方法文章

缩小规模以产生巨大影响：简化高通量重组腺相关病毒生产

DOI：

10.3791/68646

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2025年9月12日

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1Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, 2Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 3Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, 4Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 5Biozentrum, University of Basel

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管重组腺相关病毒 （rAAV） 载体广泛用于基因递送，但它面临着显着的生产挑战。该协议概述了使用贴壁细胞和悬浮细胞的微尺度和微型生产方法。这些方法简化了载体的生成、纯化和优化，从而加速了临床前研究并促进了基因治疗管道的进展。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，重组腺相关病毒（rAAV）载体已成为基因治疗应用的领先平台。然而，繁琐的生产和纯化过程仍然是药物开发的重要瓶颈。高通量、小规模 rAAV 生产无需劳动密集型和耗时的纯化程序，为加速临床前研究和早期治疗筛选提供了一种有价值的替代策略。这种方法能够快速生成具有足够质量的多种 rAAV 变体或治疗构建体，用于初始 体外 和 体内 评估。该协议引入了两种按细胞类型和生产规模区分的方法：微型和微型 rAAV 生产。使用贴壁人胚胎肾 （HEK） 293T 细胞（micro-6 孔）以 6 孔形式进行微尺度生产，而微型生产则利用 24 孔板中的悬浮细胞（mini-HT24）。通过这些方法生成的载体经过下游分析以优化细胞培养条件和/或用于评估转基因的生物活性。关键分析读数包括载体基因组滴定 （vg/mL）、衣壳滴度测定 （vp/mL）、蛋白质印迹分析和细胞转导测定。此外，将使用亲和树脂在小型生产和半纯化的载体与通过氯化铯密度梯度 纯 化的中型制剂进行比较。这里描述的简化方法显示出在细化细胞培养参数、在筛选过程中识别主要候选者（即优化的转基因盒或优良的AAV衣壳）和增强转基因表达方面的巨大潜力。总的来说，所提出的工作流程支持建立一个强大而高效的平台，用于基因治疗管道的迭代开发，该平台可以在任何研究实验室中轻松实施。

引言

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药物开发是一个复杂且资源密集型的过程，需要整合来自各个阶段的高质量数据，包括靶点识别、临床前验证和临床试验1。为了满足对更快的时间表和降低成本的日益增长的需求2，制药行业越来越多地采用高通量（HT）小规模检测与先进的人工智能（AI）相结合，作为现代发展战略的基石3,4,5。与传统方法相比，HT 测定可以快速筛选和评估大量候选药物或测定变量，而时间和成本仅为传统方法的一小部分 5,6。

在基因治疗应用中，特别是那些使用腺相关病毒 （AAV） 载体的应用，高昂的商品成本和漫长的制造时间带来了重大挑战7。开发过程从生产转染所需的质粒材料开始，然后是细胞生长至足以生产病毒载体的高密度。转染后，收获前需要两到五天的孵育期，该过程以纯化和批量表征8,9结束。总的来说，该工作流程可能需要长达一个月的时间，并且通常仅限于有限数量的制备，当使用亲和柱或梯度超速离心时可以并行运行 9,10,11,12。

认识到对小型、微型或微型 AAV 生产方案的需求，该领域采用了多种方法在小型实验室规模的设置中生产重组 AAV （rAAV）。这些方法通常涉及使用多个 15 cm 培养皿用于贴壁细胞13,14 或 50-2000 mL15 摇瓶进行悬浮培养。过去，采用AAV纯化方法，例如梯度超速离心（例如，碘沙醇16，氯化铯（CsCl）17或蔗糖梯度18）。这种廉价且与血清型无关的方法非常适合在实验室规模上生产rAAV，但其劳动密集型性和有限的超速离心机容量使其不太有利于高通量应用19,20。

对更高产量的持续需求导致了对缩小 rAAV 生产规模的替代方法的探索。使用贴壁细胞，已经研究了 6 孔 13,21,22、96 孔23 甚至 384 孔板24 等格式。最近，悬浮细胞已被采用，因为它们具有改进的可扩展性和与载体制剂相当甚至更优越的效力8。

然而，在培养体积小于15mL的悬浮细胞中高通量生产rAAV仍然是一个专业领域，已发表的方案7,25,26有限。大多数研究都集中在更大的体积上，以达到下游应用的足够产量8,9,27，但与贴壁细胞一样，微型格式可显着减少资源消耗和处理时间，从而满足该领域的关键需求。重要的是，微型和微型方案通常使用“粗裂解物”或含有载体颗粒的未纯化细胞培养收获物进行下游表征和分析。

本研究概述了两种利用贴壁和悬浮生产细胞的方案（图1）。由贴壁HEK293T细胞产生的粗 rAAV 裂解物直接用于后续应用，例如靶细胞的转导。相比之下，悬浮细胞中产生的 rAAV 通过高通量亲和树脂纯化 进行 进一步处理。这些方法专门用于提高产量、评估载体质量和监测转基因表达，同时最大限度地减少昂贵试剂和材料的消耗。这里介绍的结果表明，粗裂解物（来自贴壁细胞）和亲和纯化材料（来自悬浮细胞）都是合适的，具体取决于应用范围。此外，在人源性神经元共培养物中的产量、纯度和转导效率方面，使用亲和树脂获得的rAAV与使用传统氯化铯超速离心纯化的对应物直接进行了比较。

在基因治疗药物开发中采用高通量、小规模检测是一项不可或缺的进步，加速了创新并弥合了科学发现与治疗现实之间的差距。这些方法不仅降低了成本和时间，而且还能够并行测试多种疾病，最终有助于变革性疗法的高效开发。

