基于微生物反应器的锚固依赖间充质间质细胞的生产，为急性呼吸窘迫综合征做准备

摘要

描述了一种针对锚定依赖细胞的微载体-微生物反应器生产的方案，作为潜在的基于细胞的治疗方法。针对急性呼吸窘迫综合征的应用场景，展示了相对于基于瓶的工艺条件，其细胞产率相当且基因表达良好。该协议可扩展至其他锚固依赖细胞和靶标适应症。

摘要

细胞疗法是一种针对多种健康状况的新兴治疗方法。然而，生产足够数量的高质量电池仍是一个活跃的科学和技术挑战。最终的细胞产物无法被灭菌;因此，无菌性和设计质量的考量至关重要。对于依赖锚固的细胞，基于瓶子的扩增仍被用于发育和工业规模，需要较大的物理足迹，限制对生化环境（pH、_CO2和氧气、营养物质和代谢物扩散梯度）的控制，并提供影响最终细胞质量的物理线索。这些挑战促使采用基于生物反应器的制造方法，但此类方法通常以体积规模进行，带来挑战，且对探索性台式研究或工艺开发来说成本过高。据报道，微生物反应器-微载体细胞疗法的生产在培养过程中为细胞源类型——间充质间质细胞的测试案例提供生化控制。在体外细胞质量初步评估中，急性呼吸窘迫综合征被视为潜在应用场景。此处所示的方法因微生物反应器体积小（2 mL）且生化控制严格，能够在台式上快速开发工艺。为了实现锚定依赖型细胞类型（如间充质间质细胞），需要对微生物反应器工艺进行重大改造，并采用了内部通过微流控工艺生产的明胶微载体平台。本文详细说明了在微生物反应器中培养此类锚定依赖细胞的方法和工艺参数，旨在使其他研究人员能够根据自身的应用场景和细胞源类型进行调整。

引言

将活细胞作为治疗产品，最近已成为多种健康挑战的有前景的新治疗选择。例如，嵌合抗原受体（CAR）T细胞为所谓液体癌症患者带来了持久的缓解——白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤——这些癌症对以往所有可用治疗无效。¹.最近，一种间充质干细胞/基质细胞（MSC）产品（Ryoncil）获批用于治疗患有类固醇难治性急性移植物抗宿主病（SR-aGvHD）的儿童，该病死亡率>为50%。但要扩展到其他未被满足的临床需求，则需要对治疗方法及其开发和制造该产品的手段进行密集开发。

其中一种未被满足的临床需求出现在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者身上。本文讨论ARDS旨在提供一个具体的用例，以说明方法、结果以及可能扩展到其他疾病靶点的讨论。作为一个关键（从小时到几天的进展）、普遍存在（美国每年>20万例病例）且致命的适应症（死亡率为27%-46%，视表现严重程度而定），在COVID-19大流行期间，ARDS作为感染SARS-CoV-2患者的典型死亡机制重新引起广泛关注 ^3,4.ARDS的特征是肺血管通透性增加，导致间质性水肿、肺泡充盈，以及包括中性粒细胞和红细胞在内的细胞成分浸润到^{肺泡腔室5}。在ARDS的初期渗出阶段，先天免疫细胞介导的炎症通过破坏内皮和上皮屏障完整性，并通过分泌促炎细胞因子促进免疫细胞招募和激活，推动这些致病结果;炎症反应的成功解决、屏障完整性的修复以及避免过度纤维化对生存至关重要³.尽管瑞德西韦等抗病毒疗法在对抗SARS-CoV-2介导的ARDS方面显示出希望，但对于其他病因，目前尚无获批的药物干预措施能降低^{死亡率5。}

鉴于MSC在全身注射时具有肺部特异性嗜好性，且能向周围^{微环境分泌}免疫调节信号，可能为治疗ARDS提供了有前景的途径^6,7。机制性研究表明，白介素-10（IL-10）⁸、吲哚胺2,3-二氧合酶1（IDO1）⁹、前列腺素E2（PGE2）¹⁰等的副分泌因子的表达，有助于推动多种适应症（包括急性肺损伤（ALI）/^ARDS11）的MSC治疗效力;因此，这些基因产物的表达水平代表了潜在的关键质量属性（pCQAs），可能预测临床疗效，为最终细胞产物在制造过程中提供可作的释放标准。然而，制造足够数量的细胞以达到有效的治疗剂量是一项挑战;例如，Ryoncil适用于2 x 10、⁶细胞/公斤患者质量的剂量，每周两次，持续4周¹²。对于一个80公斤的患者来说，单次治疗相当于>12亿个MSC，需要较大的物理足迹以容纳足够的表面积以适应这种二维生长状态。鉴于该活细胞产品在患者给药前无法进行灭菌，否则会损害细胞的治疗潜力，因此利用现行良好生产规范（GMP）规范进行无菌生产至关重要，这增加了细胞制造的物流复杂性，进而增加商品成本¹³。

此外，先前研究表明，组织培养聚苯乙烯（TCPS）瓶中典型的MSC产生有助于导致群体内表型异质性的出现。对于某些终端用途，这使批次间的质量控制在研究和临床转化中变得具有^挑战性。据推测，TCPS瓶中有限的生化防治能力，包括气体、养分和代谢废物的扩散梯度、pH调节不佳等，加剧了这些挑战。

