一种用于新生小鼠持续气道正压通气的动物模型及精确肺切片法测量气道收缩力的方法

摘要

我们展示了一种非侵入性方法，可向未麻醉的新生小鼠输送不同水平的持续气道正压通气（CPAP）。该技术旨在部分模拟为许多早产儿实施的CPAP治疗，以评估其对肺发育的影响。我们还利用精密肺切片方法，展示了CPAP对气道收缩性的影响。

摘要

与重症监护中早产儿使用的正压呼吸支持相关的机械力可能对肺部发育产生有益和意外的不利影响。正压支持可改善肺部气体交换，减少肺不张，并提高全身氧合水平，但侵入性通气方式（如机械通气）对肺发育的损伤作用也已广为人知。然而，目前对于较温和的通气方式可能带来的不良影响，我们的理解仍存在重大空白。其中，持续气道正压（CPAP）是最常见的呼吸支持方式之一，属于正压通气中侵入性最小的形式。研究人类气道发育的一大局限在于缺乏与年龄匹配的模型，以及难以对新生小型动物实施CPAP。我们通过建立一种对清醒、未麻醉的新生小鼠每日施加CPAP的小鼠模型解决了这一问题——该模型在小鼠肺发育阶段对应于早产儿在重症监护室接受CPAP治疗的时期，并采用临床上相关的CPAP压力水平。本文中，我们展示了这一CPAP模型，包括一个便捷、定制设计的系统，可对未麻醉的新生小鼠无创施加易于调节压力水平的CPAP。同时，我们还演示了利用精密切片肺组织切片法测量气道高反应性的方法。 关键词：正压通气，持续气道正压，CPAP，早产儿，肺发育，小鼠模型，气道高反应性，精密切片肺组织切片法 离体此处描述了肺切片（PCLS）技术，因其可提供肺系统功能的便捷读出，而对小型（新生）动物模型而言，肺功能检测在技术上具有挑战性；此外，该技术也广泛适用于与持续气道正压（CPAP）无关的其他模型。我们展示了数据，表明CPAP可诱发气道高反应性，这一发现可能对早产儿重症监护中呼吸支持模式的选择具有重要的临床意义。

引言

与呼吸相关的问题，例如呼吸暂停和呼吸窘迫，使许多早产儿需要挽救生命的呼吸支持方式，但遗憾的是，这些支持手段会增加婴儿的发病率并延长住院时间。补充氧气₂ 以及正压呼吸支持，包括机械通气（MV）和较无创的持续气道正压通气（CPAP），均为常见的呼吸支持方式。然而，早产儿度过危重期后，其存活者面临的主要短期和长期问题仍是慢性支气管肺部疾病^1,2,3,4，表现为终身喘息/哮喘、肺功能下降以及运动耐力降低。尽管补充氧疗的有害作用₂ 数十年来，MV 被广泛认为与支气管肺发育不良（BPD）及长期呼吸系统并发症的发病机制密切相关^5,6,7,8，一些证据表明，无创呼吸支持形式（如CPAP）也可能对发育中的肺部产生意想不到的影响^6,9,10,11,12然而，关于CPAP的不良反应知之甚少，主要原因是向新生动物无创施用CPAP存在技术上的挑战。

鉴于儿童哮喘总体发病率的持续上升¹³，以及早产儿在新生儿重症监护室（NICU）住院期后的存活率提高，了解启动未成熟气管支气管气道不良结构和功能改变的机制，以及这些改变如何独立于补充氧气导致终身肺部疾病₂ 是一种重要的尚未满足的临床和科研需求。新兴证据表明，新生儿持续气道正压通气（CPAP）可能对气道功能产生长期不良影响，并促成喘息类疾病的发生，这一点尤为重要，因为CPAP已成为避免使用机械通气的首选呼吸支持方式₂ 补充氧的毒性₂与向体型微小且年龄适宜的新生动物施用持续气道正压通气（CPAP）相关的技术难题，阻碍了我们对CPAP对肺发育影响（无论有益或有害）的理解。我们通过建立首个新生小鼠CPAP模型解决了这一问题。^{10,11,12,14,15} 从出生开始，每天向清醒且未麻醉的小鼠输送不同水平的CPAP（每天3小时），从而能够在肺部发育阶段相当于极早产（约24-28周胎儿）婴儿的模型中研究临床相关CPAP水平，这类婴儿通常需要接受CPAP治疗^16,17我们已在新生小鼠模型中进行了磁共振成像扫描，并证实持续气道正压通气（CPAP）可实现肺部膨胀¹¹ 且产后第一周使用CPAP会导致气道反应性在较长时间内（3周龄时，即CPAP使用后2周）升高^10,11,12,14，这与幼儿（3-4岁）喘息症状相一致。在此，我们详细展示了专为新生小鼠设计的自制持续气道正压（CPAP）系统，并介绍了一种利用该系统便捷评估气道收缩功能的方法 离体 精准肺切片法（PCLS）

