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方法文章

无标记自体荧光多谐波显微成像同步观测

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DOI：

10.3791/68637

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2025年8月29日

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

本文内容

摘要

本方案详细介绍了无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术的逐步操作流程，包括激光光源的产生、组织样本的制备、成像过程的实施以及数据的分析方法。SLAM技术通过检测四种互补的无标记对比信号，推动了非线性显微成像技术的发展，可用于研究组织微环境。

摘要

非线性光学显微技术通过检测超短激光脉冲与内源性分子发生非线性相互作用所产生的信号来对生物样本进行成像。该方法能够在无需标记或标签、非破坏性的条件下，以亚细胞分辨率快速实现化学成分与结构的识别，从而为细胞和组织的研究提供了一种强大的手段。这些独特的非线性对比机制包括多光子激发自体荧光和倍频/高次谐波产生。由于每种对比机制均具有各自的优势与局限性，将它们结合并实现时空共定位，可提供互补的对比度组合，从而增强非线性光学显微技术的分析能力。因此，我们课题组开发了同步无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微技术，该成像方法可同时检测四种或更多种并发产生的非线性光学信号，旨在识别生物样本中不同的形态学、代谢状态及功能特征。本文介绍了一种针对组织样本的SLAM成像实验方案，重点阐述该技术的关键组成部分，包括激光光源、脉冲压缩装置和显微镜系统。此外，我们还讨论了样本制备方法，并概述了SLAM数据的处理流程。该工作流程适用于在无需外源性标记的前提下，研究人类及动物组织的代谢状态、结构排列、细胞响应及组成成分。

引言

非线性光学显微技术利用样品对强光辐射（电场强度大于 3 × 103 V/cm 的光）的响应来产生图像对比度，其中诱导的极化（以及由此产生的信号）与入射光强呈非线性关系1,2,3。由于这些多种对比机制分别由不同的光与物质相互作用介导，非线性显微技术能够同时获取关于样品形态结构和化学分布的独特信息1,2,3。尽管涉及照明光线性相互作用的传统显微技术也能实现定量成像，但非线性显微技术提供了更丰富的多模态成像方式，通常具有更深的成像深度和更优的光学切片能力，同时对样品造成的光损伤更小4。在生物医学应用中，例如术中对组织进行类似组织学的实时评估5,6，该技术可直接探测内源性生物分子，无需外源标记或修饰即可无缝研究活细胞。这种方法避免了使用标签、标记物7、外源分子、基因表达的荧光蛋白或纳米颗粒，这些不仅需要大量实验操作，还可能干扰样品原有的生物化学环境，对目标细胞或组织产生负面影响8,9,10。因此，非线性显微镜是一种强大且真实的分析工具，能够在不改变样品化学和结构完整性的前提下，持续成像微观结构。这一能力为从疾病诊断、药物发现到细胞信号传导和系统生物学的广泛应用开辟了广阔前景。

多光子对比机制，如双光子自体荧光（2PAF）、三光子自体荧光（3PAF）、二次谐波生成（SHG）和三次谐波生成（THG），在样本表征中各自具有分析优势。2PAF由内源性黄素类分子产生，其中黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）在生物系统中含量最为丰富11。3PAF利用近红外激发来可视化内源性发色团（如NAD(P)H），可在避免紫外光相关光毒性和光衰减问题的同时实现代谢成像12。SHG可特异性揭示非中心对称的分子结构，例如纤维状胶原蛋白（I、II 和 III 型）及蛋白质阵列13,14,15,16,17，从而提供结构信息1。最后，THG对界面和微小结构特征敏感，在脂质分布和细胞外囊泡成像方面表现优异18,19,20,21,22。

