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方法文章

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

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DOI：

10.3791/68642

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2025年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过将稳定的zpc:cas9基因敲入品系与Tol2介导的sgRNA表达盒递送相结合，以产生母源突变体的实验方案。

摘要

卵子发生及早期胚胎发育严重依赖于母源性mRNA和蛋白质。要消除这些母源因子，通常需要在雌性斑马鱼中引入纯合突变，但这往往导致致死或不育的表型，从而无法获得母源突变的胚胎。我们之前的研究提出了一种通过卵母细胞特异性基因组编辑来绕过合子致死性的快速方法。然而，先前报道的cas9转基因存在不稳定性，并在连续世代中逐渐发生沉默。此外，该品系中zpc:cas9表达盒两侧存在Tol2转座子元件，限制了利用Tol2系统进一步进行sgRNA转基因操作的可能性，而Tol2系统目前仍是斑马鱼中最高效的转基因系统。因此，迫切需要一种不含Tol2元件的斑马鱼品系，以实现稳定且高效的卵母细胞特异性Cas9表达。本文中，我们报道了一种将zpccas9敲入至rbm24a基因位点的品系，满足了这一需求。利用这一改进的工具，我们建立了一个技术流程，可在斑马鱼模型中快速生成具有合子致死突变表型基因的母源突变体。

引言

脊椎动物早期胚胎发育在很大程度上依赖于卵细胞内储存的RNA和蛋白质，这些物质统称为母源因子。这些母源产物主要在减数第一次分裂的双线期合成1,2,3。为了研究其功能作用，必须获得纯合突变的雌性个体，因为只有卵母细胞中的纯合突变才能完全耗尽这些母源因子。然而，当合子期的纯合突变导致个体致死或不育时，获得此类纯合突变雌性个体就变得极为困难4,5。这为解析由致死或不育基因编码的母源产物功能带来了重大障碍。为克服这一技术瓶颈，已发展出多种创新方法6,7,8。然而，这些技术通常存在实验周期过长或技术难度较大的问题。

在我们之前的研究中，我们还开发了一种条件性基因敲除策略，可在单一代次内产生母源性突变体9,10。该系统包含两个关键组分：Tg(zpczcas9) 转基因斑马鱼和一个携带3-4个sgRNA表达盒的I-SceI转基因质粒系统。利用该系统，我们已成功实现了卵母细胞中母源因子的条件性基因敲除9,10，但仍存在改进空间。首先，先前报道的Tg(zpczcas9) 转基因品系在维持Cas9转基因表达方面的基因组编辑效率并不稳定。此外，由于该转基因品系是利用Tol2转座子系统构建的，因此无法再使用Tol2转座子将sgRNA表达盒整合到基因组中；而必须采用I-SceI介导的转基因技术。然而，该方法的效率低于Tol2系统，且更容易发生跨代表观沉默。

为了克服这些局限性，我们致力于建立一种敲入品系，以实现卵母细胞特异性的Cas9高效且稳定的表达。该品系可利用Tol2转座子系统，在斑马鱼中高效递送sgRNA表达质粒。通过采用基于内含子的基因组编辑策略11，我们成功构建了在rbm24a基因最后一个内含子中整合的zpccas9敲入品系（图1A，B）。我们选择该位点作为母源性转基因表达的候选基因组安全港，主要基于两项独立的观察结果：1）无害整合：在我们近期的研究12中，该位点携带外源DNA的纯合敲入鱼仍保持完全的存活能力和生育力；2）高效表达：当在同一位置插入zpccas9表达盒时，Cas9呈现高水平表达，并在多代间持续实现高效的基因组编辑（图1C）。Rbm24a作为一种核心生殖质成分，是一种RNA结合蛋白，可与Buc协同作用，将生殖质RNA整合至生殖颗粒中。因此，母源性Rbm24a缺失将导致原始生殖细胞（PGCs）完全缺失12。在此，我们以近期工作中靶向rbm24a基因为例，提供了一套改进的视频实验方案，用于生成和鉴定在合子致死基因中的母源性突变体。