方案

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1. 贴壁细胞中 rAAV 载体的微 6 孔生产

注意：rAAV的微6孔生产是Fakhiri等人之前发表的方案的改编版本21。

  1. HEK293T细胞的接种和转染
    1. 在37°C的水浴中解冻一瓶HEK293T细胞28 。
    2. 将细胞转移到 T175 烧瓶中的 30 mL 贴壁细胞培养基中，并在 37 °C 和 5% CO2 下保持在 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） + 10% 胎牛血清 （FCS） 中。
    3. 每 2-3 天分HEK293T一次：吸出细胞培养基并小心地加入 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以洗涤细胞。
      注意：本协议中仅使用低于传代数 15 的细胞传代，以确保细胞的完整性和健康，这直接影响 rAAV 的产生。
    4. 向细胞中加入 2 mL 0.025% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 （EDTA），并在 37°C 下孵育 2 分钟（或直到细胞分离）。
    5. 通过添加 20 mL 新鲜培养基并使用 25 mL 移液器将细胞悬浮在培养基中来停止反应。根据汇合度，细胞可以在 24 mL DMEM 高葡萄糖培养基中以 1：10 或 1：20 稀释。为了获得足够的细胞密度进行转染，请在 T175 烧瓶中接种 7 × 106 个HEK293T细胞。
    6. 在37°C下72小时后，通过胰蛋白酶消化收获细胞（如步骤1.1.3-1.1.5中所述），重悬于20mL培养基中，并计数细胞。
      注意：可以使用各种方法对细胞进行计数，具体取决于所需的准确性、通量和可用设备。主要使用两种方法：手动计数（Neubauer 室）和自动细胞计数仪。该协议采用全自动、基于图像的细胞分析仪来测量关键细胞参数，如活力、细胞密度和聚集率。
    7. 在 6 孔板中以 0.5 × 106 个细胞/孔的密度接种细胞。为了均匀分布细胞，轻轻摇动板并将其放入 CO2 培养箱中。
    8. 24小时后，细胞达到60-70%的汇合度，可以三重转染。
    9. 对于每个孔，将 90 μL 无血清培养基与总共 2.6 μg 质粒 DNA（包括 pTransgene、pRep/Cap 和 pHelper）以 1：1：1 的摩尔比混合。
    10. 在第二个试管中，在转染前将 5 μL 聚乙烯亚胺 （PEI） 添加到 90 μL 无血清培养基中。
    11. 将两种溶液混合后，涡旋混合物并在室温（RT）下孵育10分钟。
    12. 将转染混合物滴加到每个孔中。轻轻摇动板，然后将它们放回培养箱。
      注意：转染后可以进行培养基更换，但这不是作为标准做法应用的，因为细胞在整个实验过程中保持良好的活力。
  2. 细胞的收获和裂解
    1. 转染后 72 小时，小心地从板中吸出细胞培养基。
    2. 通过向每个孔中加入 500 μL PBS 来分离细胞，并小心地上下移液。
    3. 将细胞悬液转移到 1.5 mL 微量离心管中。
    4. 按照制造商的说明手动或自动测量细胞活力和密度。
    5. 将 50 μL 从悬浮液转移到 96 U 底板中，通过流式细胞术 定量 报告阳性群体来确定转染效率。
      注意：始终建议同时进行转染对照，即用携带荧光蛋白（例如，绿色荧光蛋白（GFP），mCherry等）的转基因转染1-2孔，以监测板上的转染效率。具有非转导细胞的孔用作阴性对照。
    6. 在室温下将剩余的细胞悬液以800× g 离心10分钟，以沉淀细胞，其中含有所制载载体的主要部分。
    7. 弃去上清液并将细胞重悬于 100 μL PBS 中。细胞悬液可储存在-80°C。
      注意：要从收获的细胞中获得粗裂解物，请使用下述两种方法之一。
    8. 在第一种方法中，细胞可以使用 37 °C 预热水浴和液氮进行五次冻融循环，每次 5 分钟。在循环之间短暂涡旋样品2-3秒。
    9. 该协议中的第二个也是主要使用的选项是超声处理。在这里，将细胞悬液转移到薄壁聚合酶链反应（PCR）板或管中，并在4°C下置于水浴超声仪中。
      1. 以 25% 的振幅（强度）以 30 秒的开关增量对样品进行超声处理总共 3 分钟。
    10. 超声处理后，使用台式离心机（16,100 × g 在 4 °C 下 10 分钟）沉淀细胞以去除细胞碎片并获得无细胞载体悬浮液。
    11. 将上清液转移到 1.5 mL 管中，并将每个样品的 10 μL 移液到低结合的 96 孔板中，用于数字液滴 （dd）PCR 或数字 （d）PCR 分析。
    12. 将试管和 96 孔板储存在 -80 °C 直至进一步使用。
  3. 使用粗裂解物转导HEK293A细胞
    注意：HEK293A细胞可能并不适合所有AAV血清型。要确定合适的细胞系，请查阅 SPIRIT29 等数据库（有关 SPIRIT 数据库的链接，请参阅材料表）或相关的原始研究文章30,31。
    1. 在转导前一天，将HEK293A细胞接种在三个 96 孔板中，密度为每板 1.5 × 106 个细胞。
    2. 第二天，将 10 μL 产生的载体与不同体积的 PBS 混合，以生成 1：2、1：10 和 1：100 稀释液。
    3. 使用多通道移液器，将细胞转导在 96 孔板中，一式三份。
    4. 将细胞与 rAAV 一起孵育 72 小时，无需培养基交换。之后，根据表达的转基因进行下游实验，如蛋白质水平测量、荧光蛋白表达的流式细胞术分析、敲低/敲除分析等。
    5. 对于本协议中执行的标准流式细胞术，吸出培养基并通过添加 25 μL 0.025% 胰蛋白酶/EDTA 分离细胞。
    6. 在37°C下孵育3分钟。
    7. 通过向每个孔中加入 175 μL PBS 中的 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 来停止反应。
    8. 使用 100 μL 细胞悬液进行流式细胞术分析。

2. 悬浮细胞中 rAAV 载体的 Mini-HT24 生产

注意：在mini-HT24设置中，与前面描述的micro-6孔生产相比，rAAV载体的纯化制剂是使用悬浮细胞生成的。由于在相同的培养体积内可以实现更高的细胞密度，悬浮培养物会产生更多的 rAAV。在该协议中，采用了24深孔格式。使用AAVX亲和树脂高通量纯化粗细胞裂解物，目的是生成不适合粗裂解物的某些应用所需的更清洁的产品（参见讨论部分）。