肺切片（PCLS）为研究气道高反应性机制及其相关通路提供了优良且便捷的平台。利用PCLS方法，可在实时成像中观察单个气道，通过在特定受体/通道抑制剂预处理后，检测气道对乙酰甲胆碱等支气管收缩剂的收缩反应。这些研究对于理解早产儿接受持续气道正压通气（CPAP）后的病理生理后果至关重要，有助于发现可靶向干预的关键环节，从而在优化必要临床治疗的同时，减轻潜在的终身不良影响。

方案

实验使用妊娠时间明确的小鼠进行，每日监测以确定出生日期。小鼠在出生后第一周内接受或不接受持续气道正压通气（CPAP）治疗，通气气体为21% O₂。通常在CPAP处理两周后处死小鼠并取出肺组织，用于通过精密肺切片（PCLS）方法测定气道（AW）反应性，但此类检测也可在CPAP结束后即刻（出生后第8天，P8）或成年期进行。所有实验操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南进行，并经凯斯西储大学动物护理与使用委员会批准。

1. CPAP 面罩的组装

1. 使用带有鲁尔锁紧接头部分的5 mL注射器的切割端制作单个面罩，该接头用于连接导管，从而向小鼠气道输送气流和正压（图1A）。
2. 预先在面罩的注射器部件上钻孔，以容纳带螺纹的鲁尔锁接头，该接头连接弯头、鲁尔转软管接头以及标准水族管（3/8" 直径）。
3. 利用侧端口导管，使出气气流通过下游可调节泄漏口，以设定小鼠肺部的反向压力，并通过自制的压力计实时监测持续气道正压（CPAP）水平。

2. 项圈设计

1. 使用小号标准实验手套的指尖部分裁剪制成颈圈，并用其将小鼠连接至面罩装置。
2. 使用打孔器（1/4 英寸）在裁剪后的指尖顶端打孔，以形成大小均一且一致的开口，适配小鼠的面部和头部。
   注意：打孔器可确保面罩开口尺寸一致，但在小鼠出生后第 4 天（P4）左右需改用较大的打孔器，以适应小鼠的生长。

3. 压力计的构建

1. 使用两个一次性血清移液管，通过弯曲的水族管连接，构建一个压力计（图1A）。确保压力计中注入约一半体积的水，并加入一滴有色染料，以便于观察持续气道正压（CPAP）水平。
2. 将压力计与流量控制器（流速约为600–700 mL/min）和面罩串联连接，并置于流量控制器下游。

4. 为小鼠佩戴颈圈和面罩

1. 将颈圈安装到小鼠（1日龄）上时，首先将其放置在面罩的开口端，并通过小心操作将其拉伸，以便能够容纳小鼠的面部和头部。
2. 将小鼠的面部穿过颈圈的开口，然后轻轻松开原本拉伸的颈圈，使其贴合小鼠面部/头部。约在4日龄时，需在颈圈开口处剪出小切口，以适应小鼠的生长及头部增大；也可建议使用更大尺寸的打孔器制作颈圈。

5. 同时为多只小鼠施用持续气道正压通气（CPAP）

1. 构建一个系统，利用一系列流量控制器和压力计，向最多10只新生小鼠输送持续气道正压通气（CPAP）（图1B）。通过常规空气罐配合标准减压阀提供上游气流，并经由一个流量控制器将总气流输送至所有CPAP装置及面罩/颈圈单元。
2. 在将空气直接输送至CPAP单元之前，先使其通过盛水容器进行鼓泡加湿，并对每只动物独立施加CPAP。
   注意：对照组小鼠佩戴相同的面罩并接受相同气流，但不施加任何背压或CPAP。
3. 所有实验均应在温度约为38 ^oC的循环水加热垫上进行，以维持动物体温稳定。

6. 时间线

1. 每天监测怀孕小鼠，确定分娩日期，随后在出生后第1天（P1日龄）进行首次CPAP治疗，持续2小时（图2），以尽量缩短幼鼠离开哺乳母鼠的时间。
2. 在后续几天（P2-P7），每次CPAP治疗持续3小时。如需要，可将CPAP治疗延长至7天以上，并可在任意CPAP压力水平下进行，但通常采用6 cmH₂O压力持续7天。
3. 随后，可在CPAP治疗结束（P7）后立即（P8）或在更长时间后（如P21或成年期）使用精密肺组织切片制备方法（第8节）评估CPAP对气道反应性的影响。