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方案

实验按照 ARRIVE 指南进行，并经山东大学实验动物护理机构委员会伦理批准（批准号：SYDWLL-2021-15）。本方案的概览见图2。

1. 生成 rbm24a-RFP zpc:cas9 基因敲入品系

  1. sgRNA敲入筛选
    1. 筛选并合成敲入型sgRNA候选序列
      1. 提交最后一个内含子的序列 rbm24a 使用 CRISPRscan（http://www.crisprscan.org）鉴定最佳的 sgRNA 候选序列，这些序列应具有较高的 CRISPRscan 评分（表明靶向效率高）和较低的 CFD 评分（反映脱靶效应低）。合成每条 sgRNA 的长寡核苷酸（sgRNA 寡核苷酸）。
        注意：CRISPRscan 生成的 sgRNA 寡核苷酸包含必要的功能元件，包括 T7 启动子序列、20 个核苷酸的 sgRNA 靶向序列以及 16 个核苷酸的 sgRNA 骨架序列。此处，我们选择的 sgRNA 序列为：5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′（T7 启动子为小写，20 个核苷酸的向导序列为大写，部分支架序列为小写）。
      2. 为了获得用于sgRNA合成的DNA模板，准备50 µL的填平PCR反应体系：2x Taq混合酶25 µL；sgRNA 引物（10 µM）2 µL；通用引物（10 µM）2 µL；去离子H221 µL。
        注意：所有引物的序列均显示在下文中 材料表.
      3. 充分混匀后，将反应混合物转移至预先设定程序的热循环仪中，按照以下循环参数启动扩增程序：94 °C 预变性 3 min，共1个循环；随后进行35个循环（94 °C 变性 15 s，50 °C 退火 15 s，72 °C 延伸 30 s）；最后72 °C 延伸 5 min，共1个循环。
      4. 在1.5 mL微量离心管中配制sgRNA合成反应体系；按以下顺序在室温下依次加入各组分：11 µL去离子水、2 µL ATP/GTP/CTP/UTP（各10 mM）、10 µL PCR产物、4 µL 10× RNA聚合酶反应缓冲液、2 µL T7 RNA聚合酶和1 µL RNase抑制剂。总体积为40 µL。轻轻弹击混匀，短暂离心。
      5. 37 °C孵育1.5小时。加入1 µL DNase I，轻弹混匀，短暂离心。37 °C孵育15分钟，以确保完全去除DNA模板。
      6. 加入5 µL二氧化硅磁珠，随后加入120 µL（4倍体积）RNA结合缓冲液（含1 M Gu-HCl 9.55 g、0.05% Tween-20、乙醇100 mL）。用移液器充分混匀。在室温下，于1,500 rpm的恒温混匀仪中孵育10分钟。
      7. 将试管置于磁力架上，使用移液器或真空系统小心移除上清液。
      8. 加入400 µL 90%乙醇，涡旋振荡以重悬磁珠。将离心管置于磁力架上，弃去上清液。
      9. 重复乙醇洗涤步骤，共完成两次洗涤循环。
      10. 去除残留上清液，将离心管敞口置于50 °C加热块上晾干10分钟。
      11. 加入15 µL无核酸酶水，在室温下以1,500 rpm转速于恒温混匀仪中孵育5分钟。
      12. 将试管置于磁力架上，将洗脱液转移至新的微量离心管中。
      13. 通过琼脂糖凝胶电泳确认98 bp的sgRNA条带。使用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳定量RNA浓度，明确标记后于-20 °C保存。
    2. 测试sgRNA效率