这些对比信号已被多个研究团队分别深入探索，确立了多光子非线性显微镜作为生物应用中可靠且多功能工具的地位23,24,25,26。该领域的发展由双光子吸收荧光（2PAF）显微镜的发明者率先推动，他们利用这一创新技术，深入揭示了组织形态、细胞代谢，乃至阿尔茨海默病和癌症等病理状态的形态功能特征23。他们的工作最终推动了神经科学领域的突破性应用27,28。在随后的几年中，多位研究人员指出，二次谐波生成（SHG）对细胞外基质的变化具有高度敏感性；细胞外基质是为细胞提供结构支撑的支架，在癌症发生过程中会发生显著改变29。特别是Campagnola等人14,24,30,31证明，SHG显微镜能够可视化大分子和超分子组装结构，揭示出胶原蛋白的排列方式、浓度和类型等细节，而这些信息是传统基于荧光的技术无法检测到的。这些结果凸显了SHG显微镜在临床环境中作为有效诊断工具的潜力。最后，三次谐波生成（THG）显微镜已成功应用于在亚细胞分辨率下可视化啮齿类动物的视网膜层25，绘制脑结构图谱32，以及捕捉黑色素瘤细胞侵袭过程中的多界面拓扑特征33。

这些非线性显微技术的历史实现通常涉及使用锁模飞秒（fs）激光器耦合高数值孔径（NA）物镜，以产生并收集非线性信号，随后通过二向色镜将信号导向带通滤波器，并由光电倍增管（PMT）采集34。尽管实现方式相似，大多数应用仅专注于获取一种或最多两种对比度，而忽略了其他信号。为了充分实现多光子显微镜的潜力，Boppart 等人首先实现了多种非线性对比度的顺序采集21,35,36,37，随后发展为同时检测4,22,38,39,40,41。该技术被称为无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微术，通过单次激发和多路检测，实现非线性双光子激发自体荧光（2PAF）、三光子激发自体荧光（3PAF）、二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）信号在空间和时间上的共定位，从而获得更强的分析能力。这四个通道的时空共定位提供了高信息量且特征丰富的数据42，相较于顺序采集的数据，可消除运动伪影并提高图像配准精度。因此，SLAM 能够生成复合特征，例如光学氧化还原比值，有效表征组织代谢特性43,44,45。此外，跨模态信号的联合分析有助于基于通道间的相关性和共定位关系构建新的特征。例如，Shi 等人展示了 SLAM 显微术中共定位特征在准确分类用于药物生产的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的重要性42。由此，SLAM 为当前多光子显微技术的前沿发展奠定了基础，推动了该领域未来的进一步进步46。

在本实验方案中，我们概述了SLAM显微镜的关键组成部分（图1），并详细描述了其实施的逐步方法。内容包括激发脉冲的产生与整形、典型组织样本的制备、成像步骤，以及数据的处理与显示。通过采用现成的技术和成熟的方法，本方案具有通用性、可转移性，可在不同实验室中利用类似的光学系统轻松重复实现。

SLAM显微镜示意图；用于扫描和激发的光学装置；用于光谱分析的光子探测器。
图1：同步无标记自体荧光多谐波（SLAM）显微镜的光学设计。飞秒激光器输出波长为1040 nm、脉宽为370 fs的激光脉冲，重复频率为10 MHz。在泵浦光子晶体以产生超连续谱之前，激光的强度和偏振状态被精确控制。随后，脉冲通过脉冲整形器进行压缩，并导入定制的激光扫描显微镜（虚线框内）。二向色镜和带通滤光片用于分离样品产生的非线性信号，然后由高灵敏度光子探测器（如光电倍增管（PMT）或混合型光电探测器（HPD））进行检测。该光学设计基于先前报道的系统41。请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