  1. 在 24 深孔板中培养和三重转染悬浮细胞
    1. 在 37 °C 的水浴中解冻一瓶悬浮病毒生产细胞 （VPC）。 传代细胞少于 30 次，以保证所生产载体的质量一致。
    2. 将细胞转移到摇瓶中的 30 mL 悬浮培养基中，并在维持培养条件下培养 2-3 天：37 °C、8% CO2、95% 湿度和 140 rpm（摇动平台半径 25 mm）。
    3. 2-3天后确定活细胞密度（参见步骤1.1.6中的注释）。继续传代培养和扩增，直到达到AAV生产所需的所需活细胞数量。
      注意：以> 4 × 106 个细胞/mL 和 < 6 × 106 个细胞/mL 的活密度传代培养细胞，或根据制造商的说明根据所使用的单个细胞系进行传代培养。以 6 × 105 个细胞/mL 的活密度接种 3 天，分裂或 3 × 105 个细胞/mL 接种 4 天。根据制造商的说明拆分。
    4. 在 24 深孔板的每个孔的 2.5 mL 中接种 3 ×10 6 个细胞/mL，并用无菌膜盖盖住板。
    5. 为每个 rAAV 构建体制备三重转染混合物，如下所示：
      1. 以 1：1：1 的摩尔比制备生产质粒（pHelper、pRep/衣壳、pTransgene）的 DNA 混合物，最终质量为每 1 × 106 个活细胞 600 ng DNA。
      2. 在悬浮培养基中制备混合物，最终体积为要转染的培养体积的 2.5%。
      3. 在悬浮培养基中制备PEI-Mix，最终体积为要转染的培养体积的2.5%。使用每 1 ng DNA 1 ng PEI 的最终质量。
      4. 通过将单个 PEI-Mix 的整个体积转移到相应的 DNA-Mix 中来混合 DNA-Mix 和 PEI-Mix，从而产生培养体积的 5% 的转染混合物体积。
      5. 上下移液10次混合。
        注意：孵育时间后不要涡旋转染混合物，以避免破坏在孵育期间形成的PEI-DNA复合物32。
      6. 在室温下孵育10分钟。
    6. 将转染混合物逐滴添加到相应的孔中，同时小心摇动深孔板。
    7. 使用无菌透气人造丝薄膜密封板，并用相应的膜盖额外覆盖它，以尽量减少蒸发。
    8. 确保将板放置在合适的深孔摇床托盘上并固定牢固。
    9. 将细胞在 37°C、8% CO2、95% 湿度和 225 rpm 下孵育 72 小时。
      注意：不同的深孔板形式需要单独评估振荡速度，以实现均匀悬浮液中细胞的有效气体交换和培养，而不会随着时间的推移细胞沉降到底部。这需要根据各个实验室设备和设置以及用于生产的细胞系进行初始测试。特别考虑摇动半径、板格式和孔底形状，以保持细胞悬液均匀并避免细胞沉降到底部。
  2. 收获和裂解
    1. 通过将每个孔的全部培养体积转移到单独标记的 5 mL 管中来收获细胞，并在 4 °C 下以 800 × g 离心 20 分钟。
    2. 吸出上清液并将沉淀重悬于 550 μL Dulbecco 的 （D）PBS 中，并将悬浮液转移到 1.8-2.0 mL 螺旋盖管中，以避免打开管时出现气溶胶和液滴。
      注意：此时也可以储存沉淀，以便稍后进行纯化过程。将Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）重悬沉淀储存在-80°C，并确保在冻融循环步骤中考虑这一点。
    3. 通过将试管放入液氮中约 2 分钟，然后在 37°C 水浴中解冻来制备裂解物。重复这个循环 3-5 次。
    4. 在4°C下以1000× g 离心裂解物5分钟。 用气溶胶密封盖盖住离心机桶。
    5. 小心地从离心机中取出试管。
      注意：裂解物需要透明且无可见碎屑或浑浊，以避免堵塞纯化过程中使用的树脂。避免摇晃或干扰颗粒。如果上清液不透明，请重复离心步骤。对于高度浓缩的样品或含有大量碎片的样品，请考虑更高的离心速度或更长的持续时间。
  3. 基于亲和树脂的高通量 rAAV 纯化
    1. 在烧杯中，通过将 720 mg 柠檬酸添加到 50 mL 超纯水中以达到 75 mM 柠檬酸的终浓度来制备洗脱缓冲液。
    2. 搅拌缓冲液直至粉末完全溶解。
      注意：确保孔体积足以容纳缓冲液体积和移液器吸头，而不会溢出或有交叉污染相邻孔的风险。
    3. 通过滴加 1 M 盐酸 （HCl），同时连续搅拌缓冲液并用 pH 电极测量，将 pH 值调节至 3.0。
    4. 使用0.22μm的孔径对缓冲液进行无菌过滤。
    5. 根据 表1中描述的方案，制备孔体积为2-2.2mL的96深孔板色谱柱进行纯化。
      注意：此处的样品是使用电动多通道移液器装置纯化的。该工艺与自动化液体处理系统兼容，可以扩大规模以提高样品通量。
    6. 使用纯化方案中显示的参数（见 表 1）在 RT 生物安全柜中运行纯化，或根据个人要求优化参数，具体取决于树脂或样品体积、预期滴度等。
    7. 洗脱后，向每个样品中加入 1/4 洗脱体积的中和缓冲液。
    8. 通过上下移液 80% 的体积 10 倍来混合。
    9. 通过取出膜盒并向每个孔中加入 1600 μL 透析缓冲液来制备透析板。
      注意：确保在进行透析之前不要让膜与液体接触，因为重新干燥会损害膜的完整性和功能。
    10. 将整个样品体积（最大 300 μL）转移到具有合适体积格式和膜孔径（≥ 20,000 截止分子量 （MWCO））的透析盒中。确保膜负载均匀且不存在气泡。
    11. 将盒放入透析板的装载孔中，并用密封箔密封板。
    12. 将透析板转移到摇动平台上，以 300 rpm、4°C 孵育 30 分钟。
    13. 更换透析缓冲液并以 300 rpm、4°C 重复孵育 30 分钟。
    14. 重复缓冲液交换和孵育总共 3 次。
    15. 将透析样品的全部体积转移到标记的储存管中，如果随后用于表征或其他实验，则将其储存在 4 °C 下。
    16. 储存在-80°C，以便长期储存。避免冻融循环，因为这会影响 AAV 的效力，并在需要时准备少量等分试样。
  4. 使用数字 PCR （dPCR） 从粗裂解物和树脂纯化中滴定 rAAV 基因组滴度
    1. 为了确定粗裂解物的基因组滴度，即每mL病毒基因组（vg / mL），在室温下解冻收获的载体样品，然后将10μL移液到管中。
      注意：有几种方法可用于确定载体制剂的病毒基因组（vg / mL）滴度，绝对定量通常依赖于两种主要方法：基于液滴或乳液的方法（ddPCR）和基于微孔板的方法，以数字PCR（dPCR）33,34为代表。除了这些数字方法外，还可以使用定量PCR（qPCR）实现绝对定量。虽然qPCR传统上是一种相对定量方法，但可以通过使用质粒标准曲线来适应绝对定量。这涉及含有已知浓度的靶序列的质粒，该质粒可作为外推病毒基因组滴度21,33 的参考。尽管 qPCR 比 ddPCR 或 dPCR 更快、更便宜，但它的精确度较低，并且严重依赖质粒标准品16 的准确性。无论采用何种定量方法，都必须对样品进行预处理以从颗粒中释放病毒基因组。该协议遵循 Dobnik、D. 等人35 先前描述的方法。
    2. 用核酸酶在 37 °C 下处理 rAAV 样品 30 分钟，以降解转染过程中的游离质粒 DNA。
      注意：可选，取决于所使用的酶：将样品加热至95°C15分钟以灭活酶并裂解载体的衣壳。
    3. 冷却至室温后，加入蛋白酶K15分钟以消化衣壳片段。
    4. 为了灭活蛋白酶K，再次将样品加热至95°C15分钟。