      1. 为确定sgRNA的实际效率，制备用于显微注射的核糖核蛋白（RNP）复合物。在冰上用移液器将1 µL的每种sgRNA（终浓度50 ng/µL）与1 µL Cas9蛋白（终浓度100 ng/µL）混合。通过显微注射将2 nL RNP复合物注入每个单细胞期胚胎中。
      2. 受精后24小时（hpf），将每组注射了Cas9核糖核蛋白（RNP）的10个胚胎收集至1.5 mL微量离心管中，小心去除多余培养基。加入100 µL 50 mM NaOH（每个胚胎10 µL），置于加热块或PCR仪中在95 °C孵育15分钟。通过加入10 µL 1 M Tris-HCl（pH 7.0）中和裂解液。
      3. 将中和后的胚胎裂解液直接用作PCR扩增的模板。设计引物以扩增包含靶位点及两侧各不少于100 bp侧翼序列的片段。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，必要时使用凝胶回收试剂盒进行纯化。对扩增产物进行Sanger测序。
      4. CRISPR编辑效率定量：使用ICE（CRISPR编辑推断）分析工具（https://ice.synthego.com/#/）分析测序色谱图。根据该网站推荐的方案，以未注射对照样本为基准进行编辑效率归一化。
  2. 敲入用供体质粒的构建
    1. 采用已建立的TEDA（T5核酸外切酶DNA组装）方法进行连接反应13.
    2. 采用三片段Gibson组装策略构建 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 敲入供体质粒。第一个片段包含一个1,704 bp的5'同源臂，涵盖紧邻基因组目标位点上游的区域 rbm24a 终止密码子。第二个是GFP编码序列。第三个包含位于下游的2,274 bp的3'同源臂 rbm24a 终止密码子，后接 zpccas9 位于3'方向远端的表达盒 rbm24a 3'-非翻译区
    3. 使用Gibson组装法将三个片段连接至pBluescript SK-载体的ApaI位点。
    4. 通过限制性酶切和Sanger测序验证最终质粒。
  3. 显微注射及早期整合胚胎的筛选
    1. 制备含有12 pg的注射混合物 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 敲入供体质粒、200 pg sgRNA 和 600 ng 无核酸酶水中的重组 Cas9 蛋白。使用标准显微注射技术将 1–2 nL 混合物注入单细胞期胚胎的胚盘中。在 30 hpf 时，筛选 RFP 表达模式与内源性表达模式相似的胚胎 rbm24a，表明供体质粒在卵裂期即已整合。选择在晶状体、心脏、骨骼肌和内耳毛细胞中显示RFP信号的早期整合胚胎用于繁育。图3A，B).
      注意：在注射前通过苯酚-氯仿抽提法纯化质粒，以消除质粒制备过程中引入的任何残留RNase。
    2. 分析母源性 Rbm24a-RFP 在 F1 代胚胎中的表达模式，这些胚胎来源于 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 杂交（图 4A，B).
  4. Cas9蛋白表达及编辑效率的评估
    1. 为评估Cas9编辑效率，显微注射200 pg bmp2b 将sgRNA注入单细胞期胚胎 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 胚胎（图1C，D).
    2. 为评估Cas9编辑的稳定性，定量分析表现出背化表型的胚胎数量，并进行Sanger测序分析以评估编辑效率图5A- D).
      注意：尽管我们在连续三代中均未检测到Cas9表达量的下降，但仍建议在该基因敲入品系的每一代中验证编辑效率。