7. 组织采集与气道收缩性

1. 收获肺组织用于分子或生理学技术（如聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质印迹、免疫组织化学、RNA测序、蛋白质组学、代谢组学等）。
   注意：主要关注 CPAP 对气道收缩性的影响，该效应可通过以下方法评估 体内 （已麻醉并进行机械通气，P21天或以上）用于呼吸系统力学或 离体 使用PCLS（出生第8天或更晚）。后者在研究靶向特定通路的化合物或试剂时具有显著优势，而这些通路可能不适合用于 体内 研究。

8. 精密肺切片（PCLS）方法的全肺提取/制备

1. 通过麻醉过量（腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物，剂量分别为100 mg/kg和10 mg/kg）处死小鼠，以制备肺组织 离体 对气道反应性进行测量，以浴槽施加的乙酰甲胆碱为刺激物。
2. 将小鼠仰卧放置，使用含琼脂糖的注射器进行气管插管。通过颈部腹侧的小切口插入套管，并向前推进约3 mm，随后用缝线固定。
3. 轻轻注入液化的琼脂糖（40 °C）以充胀肺部（P8小鼠为0.4 mL；P21小鼠为0.8 mL），然后将小鼠置于冰箱中30分钟，使琼脂糖冷却并凝胶化。

9. PCLS 方法的肺组织切片

1. 琼脂糖冷却后，将选定的肺叶嵌入2%琼脂糖中，置于振动切片机上切成300 µm厚的切片，并浸入含青霉素/链霉素的DMEM溶液中，于5% CO₂、37°C条件下过夜孵育。
2. 次日，用HBSS清洗肺切片，并将其安装于记录室中，用于活体成像观察气道对乙酰甲胆碱刺激的反应。
   注意：所展示结果代表未经处理（对照组，即未接受CPAP）和仅接受CPAP治疗的样本，实验中未使用任何激动剂或拮抗剂/抑制剂。
   1. 进行气道成像。
      1. 将肺切片置于自制灌流室中，覆盖一层轻薄的网状膜和盖玻片，并用硅脂固定。
      2. 随后将含有切片的记录室安装至显微镜载物台上，使用灌流泵以7 mL/min持续灌流室温HBSS溶液。
      3. 使用配备相机的显微镜识别单个气道。在初始3分钟的基础状态记录后，依次以递增浓度的乙酰甲胆碱进行灌流（每个浓度持续2分钟），并连续记录气道管腔面积的变化。
   2. 量化气道大小。
      1. 针对特定浓度的乙酰甲胆碱（以及基础状态），在ImageJ软件中选取一个气道的单张图像，通过选择调整阈值功能确保完全捕获管腔区域（图3A）。
      2. 随后将该设定应用于同一气道在不同浓度下的后续图像（即对同一气道使用相同的阈值）。
      3. 接着使用魔棒追踪工具选择待测管腔区域（图3B），按下Ctrl + M（图3C）自动计算管腔面积（单位：像素）。对每个乙酰甲胆碱浓度重复此操作；所得数据可用于绘图，气道反应性以基础管腔大小的分数形式表示（图3）。
   3. 样本量
      1. 随机选择气道，在每片肺组织切片中对一个气道（AW）进行乙酰甲胆碱反应检测，尽管通常可对同一动物的多个切片进行评估。因此，处理组可包含来自多个窝仔的多个气道/动物。
      2. 根据既往研究已知CPAP对不同尺寸气道具有不同影响，因此将气道分为大尺寸（>0.05 mm²）和小尺寸（<0.05 mm²）两类。

10. 药物递送

1. 使用切除并切片后，暴露于（或与靶向特定通路的 siRNA）孵育 48 小时的组织切片进行分析。
   注意：各种受体的激动剂和拮抗剂也可方便地急性施用于肺组织切片，如果这些化合物不适合或不安全用于 in vivo 给药，则此方法具有优势。
2. 或者，肺组织可在标准膨胀压力（25 cmH₂O）下进行灌注固定（甲醛），随后保存，并制备用于免疫组织化学染色，以便后续通过共聚焦显微镜进行分析。

结果

新生儿持续气道正压通气期间肺容积的 MRI 分析
采用 MRI 分析技术对 3 日龄、未麻醉且自主呼吸的小鼠（n = 4 只）肺容积的变化进行可视化观察。随着充气压力（即 CPAP）升高，肺容积增大，最高可达 9 cmH₂O（图 4A）。同时展示了 3 日龄小鼠在 0 和 6 cmH₂O CPAP 条件下的代表性图像（图 4B、C）。本分析的目的是确认 CPAP 可扩张肺部，而非腹部区域。