    5. 按照制造商的说明制备 ddPCR 或 dPCR 预混液。
    6. 使用标记的 DNA 探针，因为它们提供比插层染料更特异性的信号。设计探针以“中心”结合在病毒基因组中，即转基因（见注释）中，而不是启动子或polyA尾部，并选择与相应PCR系统兼容的荧光团，如六氯-6-羧基荧光素（HEX）或6-羧基荧光素（FAM）。
      注意：最近，多重ddPCR或dPCR，采用针对病毒基因组不同区域的引物/探针组，已被用于提高滴度测定的准确性36,37。这种方法可以通过应用参考研究中概述的公式或使用集成软件解决方案来量化完整的基因组。
    7. 使用低 DNA 结合 96 孔板在 ddH2O 中对后处理样品进行 10 倍连续稀释。最后，将 5.5 μL（用于 ddPCR）或 2 μL（用于 dPCR）的模板（稀释液 104- 和 105）转移到 ddPCR 96 孔板中，该板已经包含 ddPCR/dPCR 预混液，包括引物/探针。根据单个结构的生产效率调整稀释范围，以确保测量值在线性检测范围内。
      注意：由于dPCR / ddPCR定量是一种高度灵敏的方法，因此需要104和105稀释的样品。
    8. 请按照下面描述的步骤进行 ddPCR。
      1. 对于 PCR 扩增，请遵循制造商的说明来优化检测条件，包括根据所使用的引物/探针组调整退火和扩增时间。本研究中使用的标准循环方案如下：在9°C下初始变性10分钟（斜坡°C/s）;在 9 °C 下变性 35 个循环，持续 30 秒，在 6 °C 下扩增 60 秒;然后在 9 °C 下进行最后的伸长步骤 10 分钟（斜坡 °C/s）。
      2. 对 rAAV 病毒基因组靶标进行 PCR 扩增后，将板转移到液滴读取器上，并按照制造商的说明测量每个孔中的荧光强度。液滴酶标仪能够对病毒基因组拷贝数 pe μL 反应进行绝对定量。
    9. 按照下面描述的步骤进行 dPCR。
      1. 如基于ddPCR的定量所述，请按照制造商的说明优化测定条件。
      2. 作为起点，遵循 dPCR 设备上预设的热曲线，其中包括在 9 °C 下进行 2 分钟的初始变性步骤，然后在 9 °C 下进行 40 个变性循环，持续 15 秒，并在 5 °C 下退火/延伸 30 秒。
        注意：该协议是使用制造商指定的推荐升温速率和反应体积进行的。
    10. 使用通常由仪器制造商提供的各种软件解决方案（例如，分别为 QX 管理器和 QIAcuity 软件套件 1.2）分析 ddPCR 和 dPCR 数据。对于这两种方法，仅选择具有足够正负分配/液滴比例的样品稀释液进行定量。
      注意：为了测定粗裂解物和AAVX树脂纯化材料中的rAAV颗粒滴度（vp / mL;vp =病毒颗粒），可以使用酶联免疫吸附测定（ELISA）。提供各种用于AAV定量的市售标准夹心ELISA试剂盒（本工作中使用的试剂盒列在 材料表 中).根据制造商的手册进行测定。确保所使用的 ELISA 试剂盒与正在生产的 AAV 血清型兼容。
  5. 纯化 rAAV 的 VP 比率分析
    注意：为了确定来自 24 个深孔装置的各个孔的每个样品的病毒衣壳蛋白 （VP） 比率，可以执行标准蛋白质印迹或基于毛细管的自动方案。
    1. 要检测 AAV2 衣壳蛋白 VP1、VP2 和 VP3，请使用一抗 AAV VP1/VP2/VP3 单克隆抗体。确保一抗与相应的血清型或衣壳变体有效。
    2. 使用合适的阳性对照，例如重组 VP1、VP2 和 VP3 或 AAV 参考标准品。
    3. 以 1：1：10 的分子比 （VP1：VP2：VP3） 制备阳性对照，以模拟预期的 VP 比率。这也可以作为使用信号面积积分进行VP比率量化的参考。
    4. 选择具有合适范围的毛细管试剂盒，包括要检测的衣壳蛋白，包括最小的（VP3 ~ 60 kDa）和最大的（VP1 ~ 82 kDa）。这可能因所使用的血清型和衣壳变体而异。
    5. 根据制造商的说明准备试剂盒中提供的试剂和生物素化分子量标准品。
    6. 在试剂盒提供的稀释缓冲液中制备一系列稀释样品（基于基因组滴度，从 1 × 1012 vg/mL 到 1 × 1010 vg/mL，或从 1：2 稀释样品开始，从 1：64 稀释），以确保每个样品都有良好的检测范围。
    7. 根据制造商的说明或取决于先前的测试，在提供的抗体稀释缓冲液中稀释一抗。从 1：100 开始。
    8. 根据一抗的来源使用相应的检测试剂盒。
    9. 根据套件随附的方案加载板。
    10. 确保用水或样品稀释缓冲液填充空色谱柱，以免干涸而损坏仪器毛细管。
    11. 用密封箔覆盖板，并在 4 °C 下以 1200 × g 离心 5 分钟。
    12. 将板和毛细管转移到仪器上，并使用预设的标准条件进行运行。
    13. 使用数据分析软件分析运行，例如 Compass（版本 6.3.0）38。
      注意：为了分析颗粒完整性，单分散性和纯度，建议使用透射电子显微镜（ns-TEM）进行负染色。TEM 分析可以按照 Steininger 等人的描述进行。AL25.然而，其他方法，如质谱光度法39，SEC-MALS40和棉条染色41，也可以提供补充读数来评估rAAV制剂的质量。
  6. 用纯化的病毒颗粒转导
    注意：要用纯化的病毒载体转导细胞，必须确定感染多重性（MOI）。MOI 定义为每个细胞添加的含颗粒基因组的数量。需要注意的是，这是一个理论值;每个细胞递送的 rAAV 基因组的实际数量取决于衣壳成功转导靶细胞的能力。因此，最佳 MOI 必须始终通过实验确定。在本节中，目标是比较使用不同纯化方法（氯化铯超速离心和 AAVX 亲和树脂）生产的两种病毒载体储备液。为此，用两种制剂转导人源性神经元共培养物，并使用荧光显微镜评估转导效率。
    1. 在 96 孔黑色光学底板上涂上 0.1%（聚左旋鸟氨酸）PLO 在 4 °C 下过夜或在 37 °C 下孵育 ≥ 1 小时。
    2. 在接种当天，吸出PLO包被试剂并涂上还原生长因子基底膜基质，并在37°C下孵育1≥1小时。
    3. 用星形胶质细胞以 1：6 的比例或根据供应商的建议培养运动神经元。
    4. 在 体外 （DIV）2天时，以50,000的MOI转导共培养物。
    5. 在4°C下解冻病毒等分试样。
    6. 制备转导培养基（基于每个细胞的病毒基因组具有所需 MOI 的病毒载体 + 适当体积的细胞培养基，以替代每孔 50% 的培养基）。
    7. 与转导培养基进行 50% 的培养基交换。
    8. 在5 DIV时，与常规培养基进行完整的培养基交换。
    9. 每 2-3 天或根据供应商的建议定期更换培养基来维持细胞。
    10. 使用配备正确激发报告基因转基因的活体成像显微镜监测表达水平。对于人源性神经元，在转导后10-14天内观察到平台表达（见 图4A）。
步缓冲液/材料孔体积 [μL]工作体积 [μL]周期流量
[微升/分钟]
1. 平衡平衡/
Wash I 缓冲液		11009502500
2.加载中/
捕获		样品上清液5505004
3. 洗 I平衡/
Wash I 缓冲液		11009502
4. 洗 IIWash II 缓冲液11009502
5. 洗脱洗脱缓冲液70 μL（20 μL 树脂吸头）
250 μL（80 μL 树脂吸头）		60 μL（20 μL 树脂吸头）
240 μL（80 μL 树脂吸头）		4
6. 中和中和缓冲液将 1/4 的洗脱体积直接添加到每个样品中
70 μL 洗脱样品→加入 17.5 μL
250 μL 洗脱样品→加入 62.5 μL		--