2. 在 rbm24a-RFP KI zpc cas9 品系中进行 sgRNA 转基因

  1. 选择并合成用于 rbm24a 基因敲除的 sgRNA。
    1. 按照步骤 1.1.1 中所述方法选择并合成 sgRNA 候选序列。
      注意：必须选择靶向编码区前半部分的 sgRNA，以确保实现高效的基因功能缺失。此外，若在 C 末端区域已鉴定出关键蛋白结构域，则靶向编码序列 3' 端的 sgRNA 也可接受。CRISPRscan 可生成包含必需功能元件的 sgRNA 寡核苷酸，这些元件包括 T7 启动子序列、20 个核苷酸的 sgRNA 靶序列以及 16 个核苷酸的 sgRNA 骨架序列。为实现有效的母源基因敲除，建议设计 6–8 个候选 sgRNA，以可靠地筛选出 3–4 个高效 sgRNA。详细实验方案可参考先前发表的论文9。
    2. 按照步骤 1.1.2 中所述方法，在早期斑马鱼胚胎中检测 sgRNA 的编辑效率。
      注意：优先选择编辑效率超过 50% 的 sgRNA。
  2. 构建表达 sgRNA 的转基因质粒
    注意：为最大化编辑效率，建议使用四个不同的、无重叠的 sgRNA，每个 sgRNA 之间至少间隔 36 bp。这些 sgRNA 将分别连接至 pU6x:sgRNA 载体（pU6x:sgRNA #1、#2、#3、#4），每个载体均含有独特的 U6 启动子及 3' 端骨架序列14。随后，这四个含有 sgRNA 表达盒的 U6 载体通过 Golden Gate 连接组装至 pGGDestISceIEB-4sgRNA 目的载体中。
    pU6x:sgRNA 载体应按顺序选择。例如，若克隆三个 sgRNA，则使用载体 #1 至 #3；若克隆四个 sgRNA，则使用载体 #1 至 #4。
    1. 将 sgRNA 靶序列亚克隆至 pU6x:sgRNA 载体
      1. 根据所选 sgRNA 的序列，合成退火引物：正向引物：TTCGN(19)；反向引物：AAAC[N(19)]*。其中 GN(19) 为 sgRNA 的 20 个核苷酸靶序列，[N(19)]* 表示 sgRNA 靶序列 3' 端 19 个核苷酸的反向互补序列。
      2. 为进行引物退火，配制如下混合液：1 µL 正向引物（100 µM）、1 µL 反向引物（100 µM）、2 µL 10x 缓冲液，以及 16 µL 去离子 H2O，总体积为 20 µL。充分混匀。
        注意：所有引物序列均列于材料表中。
      3. 将混合液置于热循环仪中，运行如下程序：95 °C 15 分钟，1 个循环；然后以 0.1 °C/s 的受控降温速率逐渐冷却至 50 °C，并在此温度维持 10 分钟；最后在 4 °C 保持 10 分钟。
      4. 配制用于将退火后的 sgRNA 靶序列克隆至 pU6x-sgRNA 载体的反应体系：1 µL 10x 限制性内切酶缓冲液、1 µL 10x T4 连接酶缓冲液、0.3 µL T4 连接酶、0.3 µL BsmBI、0.2 µL PstI、0.2 µL SalI、1 µL 退火后的 sgRNA 引物、5 µL pU6x:sgRNA#x（20 ng/µL），以及 1 µL 去离子 H2O，调整终体积至 10 µL。
      5. 充分混匀反应组分，并运行以下热循环程序：6 个循环（37 °C 20 分钟，16 °C 15 分钟），随后 37 °C 10 分钟 1 个循环，55 °C 15 分钟 1 个循环，80 °C 15 分钟 1 个循环。
      6. 转化时，将 DH5α 感受态细胞置于冰上解冻，轻轻混匀 50 µL 细胞与连接产物，冰上孵育 30 分钟。42 °C 热激 60 秒后立即放回冰上 2 分钟。将转化后的细胞涂布于含 100 µg/mL 链霉素的 LB 平板上，倒置于 37 °C 培养至少 16 小时，以促进菌落形成。
      7. 进行菌落 PCR 时，用移液枪头挑取单个细菌菌落并转移至 10 µL 去离子 H2O 中。通过反复吹打充分重悬菌落，确保其完全分散，以便进行后续 PCR 分析。PCR 反应体系配制如下：5 µL 2x Taq Mix、2 µL 菌落悬液、M13 正向引物（10 µM）和反向引物（10 µM）各 0.4 µL，以及 2.2 µL 去离子 H2O，总体积为 10 µL。