所有动物实验均按照伊利诺伊大学动物护理与使用委员会批准的方案 UIUC#23031 进行，并严格遵守所有相关指南和法规。

1. 切割与对准光子晶体光纤（PCF）

  1. 使用光纤切割器或剪线钳，将一段光子晶体光纤（PCF，材料表）切割至略长于15 cm的长度。
    注意：由于在切割过程中需要牢固夹持PCF，因此每端需预留至少1.5 cm的长度用于夹持。本研究中使用的PCF最终长度（12 cm）是基于先前使用广义非线性薛定谔方程47进行的模拟以及实验测试确定的。通常，最佳PCF长度可能因PCF类型、泵浦激光输入以及所需的超连续谱而异。
    警告：切割PCF时，请佩戴个人防护装备（PPE），以保护实验人员的眼睛和皮肤。立即把光纤碎屑放入锐器废弃物容器中处理。
  2. 使用光纤剥线钳（材料表）或剃刀刀片，从PCF两端各剥离约3 cm的塑料涂层，并用擦镜纸（材料表）和100%甲醇清洁残留的塑料。
  3. 将PCF的一端放入精密光纤切割机（材料表）的夹具中，使刀片与PCF端面保持1.5 cm的距离。小心闭合夹具，然后按下切割按钮。
    注意：请仔细遵循光纤切割机的用户手册，包括针对PCF切割的具体指导说明。对于不同类型的PCF，可能需要对张力等参数进行微调，以获得一致且高质量的切割面。
  4. 使用玻璃光纤加工工作站（材料表）上的集成显微镜（10×放大倍数）检查PCF的切割端面及侧面，确保切割质量良好（图2A、C）。若存在碎屑（图2D）、划痕（图2E）或切割面不平整且不垂直于PCF轴向（图2B），则需重新切割。
    注意：在此步骤及后续步骤中应格外小心，避免让PCF的切割端接触任何表面，以防造成损伤。
  5. 对PCF的另一端进行切割，确保达到所需的最终长度。
    注意：本方案中使用的PCF被切割为12 cm。
  6. 与前述步骤相同，检查新切割的PCF端面（参见步骤1.4）。若切割质量不佳或不一致，应丢弃当前PCF，并使用新的PCF重新开始该过程。
  7. 将PCF的输入端固定在三维调节平台（材料表）上，位置大约位于光纤耦合透镜的焦距处（用直尺测量确定）。用临时支架或安装柱稳固支撑PCF的另一端。
    注意：暂勿夹紧输出端，以免在粗调过程中折断PCF。
    警告：支撑输出端并用足够的光束阻挡块包围，是降低激光暴露风险的必要措施。
  8. 将光功率计（材料表）放置在PCF前的光路中，用于测量输入功率。在开启激光器之前，确保飞秒激光器（材料表）被快门1遮挡。
    注意：务必完成所有必要的激光安全培训课程，以了解使用激光器相关的风险。
    警告：操作激光器时，应佩戴专为所用激光波长和功率等级设计的激光防护眼镜。在操作激光器前，取下所有珠宝、手表及其他反光物品，以防产生危险的杂散反射。
  9. 开启激光器，并让其按照规定的“冷启动预热时间”进行预热。打开快门1，并通过偏振分束器前的半波片（HWP1）调节功率，使功率计读数为260 mW或更低。
    注意：260 mW的功率用于对准是通过实验确定的，该功率足够低，即使在未对准的情况下也不会损坏PCF，同时仍能在红外观察仪或荧光靶上提供足够明亮的光束以便观察。
  10. 使用快门1遮挡激光，并将功率计移至PCF的输出端。
  11. 解除激光遮挡，使用三维调节平台调整PCF输入端面的光轴，直到功率计上出现信号，表明已有部分光耦合进入PCF的纤芯、包层或塑料涂层。如果PCF输入端的位置超出三维调节平台的调节范围，请先遮挡激光，然后调整并重新夹紧PCF。
    注意：可使用红外（IR）观察仪或荧光靶来观察光束的聚焦位置。
  12. 使用三维调节平台，逐个调整PCF光轴的一个维度，找到光耦合发生的范围，计算该范围的中点，并将平台移动至该位置。对第二个维度重复此操作，以大致将光束中心对准PCF的纤芯。
    注意：三维调节平台上的微米刻度标记有助于测量距离并确定PCF的中心位置。
  13. 循环依次调整三维调节平台的三个维度，同时优化耦合效率，以精确地将光束中心对准并聚焦到PCF的纤芯中。
    注意：如果功率计测得的最大耦合效率明显低于输入功率的80%，请关闭快门1，松开PCF夹具并检查其是否受损。若已损坏，则从步骤1.1重新开始；否则，遮挡激光，重新夹紧PCF，并从步骤1.11重新开始对准。
  14. 使用快门1遮挡光束，并将激光功率提高至1.6 W。
    注意：1.6 W的功率是通过模拟和实验测试确定的，可在不超出PCF损伤阈值的前提下产生足够宽的超连续谱。
  15. 打开快门1，再次循环调整三维调节平台，优化PCF输入端的位置以提高耦合效率。
    注意：实验表明，最大耦合效率通常约为80%。
  16. 关闭快门1，并将PCF的输出端夹紧在抛物面反射镜焦距附近。在抛物面反射镜的输出端放置一个光束阻挡块。
  17. 再次将激光功率降低至260 mW或更低。
  18. 打开快门1，使用抛物面反射镜的三维调节平台调整其光轴，以最小化光束畸变。随后，在远场中调节焦点并使光束准直。
    注意：使用红外观察仪或荧光靶观察输出光束。
  19. 调整抛物面反射镜之后的反射镜，确保光束与其余光学系统对准。
    注意：安装永久性的翻转对准靶标或光阑，以便使该步骤可重复。
  20. 关闭快门1，将激光功率提高至1.6 W。打开快门1，确认光路未发生变化。
  21. 使用功率计测量脉冲整形器（材料表）的输出功率。旋转脉冲整形器前的半波片（HWP3），以优化脉冲整形器的透射效率。

