAB）中。以下步骤介绍如何使用 ImageJ 进行数据可视化。

  1. 确保每个通道的图像采用无损图像格式（例如 TIFF 或 PNG）。
    注意：本研究中使用的定制显微镜控制软件自动将图像保存为TIFF。要将图像另存为 TIFF，请在 ImageJ 中打开它，然后选择“文件”>“另 存为 > Tiff”。
  2. 要生成照明标准图像，请分别将FAD和NADH溶液的FAD和NAD（P）H通道图像打开到ImageJ中。对于每张图像，选择“ 处理”>“滤镜”>“高斯模糊...”，将 “西格玛（半径） ”设置为 41，然后单击 “确定”。
    注意：根据需要调整高斯滤波器的 Sigma（半径）， 以充分平滑图像。
  3. 要同时校正不均匀的照明并归一化荧光强度，请打开样品的 FAD 和 NAD（P）H 通道图像。对于每个图像，选择“处理>图像计算器...”，对于 Image1，选择示例图像，对于 Operation，选择 Divide，对于 Image2，选择与示例图像通道相对应的照明标准图像，然后单击 OK。
    注意：此步骤对于纠正系统变异性和保持自发荧光定量评估（例如光学氧化还原比 （ORR））的一致性至关重要。
  4. 如果拍摄多张图像以形成更大的视野或 z 堆栈，请将图像拼接或组合成单个图像或图像堆栈。
  5. 要生成 ORR 图像，首先将 FAD 和 NAD（P）H 图像相加。选择“处理>图像计算器...”，对于 Image1 和 Image2，分别选择 FAD 和 NAD（P）H 通道图像，对于 Operation，选择 Add，然后单击 OK。要计算 ORR 图像，请选择“处理>图像计算器...”，对于“图像 1”，选择 FAD 通道图像，对于“操作”选择“除法”，对于“图像 2”，选择 FAD 和 NAD（P）H 之和的结果，然后单击“确定”。
  6. 要将色图应用于 ORR 图像，请选择 图像>颜色>编辑 LUT...，单击 打开，选择所需的查找表 （.lut） 文件，然后单击 确定。选择 图像>调整>亮度/对比 度并根据需要调整对比度。
    注意：建议使用等光色图，例如本研究中使用的（倒置）CET-I254,55 色图。要在将颜色图应用于图像后在 ImageJ 中反转颜色图，请选择图像>颜色>反转 LUT。
  7. 为了提高 ORR 图像中特征的清晰度，请根据荧光通道的强度缩放亮度。首先，选择FAD和NAD（P）H之和的结果，选择 处理>增强对比度...，确保选中 归一化 ，然后单击 确定。选择 “编辑>复制 ”，将此结果复制到剪贴板。接下来，选择 ORR 图像并选择 图像>类型> RGB 颜色“，然后选择 图像>类型> HSB（32 位）。将图像底部的滑块一直向右移动以查看 亮度通道， 选择 编辑>粘贴，然后选择 图像>类型> RGB 颜色。
  8. 要将 SLAM 图像可视化为合成图像，请在 ImageJ 中打开四个 SLAM 通道并选择： 图像>颜色>合并通道... 对于 C2（绿色），选择 SHG 通道图像，对于 C5（青色）， 选择 NAD（P）H 通道图像，对于 C6（洋红色）， 选择 THG 通道图像，对于 C7（黄色）， 选择 FAD 通道图像。确保选中“ 创建复合材料 ”，然后单击 “确定”。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SLAM 显微镜复杂的多通道、多模态方法（图 1）可能使新用户难以解决问题和理解结果。首先，切割良好的PCF具有干净的表面（图2C），其表面垂直于PCF的长度（图2A）。有角度的、有缺口的劈裂面（图2B）和划痕的存在（图2E）表明裂解不良。 图2D 所示的PCF表面的污垢或碎屑表明PCF在切割后裂解不良或处理不当。最重要的是，PCF 的核心是被蜂窝状气孔图案包围的小中心区域，在成功劈裂时应没有碎屑或划痕。也就是说，观察到小划痕和一些碎屑是正常的，特别是在 PCF 的外包层上（图 2C），并且这些 PCF 很可能仍然可用。在PCF的使用寿命内，它会受到损坏，耦合效率会下降，并且需要更换PCF。PCF 泵送不当或空气中的颗粒沉积...