      8. 运行如下程序：94 °C 3 分钟 1 个循环，23 个循环（94 °C 15 秒，55 °C 15 秒，72 °C 30 秒），72 °C 5 分钟 1 个循环。
      9. 对 PCR 产物进行电泳分析。选择大小约为 482 bp 的阳性菌落（图 6）。
      10. 将剩余菌落悬液接种至 3 mL 含 100 µg/mL 链霉素的 LB 培养基中，37 °C、200 rpm 振荡培养 14 小时。
      11. 根据制造商说明书，使用质粒小提试剂盒从细菌培养物中提取质粒，并用微量分光光度计测定质粒浓度。
      12. 使用 M13 正向引物对提取的质粒进行 Sanger 测序。将测序结果与预期的 U6 载体图谱比对，验证 sgRNA 靶序列是否正确插入。
    2. 构建 pGGDestEB-4sgRNA 载体
      注意：如图 7所示，可通过 Golden Gate 组装技术将四个由 U6 启动子驱动的 sgRNA 表达盒高效连接至 pGGDestEB-4sgRNA 骨架载体中。需连接的 sgRNA 数量决定了所用载体的选择。例如，当组装四个 sgRNA 表达盒时，应使用 pU6a:sgRNA#1、pU6a:sgRNA#2、pU6b:sgRNA#3、pU6c:sgRNA#4 以及 pGGDestEB-4sgRNA。
      1. 配制 20 µL Golden Gate 反应体系，包含：2 µL 10× 限制性内切酶缓冲液、2 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液、每种 pU6x:sgRNA#x 构建体各 100 ng、pGGDestIEB-4sgRNA 目的载体 50 ng、1 µL BsaI、1 µL T4 DNA 连接酶，以及去离子水补足至终体积 20 µL。
      2. 运行 Golden Gate 组装反应：37 °C 20 分钟、16 °C 15 分钟，重复 3 个循环，最后 80 °C 孵育 15 分钟以灭活酶活性。
      3. 转化时，取 5 µL 反应产物加入感受态细胞中，并涂布于含氨苄青霉素的 LB 培养基平板上。
      4. 通过菌落 PCR 使用 Dest 正向和反向引物（见材料表）筛选菌落，确认插入片段的存在（图 8）。
        注意：阳性克隆应出现大小为 2,415 bp 的主条带及梯状条带模式。
      5. 从阳性菌落中提取质粒，并使用 Dest 正向和反向引物对每个 sgRNA 靶序列进行测序。
      6. 将 Sanger 测序结果与预测的载体序列比对，进行验证。
  3. 转基因 founder 的显微注射与预筛选
    1. 收集由纯合 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 鱼产生的胚胎。
    2. 配制注射混合液：将 1 µL pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA（12 ng/µL）与 1 µL Tol2 转座酶 mRNA（50 ng/µL）混合。
      注意：注射前需使用苯酚-氯仿抽提法纯化质粒，以去除质粒提取过程中可能残留的 RNase。质粒和 Tol2 mRNA 直接用纯水稀释。
    3. 将玻璃盖玻片放入 15 cm 培养皿中。将胚胎沿盖玻片边缘排列，并用移液器小心吸除多余水分。向每个 1 细胞期胚胎的胚盘中注射 2 nL 混合液。注射完成后，用亚甲蓝工作液（蓝水）轻轻冲洗胚胎，并转移至新的培养皿中。最后将培养皿置于 28 °C 培养箱中培养。
      注意：亚甲蓝工作液（蓝水）配制方法如下：将 180 g 海盐溶于 2.7 L 蒸馏水中，灭菌后制成 100x 海水储备液。将该储备液用无菌蒸馏水稀释 200 倍，得到 1/100x 海水。向 1 L 该 1/100x 海水中加入 10 µL 5%（m/v）亚甲蓝储备液，即得最终工作液。
    4. 在 24 hpf 时，选择表现出强而广泛 BFP 表达的胚胎。在 4 dpf 时，仅保留维持强烈转基因荧光信号的个体（图 9）。