显示光子晶体结构的显微镜图像；微尺度下的衍射图样分析。
图 2：光子晶体光纤（PCF）的切割端面。（A, B）切割侧面的图像。（C-F）切割端面的图像。（A）良好切割的PCF具有平整且垂直的端面。（B）切割不良的PCF，其端面呈倾斜状并有缺损。（C）良好切割的PCF，端面洁净。（D）操作不当导致表面沾染污物的PCF。（E）表面存在划痕的切割不良PCF。（F）已更换的老化PCF，其纤芯可见明显损伤，表现为PCF中心的暗斑。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 脉冲表征与优化

  1. 使用光谱仪或光谱分析仪（OSA，材料表），在抛物面镜后测量激光，以验证光子晶体光纤（PCF）的超连续谱产生。
  2. 旋转偏振分束器后的半波片（HWP2），以优化超连续谱的宽度。
  3. 打开显微自相关仪（材料表）。通过软件将探测器设置为内置探测器，并将扫描范围设为 5 ps，以确保捕获脉冲自相关的完整宽度。
    注意：对于脉冲宽度较长的系统（例如，由于长光子晶体光纤中的色散），应适当增加扫描范围。需注意的是，强度自相关仪测得的脉冲宽度并非真实的脉冲持续时间，但仍可作为脉冲压缩的有用参考。若需准确且完整地表征脉冲的振幅和相位，应采用频域分辨技术，如频率分辨光学开关法（FROG）48。
  4. 解除激光遮挡，并调整自相关仪与脉冲整形器输出光束的对准，直至出现信号。
    注意：在自相关仪输入端和输出端各放置两片临时反射镜，可在不影响其余光学系统的情况下实现光束与自相关仪的对准。
  5. 确保快门 2 处于关闭状态，并在物镜上施加适当的浸没介质（如水或油）（材料表）。将自相关仪外置探测器放置于显微镜载物台上（材料表），并调节载物台位置，使探测器精确位于物镜正上方。
    注意：与典型的显微物镜不同，SLAM 显微成像推荐使用的物镜具有紫外透射特性，以提高三次谐波产生（THG）38 的检测效率。
  6. 开启扫描振镜（材料表），将其电压设为零。打开快门，使用红外观察仪或荧光靶标确认光束已到达外置探测器。
  7. 将自相关仪探测器设置为外置探测器。调节载物台位置，直至信号出现。
    注意：若探测器饱和，应通过中性密度滤光片降低光功率。
  8. 调整脉冲整形器的多项式系数（色散阶数），迭代优化以最小化自相关仪测得的脉冲宽度。随着脉冲宽度减小，应适当缩小自相关仪的扫描范围，以提高自相关函数的测量精度和可视化效果。
    注意：采用高斯拟合测得的最优脉冲宽度应为几十飞秒（fs）量级。