表1：rAAVs亲和树脂纯化的板布局和纯化参数。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，对实验室规模的 AAV 载体生产的需求显着增加，导致许多合同研究组织的建立，将其作为一项服务42。鉴于外包通常带来的高成本和延迟时间表，内部 rAAV 生产仍然是一个有吸引力的选择。特别是，在集成纯化步骤的同时最大限度地减少材料消耗和工作时间的高通量方案在药物开发管道中非常有益。

该协议概述了用于 rAAV 生产的两种高通量设置：使用贴壁细胞的微 6 孔方法和用于悬浮细胞的 mini-HT24 方案（参见 图 1 中的概述）。micro-6 孔装置利用贴壁HEK293T细胞以 6 孔形式生产 rAAV。该材料用于评估两种市售PEI转染试剂和氯化钠（NaCl）对rAAV2产生的影响（图2A）。在这里，同时监测不同的参数：（i）使用GFP转基因的生产细胞的活力和转染效率（图2B 和 补充图1），以及（iii）用粗裂解物转导后GFP阳性（GFP +）细胞的百分比（图2C）。转导实验是载体滴度和功能的廉价且快速的间接读数。有趣的是，转染试剂与DNA的较低比例足以促进有效的载体生产（图2B），同时保持良好的细胞活力。此外，添加 150 mM NaCl 似乎是有益的，特别是在使用 PEIpro 试剂时。在微观尺度上进行该实验具有几个优点：（i）快速工作流程，细胞接种、转染和载体收获在一周内完成;（ii）与标准下游分析检测的兼容性;（iii） 广泛适用于所有 AAV 血清型。

对于需要大量 rAAV 载体的应用，例如 体内 实验或 体外 动力学研究（应用更高或更广泛的 MOI），需要扩大规模。为了建立为高通量纯化提供足够材料的mini-HT24方案，使用了悬浮细胞。与贴壁细胞相比，悬浮培养物具有更好的可扩展性并且更节省空间，因为它们不受表面积的限制。由于悬浮细胞在培养基中自由生长，因此它们可以占据整个培养体积，从而使三维放大更加简单。与蛋鸡培养相比，这使得细胞密度更高。此外，悬浮系统更易于维护和加工，因为在传代或收获过程中不需要分离步骤。通过分析板上的三个关键参数来评估 24 孔格式下 rAAV 生产的均匀性（图 3）：（A） 颗粒滴度 （vp/mL）;（B）衣壳中的VP比率;（C） 基因组滴度 （vg/mL） 和 （D） 空满比。

虽然在这些参数上观察到一些变异性，但它基本上保持在两倍范围内，即在测量误差范围内。还使用自动蛋白质印迹分析评估了VP蛋白表达（图3E）。最后，对微型6孔、迷你HT24和中等规模（摇瓶）生产获得的总产量进行了比较，以指导根据实验要求和下游分析需求选择合适的规模（图3F）。

任何 AAV 纯化方案的一个关键方面是评估载体纯度和效力。在这里，将树脂纯化的载体与使用基于两步氯化铯 （CsCl） 的超速离心 （UC） 方法纯化的载体并排比较（图 4）。通过荧光显微镜观察到两种制剂之间的效力相当，如运动神经元和星形胶质细胞的成功转导所证明的那样（图4A）。电镜分析显示颗粒形状或聚集状态无显著差异。然而，有一个轻微的趋势表明，CsCl纯化更一致地产生更清洁的制剂（图4B）。

figure-results-1
图 1：rAAV 生产和制备方法概述。 该图说明了 rAAV 生产方法，范围从中型摇瓶到迷你 HT24 悬浮培养物和微 6 孔贴壁培养物。这些方法利用不同的细胞裂解和载体纯化策略，能够在各种规模上生成 rAAV。rAAV 的最终表征通常包括用于病毒基因组定量 （vg/mL） 的 qPCR/dPCR、用于衣壳滴度 （vp/mL） 测定的 ELISA 以及用于评估生物活性的细胞转导测定。在BioRender中创建。奥兰，P. （2025） https://BioRender.com/x3sfbdd。请点击此处查看此图的大图。

figure-results-2
图 2：用于微 6 孔 rAAV 生产的转染方案的优化。 （A） 实验示意图，包括测试参数和分析读数。（B）在转染前24小时将HEK293T细胞接种在6孔板中，密度为0.5×106 个细胞/孔。测试了不同的 DNA 量、PEI 类型（Pro 或 Max）、比率和 NaCl 浓度。（C）转导后72小时GFP阳性（GFP +）HEK293A细胞的百分比，具有来自面板A的等体积裂解物（每个10μL）。为简单起见，仅显示导致最高载体产量（2650 ng）的DNA条件。 请点击此处查看此图的大图。