3. 双转基因胚胎的鉴定

  1. 双转基因胚胎表型分析
    1. 将嵌合型转基因创始人雌性个体与野生型雄性个体交配，收集其产生的胚胎。
    2. 挑取BFP阳性（BFP+在荧光体视显微镜下观察单细胞阶段的胚胎。
    3. 识别BFP中出现的发育缺陷+ 胚胎中存在，但在BFP中不存在- 胚胎
    4. 在4%多聚甲醛（PFA）中于4 °C过夜固定胚胎。进行整体装片 原位 必要时可进行杂交、免疫荧光染色或其他组织学分析。
      注意：仅在表达 sgRNA 的 GFP 或 BFP 阳性胚胎中出现的缺陷表型才可靠。应谨慎得出结论，且母源突变表型必须有超过 10 个案例予以证实。
  2. 母体突变胚胎的基因分型
    注意：用于鉴定 Mrbm24a 胚胎可通过荧光显微镜下缺乏 Rbm24a-RFP 信号而被轻松识别。相比之下，鉴定其他基因的母源突变体主要依赖于在合子基因组激活前进行细胞吸出操作，随后对所收集细胞中的母源 mRNA 进行 RT-PCR 分析。图10).
    1. 细胞吸吮
      1. 通过将琼脂糖溶解于1/3倍浓度的林格氏缓冲液中并加热至完全融化，配制1.5%的琼脂糖溶液。将溶液倒入直径90 mm的培养皿中，并将模具（WPI，z-molds）插入熔融的琼脂糖中。待其凝固后，轻轻取出模具，即可得到可直接使用的培养板。
      2. 使用玻璃毛细管和拉针仪制备熔封针头。为获得最佳细胞吸取针头，将两个轻质砝码和加热功率设置为一级：60，二级：90，并选择Step2程序。用尖头镊子修剪毛细管尖端（参见 材料表）以获得30-40 µm的开口直径。随后使用显微操作仪在针尖处制备一个尖刺，以利于穿刺并最小化对胚胎的损伤。
      3. 将推测为雌性的 founder 鱼与野生型斑马鱼交配并收集胚胎。在单细胞阶段筛选出 BFP 阳性胚胎。
      4. 在3 hpf时，将胚胎置于含1 mg/mL蛋白酶的1/3倍Ringer缓冲液中孵育10分钟，并轻轻吹打去壳，随后将胚胎小心转移至加有含1倍青霉素-链霉素的1/3倍Ringer缓冲液的琼脂糖板上。调整胚胎方向，使卵裂球朝向毛细管尖端。
        注意：转移胚胎时必须格外小心，因为失去绒毛膜的保护后胚胎极为脆弱。切勿让胚胎接触培养基表面！
      5. 使用显微注射仪，通过精细降低平衡压力以减弱毛细作用产生的吸力，从每个胚胎中吸取20-40个细胞15将这些细胞释放到2 µL去离子水中2通过提高平衡压力来防止PCR管开口边缘出现冷凝水。
        注意：为避免交叉污染，应通过吸液和喷出去离子水来清洗玻璃针头2每次吸液前冲洗3次。
      6. 加入200 µL RNA提取试剂以冲洗细胞，并将离心管暂时置于冰上保存。随后，分析来自有或无发育缺陷胚胎的细胞基因型。
        注意：保存在提取试剂中的细胞可置于 -20 °C 保存，直至相应的胚胎表现出异常表型。
      7. 将吸出细胞后的胚胎保留在琼脂糖平板中，或将其单独放入已加入含1倍青霉素-链霉素的1/3倍Ringer's溶液的24孔板中。
        注意：转移去壳胚胎时应格外小心！通常，我们在一次实验中检测 20–40 个胚胎，耗时约 1 小时。
    2. 吸出细胞中目标母源mRNA的分析
      1. 向提取试剂中的细胞加入 40 µL 氯仿，轻轻混匀。将混合物在 12,000 × g 4 °C下持续1分钟。
      2. 小心收集上清液。加入1 µL糖原溶液（20 mg/mL）和等体积的异丙醇（若上清液体积为100 µL，则加入100 µL异丙醇），充分混匀。将混合物于-20 °C孵育30分钟，以促进沉淀。
        注意：由于抽吸细胞中的总RNA量较少，必须加入糖原以提高沉淀效率，并便于观察沉淀物。
      3. 将样品在 12,000 × g 4 °C 下离心 10 分钟，弃去上清液。
      4. 用500 mL 70%乙醇重悬沉淀，离心（12,000 × g）洗涤2次 g 1 分钟。
      5. 弃去液体，打开管盖，室温下晾干沉淀5分钟。
      6. 加入7 µL水以溶解沉淀。使用First-strand cDNA合成试剂盒进行逆转录，具体操作步骤详见说明书中的详细方案。
      7. 使用适当的引物扩增整个编码区（参见 材料表）并进行琼脂糖凝胶电泳。
      8. 将PCR产物克隆，并对每个胚胎至少测序30个克隆，以分析mRNA中出现的突变。
        ​注意：为了确认缺陷表型是由目标母源因子的靶向突变引起的，需对所有胚胎（n > 5）具有缺陷表型的个体应显示野生型母源转录本的缺失。相反，所有正常发育的表达sgRNA的胚胎中均应存在野生型母源mRNA（n > 5). 同时，在sgRNA阴性胚胎中仅能检测到野生型mRNA（n > 5).