3. 样品制备

注意：为简便起见，本方案描述了 离体 组织成像。然而，由于SLAM具有无标记的特性， 体内 成像步骤易于调整38.

  1. 处死动物 通过 CO2 窒息或其他经IACUC批准的安乐死方法。
  2. 采用标准的解剖程序收获目标器官49 死后10分钟内用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗以去除血液。
    注意：本研究中采集了肝脏和肺组织。
  3. 根据分析所需的取向，使用刀片对器官进行垂直或水平切开。确保解剖操作精确，以维持组织结构的完整性。
  4. 将组织样本置于含有无酚红完全细胞培养基的无菌组织培养皿中。若不立即采集图像，可将组织在4 °C下冷藏保存。
    注意：本研究中使用的细胞培养基为含10%胎牛血清（FBS）、4 mM谷氨酰胺和内皮细胞生长培养基添加剂的HEPES缓冲型杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）材料表）。这种培养基经过精心选择，以在成像期间维持肾组织样本中上皮细胞和内皮细胞的生理活性50.
  5. 为制备荧光校准标准品，将精密天平归零至抗静电称量舟的重量，称取约5 mg黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐（FAD, 材料表）或5 mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐（NADH， 材料表).
  6. 使用单通道移液器将适量的1 M HEPES缓冲液加入已称重的FAD或NADH粉末的称量舟中，配制5 mM储存液。反复吹打混匀以溶解粉末。
  7. 通过将原液用 HEPES 缓冲液按 1:5 比例稀释，制备 1 mM 的工作液。
    注意：本研究中使用的1 mM工作浓度系通过实验确定，可在产生强信号的同时避免检测器饱和。
  8. 将FAD和NADH储备液储存于微量离心管中，置于4 °C保存。
    注意：溶液标准品可在冰箱中保存数天，但建议每次实验时新鲜配制溶液。
  9. 在采集SLAM显微镜图像前，将组织样本放入35 mm玻璃底成像培养皿中（材料表）或者，使用玻璃盖玻片。将FAD和NADH溶液分别等量加入相同的培养皿或盖玻片中。
    注意：强烈推荐使用未包被的玻璃或聚-D-赖氨酸包被的玻璃，以降低背景信号。确保玻璃厚度适用于所用的显微镜物镜（本研究使用的是 #0 厚度）。