figure-results-3
图 3：在 mini-HT24 装置中产生的 rAAV 的分析表征以及不同尺度的滴度比较。 （A）每个孔中纯化的rAAV衣壳滴度的ELISA分析。值表示为纯化后高于板平均颗粒滴度的变化。预期滴度取决于使用的 AAV 衣壳和包装的转基因。不同AAV载体的颗粒滴度范围在低1011 到高1012 VP/mL之间。（B）通过WES对指定孔中纯化的rAAV进行VP比率分析。重组AAV2 VP1、VP2和VP3作为阳性对照，摩尔比为1：1：10。（C）每孔纯化rAAV的dPCR分析。值显示为纯化后高于板平均基因组滴度的变化。预期滴度取决于使用的 AAV 衣壳和包装的转基因。不同AAV载体的基因组滴度范围在低1010 （rAAV2）至高1011 vg/mL（rAAV9，此处未显示）之间。（D）指示孔的空满比（E/F），基于图A和C的基因组和颗粒滴度结果。值归一化为板平均值。AAVX 亲和树脂纯化后，所示 rAAV2 的 mini-HT24 格式的平均 E/F 分别为 10.6% ± 3.0%。（E）对每孔纯化的rAAV2样品中VP蛋白进行毛细管蛋白质印迹分析。（F）比较总病毒基因组产量，考虑每种方法的最终样品量和浓度。数据显示为最小格式（micro-6孔）的平均倍数差异，误差线表示与生物重复的标准偏差（SD）。对于AAVX亲和树脂纯化的高通量24深孔生产，SD = ±0.176（n = 24）;用于微6孔超声处理;标准差 = ±0.349 （n = 6）;对于采用 CsCl 梯度纯化的标准中等规模生产，SD = ±134.70 （n = 2）。 请点击此处查看此图的大图。

figure-results-4
图 4：高通量 （HT） 树脂纯化的 rAAV 和标准 CsCl 纯化样品之间的效力和纯度比较。 （A） 在人突触蛋白启动子下，以 50,000 的 MOI 转导表达荧光报告基因 mRuby3 的相同 rAAV 构建体，转导人源性运动神经元和星形胶质细胞。荧光显微镜图像在转导后 7 天 （DPT） 在实时成像显微镜上捕获。使用标准 CsCl 梯度方法（上图）或基于 HT AAVX 亲和树脂尖端的方法（下图）纯化 rAAV。在进行转导之前，将 CsCl 纯化的样品暴露于一个额外的冻融循环中，并与树脂纯化的 rAAV 进行比较。（B）透射电子显微镜（TEM）分析通过CsCl梯度（上）和HT树脂尖端方法（下）纯化的基于rAAV2血清型的变体。可以比较两批 HT 树脂纯化的 rAAV2 样品，无需透析（左下）和透析（右下）。使用TEM测定空满比（E/F），对于CsCl梯度超速离心纯化样品>90%饱满，对于AAX亲和树脂纯化样品<40%满满。比例尺 = 100 nm。图B显示了使用指定方法纯化批次的代表性图片。请注意，这些图像不属于图A中所示的用于转导实验的相同制剂。 请点击此处查看此图的大图。

补充图1：使用micro-6孔装置转染用于生产rAAV2-GFP的HEK293T细胞。 使用各种 DNA 量、NaCl 浓度（以 mM 为单位）、PEI 产物和 PEI 与 DNA 比率进行转染（如 图 2 所述）。转染后 72 小时使用相同的曝光时间 （320 ms） 拍摄图像。此图显示了代表性的明场和荧光显微镜图像。放大倍数：10X。比例尺未显示;图片仅供说明之用和定性评估。 请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议论文概述了利用贴壁细胞和悬浮细胞在高通量、小规模环境中生产 rAAV 的有效方法。这些方法满足了对可扩展和灵活的 rAAV 生产工艺日益增长的需求，这些工艺支持临床前研究，同时最大限度地减少时间、成本和资源消耗。

贴壁细胞和悬浮细胞系统都为小规模 rAAV 生产提供了独特的优势和挑战。贴壁细胞系统，例如以多孔板形式生长的HEK293T细胞28 ，特别适合早期载体设计和比较研究。它们与既定的培养和转染方案兼容，可以在大多数实验室中直接实施。例如，Grosse 等人。利用 6 孔板中的小规模生产来研究 AAP 功能，这是一种对病毒衣壳22 组装至关重要的蛋白质。Drittanti等人 在 96孔板中生产rAAV载体，以评估rAAV复制的动力学，并测试不同腺病毒辅助因子对rAAV产生的影响23。值得注意的是，在后一项研究中，描述了一种使用表达 AAV Rep 和 Cap 的专用 HeLa 细胞来进一步放大信号的复制测定。最近，Quan等人在siRNA筛选的背景下应用了384孔高通量生产方案，报告了相对滴度24。然而，鉴于材料数量有限，仍不确定可以进行多少次测定和读数，或者是否可以在细胞转导实验中实现足够的 MOI，而不是测量荧光蛋白，这可能会影响可重复性。

在这项工作中，使用贴壁HEK293T细胞中基于微6孔的生产来优化rAAV2的培养条件（图1和图2）。与先前的研究和技术报告43,44 一致，较低的 PEI 与 DNA 比率和转染过程中 NaCl 的添加对 rAAV 的产生产生积极影响。这间接反映在HEK293A细胞中产生的载体的转导效率上。在较低的PEI：DNA比率下观察到的显着差异主要归因于细胞应激，如低细胞活力所表明的那样，尤其是PEIpro。尽管在PEImax条件下效果不太明显，但显微镜图像显示细胞层中存在无细胞区域，表明应激或细胞脱离（补充图1）。

重要的是，这些发现并不直接适用于悬浮培养物中的载体生产，强调增强贴壁HEK293T细胞中 rAAV 产生的实验条件可能并不总是转化为悬浮细胞，即使潜在的细胞类型保持不变。这种差异可归因于这两个系统之间转录组学和蛋白质组学水平的差异45。因此，与临床生产过程更紧密地保持一致可能需要在早期开发阶段使用悬浮培养物。基于这些观察结果和在悬浮液中实现更高细胞密度的优势，采用24深孔系统在小型悬浮培养物（mini-HT24）中生产rAAV。该系统经过了广泛的验证，在整个板上显示出一致的vg/mL和vp/mL滴度，以及均匀的VP蛋白表达和比率（图3A-E）。事实上，与微型 6 孔格式（每孔 5 × 105 个细胞）相比，在 mini-HT24 设置中实现的更高细胞密度（3 × 106 个细胞/mL）导致更高的 rAAV 滴度，如图 3F 所示。这凸显了基于悬浮液的系统的一个关键优势，它不受培养容器表面积的限制。然而，实施此类系统需要专门的设备，而这些设备可能并非所有实验室都可用。最后，建议使用AMBR15或AMBR250等微型生物反应器系统进一步验证来自mini-HT24系统的已鉴定的先导分子或优越的培养条件，因为这些系统已被证明可以更接近地模拟大型生物反应器中的生产条件46,47。