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结果

快速生成 rbm24a 母本突变体
我们构建了一种转基因载体，可表达一种母源性BFP标记物和四个高效靶向的sgRNA rbm24a 编码序列。将该载体导入纯合子后 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 通过 Tol2 转座获得胚胎，Mrbm24a 在BFP阳性的F1胚胎中，由于缺乏Rbm24a-RFP蛋白，可轻松且快速地被识别出来（图11A- D。大约30%–70%的BFP阳性胚胎缺乏RFP信号。这些Mrbm24a 胚胎在24 hpf时表现出生殖质mRNA无法招募至生殖粒以及缺乏原始生殖细胞，如图所示 原位 使用杂交技术 nanos3 探针图11E- H）。这些 Mr...

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讨论

致死性合子突变会阻碍对基因母源效应的分析。替代策略中，最显著的是生殖系替代和原位卵母细胞显微注射（Oocyte Microinjection In Situ, OMIS），但这些方法技术难度较高6,8。在生殖系替代的细胞移植过程中，受体胚胎接收到的原始生殖细胞（PGCs）数量极少，常常导致雌性无法正常发育16,17,18。使用诱导性原始生殖细胞（iPGCs）进行生殖系替代改善有限：由iPGCs分化而来的生殖细胞数量显著减少，且导致所有iPGC移植嵌合体均为雄性19。这些局限性使得生殖系替代策略难以成为研究斑马鱼母源效应基因功能的常规工具。因此，该领域迫切需要一种简单、高效的卵母细胞特异性条件性基因敲除方法。

本文提供了一种改进的卵母细...

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披露

本方案已获得中国国家知识产权局授予的专利，经作者许可后可解除该方法的使用限制。作者声明不存在其他竞争性或经济利益。

致谢

感谢中国山东大学生命科学学院核心设施与服务平台的Jianlin Shen、Yiteng Xu和Qingqing Wei。本工作得到国家自然科学基金（项目编号32170816、32370860、32450630和31871451）、山东大学杰出中青年学者支持计划以及山东省泰山学者计划的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2x M5 HiPer Taq PCR 混合液Mei5bio货号#MF001-BD-100
琼脂糖MDbio货号 A006L
AxyPrep 质粒小提试剂盒Axygen货号#AP-MN-P-4
毛细管电泳仪（Qsep400）双光路系统N/A
DIG标记混合液罗氏货号#11277073910
DNase I罗氏货号#4716728001
DTT赛默飞世尔科技货号 R0861
第一链cDNA合成试剂盒TransGen Biotech货号#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS 核酸酶GenScript货号#Z03389
玻璃毛细管（1.0 × 100 mm）Rantai 教学设备厂货号#OS-2B
糖原BBI生命科学货号#28985
GraphPad Prism 9GraphPadhttps://www.graphpad.com/
ImageJ开源https://imagej.net/software/fiji/
低熔点琼脂糖生物技术货号#CA1351
显微操作仪（MF2）NARISHIGEN/A
显微分光光度计（Nano-300）ALLSHENGN/A
OlyVIAOLYMPUSN/A
青霉素-链霉素Gibco货号#15140122
皮升注射仪（PLI-100A） 哈佛仪器公司N/A
尖头镊子WPI货号#500341
尖头镊子 WPI 500341
拉力仪（PC-100）NARISHIGEN/A
RiboLock RNase抑制剂赛默飞世尔科技货号#EO0381
rNTP赛默飞世尔科技货号 R0481
硅羟基磁珠Sangon Biotech货号 B518720-0001
T7 RNA聚合酶NEB货号#M0251L
ZoldWPI货号# z-molds

参考文献

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

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斑马鱼基因组编辑卵母细胞特异性敲除无Tol2斑马鱼母源因子删除胚胎显微注射细胞吸出荧光蛋白标记逆转录PCR
利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体
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