4. SLAM 的设置与操作

  1. 确认快门1已阻挡进入光子晶体光纤（PCF）的激光输入，然后打开激光器。让激光器按照其规定的“冷启动预热时间”进行预热。
    注意：本研究中使用的激光器冷启动预热时间为30分钟。
  2. 确认光路中无障碍物，并在PCF前的光路中放置一个光学功率计。打开快门1，测量输入功率。
  3. 关闭快门1，将功率计移至抛物面反射镜后的PCF输出端。打开快门1，并通过调节输入端的三轴平移台，使PCF输出达到最大。
  4. 让PCF预热10分钟，然后再次最大化输出功率。记录PCF的透射率。如果透射率低于50%，则更换PCF。
    注意：在SLAM显微镜运行过程中（后续步骤），建议每小时测量一次PCF的输出功率，以确保数据的一致性。
  5. 将功率计移至中性密度（ND）滤光片后，旋转滤光片以调节到达样品的激光功率。
    注意：将测得的功率乘以其余光学元件的透射率。透射率通过在物镜后放置功率计进行测量。本研究中，样品处的平均激光功率为20 mW。该激光功率是根据特定样品、成像深度和显微镜系统经验确定的，旨在获得高质量图像的同时避免样品损伤或探测器非线性。尽管没有明确的标准，典型的无标记多光子成像通常限制在几十至几百毫瓦范围内7,32,33,51,52。
  6. 打开振镜和载物台。启动采集软件，并输入所需的成像参数。
    注意：本研究使用512 × 512像素，像素驻留时间为13.65 µs，成像视野为360 × 360 µm2。以0.333 Hz采集5帧图像，并平均为一帧高质量图像。
  7. 使用与步骤2.5中相同的物镜浸没介质，将样品放置在载物台上。
  8. 关闭室内灯光并拉上窗帘。
    注意：为避免损坏探测器，切勿在探测器开启或探测器快门打开时打开室内灯光。
  9. 开启探测器电源和放大器。
  10. 关闭围绕载物台的光屏蔽箱。
  11. 使用电子控制开关手动打开探测器快门（S3、S4、S5、S6）。
  12. 在显微镜采集软件中，点击点击以开始采集，开始收集SLAM图像。通过旋转显微镜载物台控制器上的旋钮（材料表），调节显微镜焦距，直至样品清晰对焦。
    注意：玻璃盖玻片会产生强烈的三次谐波（THG）信号，可利用显微镜载物台控制器上显示的载物台位置，精确定位成像深度。例如，本研究中所有溶液标准品的图像均在盖玻片上方20 µm的焦平面上采集。
  13. 使用显微镜载物台控制器上的操纵杆，在样品中定位所需的视野，然后点击停止并重置。
    注意：如果图像饱和，请返回步骤4.5，降低激光功率。如果图像信噪比低于10，可谨慎增加激光功率。
  14. 在保存选项卡下，点击保存数据，将其切换为是，然后点击点击以开始采集。等待采集完成后再继续操作。
  15. 在成像过程中如需更换或操作样品，请关闭探测器快门，并使用手电筒或头灯提供照明。样品修改完成后，返回步骤4.10。
    注意：为确保可重复性和定量分析，应采集FAD和NADH溶液标准品的SLAM图像。确保视野、图像尺寸和激发功率与生物样品所用条件一致。
  16. 结束SLAM图像采集时，先关闭探测器快门，关闭探测器，然后再打开室内灯光。
  17. 使用快门1阻断激光，然后关闭激光器。
  18. 关闭振镜和载物台。关闭显微镜采集软件。
  19. 妥善处理组织样本，并清洁工作区域。

5. 数据可视化

注意：以下图像分析可在图像分析软件（如 ImageJ53（材料表））或具备图像分析功能的编程语言（如 Python 或 MATLAB）中进行。以下步骤描述了如何使用 ImageJ 进行数据可视化。