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生成合适的超连续体对于成功的 SLAM 成像至关重要，但由于设置 PCF 的复杂性，这可能具有挑战性。确保 PCF 的精确切割和小心处理对于保持表面清洁无碎屑、污垢或划痕至关重要，所有这些都会干扰有效耦合、超连续介质的产生，甚至缩短 PCF 的使用寿命。由于 PCF 需要定期更换，因此练习纤维切割和微调切肉刀设置有助于实现最佳切割。此外，每次使用前精确对准PCF和定期重新对准对于确保生成所需的超连续体至关重要。未对准也会损坏 PCF。由于PCF产生的超连续谱是SLAM显微镜的一个关键方面，因此PCF核心尺寸和长度的选择是一个重要的考虑因素。较长的 PCF 可以产生更广泛的超连续谱;然而，它可能会降低输出功率、增加色散、使安装复杂化并增加更换成本。较小的磁芯尺寸 PCF 还可以产生更宽的超连续谱，但与较大的磁芯直径相比，往往具有更短的寿命和更低的损伤阈值57。所描述的SLAM显微镜方法的一个局限性是PCF的质量参差不齐，它们对对准的敏感性以及性能随时间的下降。此外，与更换 PCF 相关的成本和时间也是重要因素。因此，正在探索...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中使用的设备的部分资金由葛兰素史克通过贝克曼先进科学技术研究所的光学分子成像中心提供。这项工作还得到了 NIH/NIBIB 无标记成像和多尺度生物光子学中心 （CLIMB） （P41EB031772） 和 NSF 定量细胞生物学科学技术中心的部分支持。K.K.D.T 得到了 NIEHS 毒理学和环境健康研究培训计划 （5T32ES007326-25） 的支持，A.D.C 得到了贝克曼先进科学技术研究所博士后研究员计划的支持，AH 得到了 NIBIB 组织微环境培训计划 （T32EB019944） 的支持。作者感谢 Darold Spillman 对实验室空间、设备和技术的管理，并感谢 Janet E. Sorrells 博士和 Rishyashring R. Iyer 博士过去对本研究中使用的 SLAM 显微镜系统的贡献。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3轴载物台雷神实验室MAX316停止。
35 毫米玻璃底成像盘马泰克P35G-0-14-C无涂层 #0 盖玻片。
DMEM的吉布科21063029高葡萄糖、HEPES、无酚红。
内皮细胞生长培养基补充剂普隆赛尔C-39210省略胎牛血清。
飞秒列车飞秒激光光谱-物理1040-5平均功率：>5.0 W，脉冲能量：>500 nJ，波长：1040 nm ±8 nm，重复率：10 MHz，脉冲宽度 （FWHM）：<220 英尺。
Fetal Bovine Serum赛蒂瓦SH30071.03HyClone 表征。
剥线钳雷神实验室T10S13型
黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物西格玛-奥尔德里奇F6625
振镜剑桥科技6215H停止。
玻璃加工工作站维特兰GPX3800
图像J威斯康星大学麦迪逊分校的 Eliceiri 实验室版本 2.16.0斐济分销。
Kimwipe 薄纸金佰利专业34120
L-谷氨酰胺赛蒂瓦SH30034.01
显微镜载物台应用科学仪器FTP-2050型
显微镜载物台控制器应用科学仪器MS-2000-500-UDSW
显微镜自相关器Angewandte Physik und Elektronik GmbH卡佩
物镜奥林巴斯XLPLN25XWMP2水浸，25 倍放大倍率，1.05 NA。
光功率计纽波特919P-003-10600 - 1700 纳米。
光谱分析仪雷神实验室OSA202C
光子晶体光纤NKT光子学LMA-PM-15 NKT模面积大，极化保持。芯径：15 &μm。
精密光纤切割刀藤仓CT-101型
脉冲整形器生物光子学解决方案公司飞秒运动员-D停止。
&β;-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原二钠盐水合物西格玛-奥尔德里奇10128023001

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