纯化水平的选择在确定 rAAV 制剂是否适合特定下游应用方面起着至关重要的作用。源自贴壁（micro-6孔）和悬浮培养物（mini-HT24）的粗裂解物为初步筛选测定提供了快速且资源高效的选择。这些裂解物含有病毒颗粒、细胞碎片和培养基成分的混合物，可用于载体基因组/颗粒滴度、转导效率筛选和蛋白质印迹分析等应用。特别适用于解决基本生物学问题的研究（如上文在AAP功能研究中所示）、细胞培养条件优化以及临床前候选药物筛选和选择。然而，杂质的存在可能需要更高的稀释度，从而导致测定灵敏度降低。此外，杂质可能会对敏感细胞类型（例如原代细胞）的活力产生负面影响。

与粗裂解物相比，仅用于基于悬浮液的方案中的AAVX亲和树脂纯化制剂通过选择性分离完整的衣壳来实现更高的纯度水平。这克服了粗细胞裂解物的局限性，使这些制剂更适合 体内研究等 应用，以及转基因表达动力学的详细体 外 分析，以及通常需要大量材料的精确功能读数（参见 图3F中的产量比较）。对于 体外 应用，在mini-HT24设置中产生的rAAV载体的产量通常足以满足大多数读数，具体取决于细胞数量和所需的MOI。相比之下， 体内 应用通常需要以中摇瓶规模或更大规模生产，具体取决于剂量、给药途径和动物模型。尽管纯化所需的成本和时间有所增加，但所得材料的一致性和可靠性通常证明对关键用例的投资是合理的。值得注意的是， 图4 所示的结果表明，使用亲和树脂方法纯化的rAAV载体的性能与通过传统氯化铯（CsCl）超速离心纯化的载体相当。这与之前的观察结果一致，即空衣壳要么对转导没有影响，要么甚至可能增强转导，具体取决于存在的 AAV 物种48。然而，值得注意的是，该实验仅使用了一个MOI和一个时间点，并且需要为每种细胞类型单独确定最佳条件。虽然 CsCl 纯化通常产生更干净的背景，但 HT 树脂尖端纯化的 AAV 在纯度方面表现出更大的差异（参见 图 4 中的 TEM 图像）。总的来说，这些发现进一步支持采用高通量、小规模的工作流程。

在高通量纯化中使用小规模亲和树脂填充吸头为快速 rAAV 筛选提供了实用的解决方案，但需要注意几个技术方面以确保结果可靠。由于树脂床体积有限，这些吸头特别容易堵塞，尤其是在处理粗裂解物时。因此，通过高速离心澄清裂解物对于在上样前去除细胞碎片至关重要，因为澄清不足会降低流速并影响产量。对于 mini-HT24 设置，建议优化转染方案并将每孔的最大工作体积保持在 2.5-3 mL。当使用各种血清型或衣壳文库时，建议测试不同的亲和树脂类型，因为结合效率和回收率可能因衣壳结构而异49。手持式电子多通道移液系统允许在小型实验室中轻松集成此工作流程，无需自动化即可提供灵活性。然而，手动处理可能会引入可变性和批次间差异。为了获得更高的一致性，自动化液体处理平台可能会有所帮助。在样品和缓冲液添加过程中应特别注意避免交叉污染，并且使用具有足够孔容积的适当板形式对于防止溢出至关重要。通过解决这些考虑因素，包括样品澄清、方案优化、树脂选择和仔细移液，研究人员可以最大限度地减少技术问题，并增强高通量、小规模亲和纯化工作流程的稳健性和可重复性。