  1. 确保每个通道的图像均为无损图像格式（例如 TIFF 或 PNG）。
    注意：本研究中使用的自定义显微镜控制软件会自动将图像保存为 TIFF 格式。要将图像另存为 TIFF 格式，请在 ImageJ 中打开图像，然后选择 文件 > 另存为 > Tiff。
  2. 为生成照明标准图像，请分别在 ImageJ 中打开 FAD 溶液和 NAD(P)H 溶液的 FAD 通道和 NAD(P)H 通道图像。对每幅图像，选择 处理 > 滤波器 > 高斯模糊…，将 标准差（半径） 设置为 41，然后点击 确定。
    注意：可根据需要调整高斯滤波器的 标准差（半径），以充分平滑图像。
  3. 为同时校正不均匀照明并归一化荧光强度，请打开样品的 FAD 和 NAD(P)H 通道图像。对每幅图像，选择 处理 > 图像计算器…，在 图像1 中选择样品图像，在 操作 中选择 除法，在 图像2 中选择与样品图像通道对应的照明标准图像，然后点击 确定。
    注意：此步骤对于校正系统变异性以及保持自体荧光定量评估（如光学氧化还原比，ORR）的一致性至关重要。
  4. 若采集多幅图像以形成更大的视野或 z 轴堆栈，请将这些图像拼接或合并为单幅图像或图像堆栈。
  5. 为生成 ORR 图像，首先对 FAD 和 NAD(P)H 图像求和。选择 处理 > 图像计算器…，在 图像1 和 图像2 中分别选择 FAD 和 NAD(P)H 通道图像，在 操作 中选择 加法，然后点击 确定。为计算 ORR 图像，再次选择 处理 > 图像计算器…，在 图像1 中选择 FAD 通道图像，在 操作 中选择 除法，在 图像2 中选择 FAD 与 NAD(P)H 图像之和的结果，然后点击 确定。
  6. 为 ORR 图像应用伪彩，选择 图像 > 颜色 > 编辑查找表…，点击 打开，选择所需的查找表（.lut）文件，然后点击 确定。选择 图像 > 调整 > 亮度/对比度，并根据需要调整对比度。
    注意：建议使用等亮度伪彩，例如本研究中使用的（反转的）CET-I254,55 伪彩。在 ImageJ 中将伪彩应用于图像后，若需反转伪彩，请选择 图像 > 颜色 > 反转查找表。
  7. 为提高 ORR 图像中特征的清晰度，可根据荧光通道的强度对亮度进行缩放。首先，选择 FAD 与 NAD(P)H 图像之和的结果，然后选择 处理 > 增强对比度…，确保勾选 归一化，然后点击 确定。选择 编辑 > 复制，将此结果复制到剪贴板。接着，选择 ORR 图像，选择 图像 > 类型 > RGB 颜色，然后选择 图像 > 类型 > HSB（32 位）。将图像底部的滑块完全移至右侧以查看 亮度 通道，选择 编辑 > 粘贴，然后选择 图像 > 类型 > RGB 颜色。
  8. 为将 SLAM 图像以复合图像形式可视化，请在 ImageJ 中打开四个 SLAM 通道，然后选择：图像 > 颜色 > 合并通道…。在 C2（绿色） 中选择 SHG 通道图像，在 C5（青色） 中选择 NAD(P)H 通道图像，在 C6（品红色） 中选择 THG 通道图像，在 C7（黄色） 中选择 FAD 通道图像。确保勾选 创建复合图像，然后点击 确定。

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结果

SLAM显微镜的复杂多通道、多模态方法（图1）可能使新用户在排查问题和理解结果时感到困难。首先，切割良好的光子晶体光纤（PCF）应具有一个干净的端面（图2C），其表面平整且与PCF的长度方向垂直（图2A）。倾斜或崩边的切割面（图2B）以及表面存在划痕（图2E）表明切割质量较差。如图2D所示，PCF表面存在污垢或碎屑，表明切割不良或切割后对PCF操作不当。最重要的是，在成功的切割中，PCF的纤芯（即被空气孔蜂窝状结构包围的中央小区域）应无任何碎屑或划痕。尽管如此，在PCF表面观察到少量划痕和少许碎屑是正常现象，尤其是在PCF的外层包层上（图2C），此类PCF通常仍可使用。随着PCF使用寿命的延长，其会逐渐受损，耦合效率将下降，...