新生儿持续气道正压通气（CPAP）对气道反应性的剂量依赖性和性别特异性影响
新生儿期接受CPAP治疗后，雄性和雌性小鼠的气道（AW）反应性均出现长期升高，表现为随着浴槽中甲胆碱浓度增加，气道管腔面积的减小更为显著（雄性：图5A；雌性：

讨论

持续气道正压通气（CPAP）是早产儿呼吸窘迫时必要的呼吸支持方式。CPAP叠加于自主呼吸之上，通过维持较高的肺容积来改善全身氧合，防止肺泡塌陷和肺不张。因此，CPAP具有重要的挽救生命的作用，并已被证明可促进肺泡发育，尽管其益处可能取决于CPAP的严重程度和持续时间^6,18,19,20。然而近年来，一些新兴证据表明CPAP可能对气道发育产生不利影响，特别是导致长期呼吸道疾病，如喘息和气道高反应性^{9,10,11,12,14,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL注射器	Fisher Scientific	149556458
1 mL 注射器	Fisher Scientific	309659	通过套管注入琼脂糖
1/4" 打孔器	McMaster Carr	3427A57
22 x 22 x 20 包埋模具	Fisher Scientific	22-19
23 G 针头	Fisher Scientific	305193	将套管连接至注射器时，若非 P21 阶段，则需使用其他规格
2 mL 血清移液管	Fisher Scientific	13-678-12c	用于制作呼吸测量仪
可调泄漏阀	任何宠物店		https://www.petco.com/shop/ en/petcostore/product/imagi 氯化塔里亚姆-空气控制阀
水族馆用管	任何宠物店		https://www.petsmart.com/fish/ 过滤器与泵/空气与水 -水泵/顶置式水族箱通气管 -管道-5291863.html
相机	Amscope	MU300
导管管路	Fisher Scientific	427411	对于出生21天的小鼠。其他年龄段需要使用不同尺寸的设备。  导管应紧密贴合气管
盖玻片	Fisher Scientific	12-541-014	18 mm × 18 mm
DMEM:F12	Invitrogen	11039-021
流量控制器	关键仪器	GS10510AVB	用于单只小鼠的气流
流量计	Avantor	MFLX68560-04	整个系统的气流供应
Gaymar T 泵	Braintree Scientific	TP-700	用于维持 CPAP 期间的体温
Hanks平衡盐溶液	Fisher Scientific	MT-20023cv	稀释至1倍浓度后使用
ImageJ	NIH	免费下载	https://imagej.net/ij/download.html
小号乳胶手套	Fisher Scientific	mf-300-s	用于制作 CPAP 面罩
低熔点琼脂糖	Invitrogen	165200-100
网筛	亚马逊		https://www.amazon.com/Top- 聚酯马毛修剪 -selling/dp/B01AC93LJ0/ref=sr _1_fkmr2_1?keywords=drizt%2 聚酯纤维+马毛+溴 辅助&qid=1562072725&s=gatew ay&sr=8-1-fkmr2&th=1
乙酰甲胆碱	Millipore	A2251
显微镜	Leica	DMLFS
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-148
灌流泵	哈佛仪器	70-2027
记录室	Warner Instruments	RC-27	或类似
可重复使用加热垫	布雷因特里科学公司	TP-R	用于与 Gaymar T 泵配合使用
硅脂（Molykote111）	Amazon		https://www.amazon.com/Molykote 耐润滑剂-组分-抗性 波动性/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1 _1_sspa?crid=2D4LQC7SRX07P& dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ- 7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelwG aBpsTElSrogzwQv27amBxERmXW P3eedvi9rAYS1oy_HNesZTAxjTbqku 6PxkC7t24srDUq8mHRpDFor4I0iiRM j6Ij2TWdlQf07ccTIMJ1l4n90nHxPop 9Nwh77ufMeWY2vu5B3to.0mfWIF 3_PrmciPZhO1EAE6RGiNj16v7l-v CH1cqec1Y&dib_标签=se&关键词 s=摩力可特 111&qid=1743607899 &sprefix=二硫化钼+111%2Caps%2 C102&sr=8-1-spons&sp_csd=d2lkZ 2V0TmFtZT1zcF9hdGY&psc=1
无菌6孔板	Fisher Scientific	3516	用于肺片培养
3-0 缝合线	Fisher Scientific	sp117	将套管固定于气管
管路接头	Harvard Apparatus	72-1406
Vibratome（pelco easislicer）	Ted Pella	11000	或同等产品