总之，高通量、小规模 rAAV 生产方法与特定应用纯化策略的结合为推进基因治疗研究提供了一个多功能平台。这些协议满足了对经济高效工作流程日益增长的需求，同时保持了满足不同实验要求的灵活性。通过平衡纯度、可扩展性和资源消耗之间的权衡，研究人员可以加速临床前开发并促进向临床应用的过渡。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Julia Fakhiri 感谢罗氏博士后奖学金的支持。电子显微镜数据是在罗氏冷冻电镜设施鹦鹉螺号采集的。我们感谢莫里茨·克拉森和卢博米尔·科瓦契克对该设施的运营和支持做出的贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 非缓冲盐水B. Braun，德国梅尔松根7647-14-5洗涤 II 缓冲液
1 M 盐酸Merck Millipore，美国马萨诸塞州伯灵顿1099700050缓冲液的pH调节
10x DNase I 缓冲液Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国AM8170GddPCR/dPCR
1M Tris-HCl，pH 值 9.0Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国J60707。美联社中和缓冲液
24 深孔微孔板Enzyscreen，Heemstede，荷兰CR1424cl悬浮培养设备
250 mL 聚碳酸酯锥形瓶，带排气盖康宁，纽约，纽约，美国431144悬浮培养设备
66 - 440 kDa 分离 8x25 毛细管滤芯BioTechne，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国SM-W008型自动蛋白质印迹试剂盒
96孔2.2 mL聚丙烯DeepWell Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国AB0661样品处理和储存板
96孔黑色/透明底板，TC表面Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国165305转导测定
AAV2 VP1，重组蛋白PROGEN，德国海德堡640823韦斯试剂
AAV2 VP2，重组蛋白PROGEN，德国海德堡640824韦斯试剂
AAV2 VP3，重组蛋白PROGEN，德国海德堡640825韦斯试剂
AAV2 Xpress ELISAPROGEN，德国海德堡PRAAV2XP用于HT树脂纯化样品。
Wes 防鼠检测模块BioTechne，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国DM-002型自动蛋白质印迹试剂盒
检测/模板特异性正向引物习惯习惯ddPCR/dPCR
检测/模板特异性探针习惯习惯ddPCR/dPCR
检测/模板特异性反向引物习惯习惯ddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - 液体FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC， 加利福尼亚州圣安娜， 美国NC1192689悬浮细胞培养培养基
牛血清白蛋白 SERVA 电泳，海德堡，德国c牛血清白蛋白贴壁细胞培养基的补充剂
透气人造丝薄膜，无菌 VWR International LLC，美国宾夕法尼亚州拉德诺391-1262悬浮培养设备
C1000 热循环仪Bio-Rad Laboratories，美国大力神1851096ddPCR
CaptureSelec AAVX 配体泄漏 ELISA 试剂盒Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国8113522000ELISA检测
Cedex HiRes 分析仪 罗氏控股股份公司，瑞士巴塞尔5650216001细胞计数器
CELL 培养微孔板，96 孔Greiner Bio-One，克雷姆斯姆ünster， 奥地利655162一种成熟的细胞培养设备
柠檬酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯5949-29-1纯化试剂;谨慎
基于CMOS的TEM相机TVIPS XF416 Tietz Video and Image Processing Systems GmbH，德国吉尔兴XF416 视频和图像处理系统
指南针软件（版本 6.3.0）BioTechne，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国WES 软件
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板康宁，纽约，纽约，美国  3516一种成熟的细胞培养设备
ddPCR液滴发生器油 Bio-Rad Laboratories，美国大力神#1864110ddPCR试剂
ddPCR液滴酶标仪油 Bio-Rad Laboratories，美国大力神#1863004ddPCR试剂
用于探针的 ddPCR 超混料（无 dUTP） Bio-Rad Laboratories，美国大力神#1863023ddPCR试剂
DMEM，关于高葡萄糖的标准Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国11960044贴壁细胞培养培养基
DMEM，关于低葡萄糖的标准Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国11885084贴壁细胞培养培养基
DNA 低结合 96 孔板Eppendorf， 汉堡， 德国30129504ddPCR/dPCR
DNA 低结合管Eppendorf， 汉堡， 德国30108051ddPCR/dPCR
DPBS的Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国14190094洗涤缓冲液
电磁网格（T600H-Cu 698 l/inch Hex. 网眼细棒;EMS）电子显微镜科学，美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德FFTH600-铜-UL电子显微镜分析
EVO M5000 成像系统Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国AMF5000用于转导测定的活体成像显微镜
EZ 标准包 3BioTechne，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国PS-ST03EZ-8型自动蛋白质印迹试剂盒
Falcon 15mL 锥形离心管Fisher Scientific，德国施韦特11507411来样加工
Falcon 50mL 锥形离心管Fisher Scientific，德国施韦特10203001来样加工
Geltrex 不含 LDEV 的低生长因子基底膜基质Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国 A1413201培养板包衣
GlutaMAX 补充剂（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国35050061贴壁细胞培养基的补充剂
HEK293AThermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国型号 R70507转导测定（仅限研究用途）
HEK293TATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯CRL-3216型Adeherent 细胞培养，用于生产 rAAV（仅供研究使用）
HEPES 溶液，1M默克公司，德国达姆施塔特#H0887贴壁细胞培养基的补充剂
HL-盐活性核酸酶，SAN（25 U/&μ;L)ArcticZymes Technologies， Tromsø， 挪威70910-202ddPCR/dPCR
HydroSpeed 微孔板清洗机Tecan，Männedorf， 瑞士30190101ELISA检测
iCell 星形胶质细胞试剂盒，01434FUJIFILM Cellular Dynamics， Inc.，美国威斯康星州麦迪逊市R1092转导测定
iCell 运动神经元试剂盒，01279FUJIFILM Cellular Dynamics， Inc.，美国威斯康星州麦迪逊市R1051转导测定
无限 200 PROTecan，Männedorf， 瑞士30213617ELISA检测
JEM-1400Plus是一种透射电子显微镜JEOL Ltd.，日本东京明岛JEM-1400加透射电子显微镜
带销的低蒸发夹层盖Enzyscreen，Heemstede，荷兰CR1224c悬浮培养设备
酶标仪 光谱 i3Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞i3xELISA检测
小鼠抗-AAV2 VP1/VP2/VP3单克隆抗体PROGEN，德国海德堡690058韦斯试剂
无核酸酶水 Roche Diagnostics GmbH，德国曼海姆3036430103ddPCR/dPCR
Opti-MEM，还原血清培养基 Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国#31985070PEI-DNA 复合物形成培养基
PBS Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国#10010023洗涤缓冲液
PEI-MAX， 聚乙烯亚胺，1mg/ml 储备液欧洲理科学院， Hirschberg an der Bergstraße， 德国24765 或 24765转染试剂
培根专业版Polyplus，伊尔基希-格拉芬施塔登，法国101000033/10毫升转染试剂
Pierce 微透析板，96 孔，0.3 mL，20K MWCOThermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国A50472净化设备
泊洛沙姆 188Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯P5556-100毫升细胞培养试剂;谨慎
聚左旋鸟氨酸溶液 （0.01%）西格玛-奥尔德里奇A-004-M转导测定
蛋白酶 K 溶液 （20 mg/mL）Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国25530049ddPCR/dPCR
蛋白质简单”韦斯”BioTechne，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国004-600自动蛋白质印迹装置
QIAcuity Eight平台系统Qiagen， 希尔登， 德国911052dPCR
QIAcuity 纳米板 8.5k 96 孔Qiagen， 希尔登， 德国250021ddPCR/dPCR
QIAcuity 探针 PCR 试剂盒Qiagen， 希尔登， 德国250101、250102或250103ddPCR/dPCR
QIAcuity 软件套件 1.2Qiagen， 希尔登， 德国dPCR 软件
QX经理 Bio-Rad Laboratories，美国大力神ddPCR 软件
QX200 液滴读数器Bio-Rad Laboratories，美国大力神1864003ddPCR
螺旋盖微管，1.5 ml，PCR 性能测试萨斯泰特，Nümbrecht， 德国72.703.416悬浮培养设备
螺旋盖，DNA LoBind，5.0 mLEppendorf， 汉堡， 德国30122348悬浮培养设备
摇床培养箱Infors AG，瑞士博特明根多创悬浮培养设备
丙酮酸钠 （100 mM）Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国11360070贴壁细胞培养培养基
超声仪微孔板喇叭系统QSonica，美国康涅狄格州纽敦Q700MPXC用于生成粗裂解物的超声仪
精神SPIRIT数据库链接：https://spirit.cladiac.com/aav.html 
Steriflip-GP 无菌离心管顶过滤装置Merck Millipore，美国马萨诸塞州伯灵顿SCGP00525缓冲液制备设备
T-175，细胞培养瓶，550 ML，175 CM²Greiner Bio-One，克雷姆斯姆ünster， 奥地利660175一种成熟的细胞培养设备
胰蛋白酶/EDTA 0.025%Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国R001100细胞培养试剂
病毒生产细胞 2.0 （VPC2.0）Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国A49784 或 A51218rAAV生产
J63596。K2工作溶液PBST稀释1：10

参考文献

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