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讨论

产生合适的超连续谱对于成功的SLAM成像至关重要，但由于光子晶体光纤（PCF）的搭建较为复杂，这一过程可能具有挑战性。确保PCF的精确切割和小心操作对于维持表面清洁、避免碎屑、污垢或划痕至关重要，因为这些因素均可能干扰有效耦合、超连续谱的生成，甚至缩短PCF的使用寿命。由于PCF需要定期更换，练习光纤切割并精细调整切割设备参数有助于实现最佳切割效果。此外，PCF的精确对准以及每次使用前的定期重新对准对于生成所需超连续谱至关重要。对准不当还可能导致PCF损坏。由于PCF产生的超连续谱是SLAM显微技术中的关键环节，因此PCF纤芯尺寸和长度的选择是一个重要考虑因素。较长的PCF可产生更宽的超连续谱，但可能会降低输出功率、增加色散、使安装更复杂，并提高更换成本。较小纤芯尺寸的PCF也可产生更宽的超连续谱，但与较大纤芯直径的PCF相比，其寿命通常更短，损伤阈值也更低57。所描述的SLAM显微方法的一个局限性在于PCF质量的不一致性、其对对准的敏感性以及随时间推移性能的下降。此外，更换PCF所需的成本和时间也是重要因素。因此，研究人员正在探索用于SLAM显微技术的其他超连续谱光源

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究所用设备的部分资金由葛兰素史克（GSK）通过贝克曼先进科学与技术研究所的光学分子成像中心提供。本工作还部分得到了美国国立卫生研究院下属国家生物医学成像与生物工程研究所（NIH/NIBIB）无标记成像与多尺度生物光子学中心（CLIMB）（P41EB031772）以及美国国家科学基金会科学与技术中心——定量细胞生物学中心的资助。K.K.D.T. 受美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS）毒理学与环境健康研究培训项目（5T32ES007326-25）支持；A.D.C. 受贝克曼先进科学与技术研究所博士后研究员项目支持；A.H. 受国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）组织微环境培训项目（T32EB019944）支持。作者感谢 Darold Spillman 对实验室空间、设备和技术的管理，同时感谢 Janet E. Sorrells 博士和 Rishyashring R. Iyer 博士在本研究中所使用的SLAM显微镜系统早期开发中的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
三轴位移台ThorLabsMAX316已停产。
35 mm 玻璃底成像培养皿MatTekP35G-0-14-C未包被 #0 盖玻片。
DMEMGibco21063029高糖，含 HEPES，不含酚红。
内皮细胞生长培养基添加剂PromoCellC-39210省略胎牛血清。
FemtoTrain 飞秒激光器Spectra-Physics1040-5平均功率：>5.0 W，脉冲能量：>500 nJ，波长：1040 nm ±8 nm，重复频率：10 MHz，脉冲宽度（FWHM）：<220 fs。
胎牛血清CytivaSH30071.03HyClone 优质级。
光纤剥线钳ThorLabsT10S13
黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物Sigma-AldrichF6625
振镜扫描镜Cambridge Technology6215H已停产。
玻璃加工工作站VytranGPX3800
ImageJ威斯康星大学麦迪逊分校 Eliceiri 实验室版本 2.16.0FIJI 发行版。
Kimwipe 擦镜纸Kimberly-Clark Professional34120
L-谷氨酰胺CytivaSH30034.01
显微镜载物台Applied Scientific InstrumentationFTP-2050
显微镜载物台控制器Applied Scientific InstrumentationMS-2000-500-UDSW
显微自相关仪Angewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
物镜OlympusXLPLN25XWMP2水浸式，25倍放大，数值孔径 1.05。
光功率计Newport919P-003-10600 - 1700 nm。
光谱分析仪ThorLabsOSA202C
光子晶体光纤NKT PhotonicsLMA-PM-15 NKT大模场面积，保偏光纤。纤芯直径：15 µm。
高精度光纤切割器FujikuraCT-101
脉冲整形器Biophotonics Solutions Inc.FemtoJock-D已停产。
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型二钠盐水合物Sigma-Aldrich10128023001

参考文献

  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

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