这些问题促使采用基于生物反应器的培养，以利用受控三维生长格式中更优越的生化调控和细胞密度，采用动态混合¹⁸。然而，基于生物反应器的加工或制造也存在一系列挑战：作为依赖锚定的细胞类型，MSCs需要某种底物才能在生物反应器中生长，因此需要添加微载体。此外，许多市售生物反应器在大量资源消耗极大（>3升培养基）下运行，用于探索性台式研究，以识别和完善影响细胞质量可测量指标表达的未知工艺参数。这些特征被称为潜在关键质量属性（pCQAs¹⁹）。

Krupczak等人此前报道了一种微载体-微生物反应器方法，能够产生具有改善pCQA表达的MSCs，适用于ARDS，仅限于体外评估²⁰。该方法结合了自制的可溶解明胶微载体平台与市售的Mobius Breez微生物反应器²¹型。该微生物反应器采用2 mL一次性反应器腔室，并具备许多有助于提升生化控制的优良功能，包括在动态混合闭环灌流供给系统中调节温度、pH值、_CO2和氧气，但设计时并非以锚定依赖细胞为前提，如MSCs。事实上，用于注入反应堆内容物的标准微流控通道过小，无法允许微载流子通过，因此需要大量适应才能成功生产该平台的MSC。

本文描述并展示了详细的方案，旨在将该微生物反应器适配为锚定依赖的MSC培养。本文报告的工艺参数旨在为MSC的工艺开发和制造提供参考，用于临床前体外评估ARDS治疗效果。然而，原则上，该方案可适配于其他终端用户应用、其他炎症或免疫调节相关疾病，以及其他依赖锚固的细胞类型，这些类型在实验台上可通过增强生化控制而受益。图1对附带视频中描述的协议进行了示意，图2、图3和图4展示了关键结果。

方案

1. 微生物反应器的设置与制备

1. 制备所需数量的微生物反应器消耗品
   1. 确保生物安全柜（BSC）开启并保持无菌状态。通过刺破袋口取下覆盖新耗材的锡箔袋，并保留锡箔袋直到实验结束（以记录批#的详细信息以备缺陷）。打开外部泡泡包装，丢弃里面的水袋。扔掉外部的泡泡包装。
   2. 用70%乙醇喷洒内部泡泡包装，然后带进BSC。打开内部泡壳包装并丢弃。
   3. 使用无菌注射器，取出活塞，将喷嘴连接到0.22微米无菌滤器。将50毫升未经消毒的超纯水倒入注射器桶中。在将注射器放在等待的无菌50毫升管上时，将活塞重新插入注射器，并将无菌过滤水注入等待的收集管。
   4. 取下连接瓶架上与瓶子LL的透明塑料盖。使用新的无菌50毫升注射器，取下活塞，将喷嘴连接到LL瓶。将无菌过滤水倒入注射器桶，注入LL瓶。
      注意：无针连接口在制造商消毒过程中可能会卡住，因此您可能需要多次连接和断开注射器，才能打破瓶封并成功注入内容物。或者，你也可以用管焊机将源瓶以无菌方式连接到可焊接管上，以匹配合适的瓶子。
   5. 使用相同程序，瓶L装入25毫升非FBS补充的低葡萄糖DMEM，瓶装R瓶25毫升无菌PBS，瓶装8毫升抗粘着冲洗液。每种液体都用新的无菌注射器。
   6. 对实验中所需的消耗品重复此程序。
2. 在本次实验所用的每个POD中进行一次POD自测。
   注意：自测应顺利完成;如果自测的某个组件失败，应先解决该故障后再继续。
3. 将自测盒放入防光储物袋中。
4. 将消耗品安装到生物反应器上，如下述。
   1. 将耗材阀门上的绿色胶带取下，并将其安装到POD中。重新安装夹具，确保没有气体或空气泄漏时发出嘶嘶声。
   2. 连接白色瓶架压力传感器管线、红色气压管线和蓝色真空管线，连接消耗品和基站/POD。确保侧面注射口用白色泪滴形夹紧。
   3. 按照软件步骤启动新实验。这些功能最终以自动加油和校准功能收尾，耗时约4-5小时，且可通宵运行。
5. 在每个瓶架上标注其POD位置，方便区分取出后应归还哪个POD。用彩色胶带标示位置：Pod0 = 红色，Pod1 = 橙色，Pod2 = 黄色，Pod3 = 绿色。在磁带上写实验名称和日期。
6. 让消耗品过夜校准。确保介质能够进入反应器并排出废弃管线。
7. 如果计划使用液氮储存的细胞，先解冻并镀层，这样在注射前有24小时>从冷冻保存中恢复。

2. 重新校准与微载流子制备

1. 确保自动灌注和校准步骤已成功完成。
   1. 如果校准未能成功完成，应识别并修复任何根本原因，然后尝试重新校准。常见问题包括未拆除白色瓶架夹、未在放入POD前拆除耗材上的绿色胶带，以及介质瓶内介质容量不足。
2. 确保溶解氧传感器稳定。
   1. 校准后，近10%的耗材在DO传感器中会出现传感器漂移。执行首选的纠正措施，即重新进行完整校准。如有需要，请执行以下一项。
      1. 确认磁带内没有空气，然后取消勾选显示控制的显示 图 复选框，然后点击 自动校准DO和pH。
         1. 如果需要重新校准时反应堆内有空气，请点击窗口左上角的 蓝色左箭头 ，返回MBS仪表盘的首页，针对该特定POD。点击 按钮 启动手动作。勾选废 物管准备 框，并在文本输入框中输入W以选择废物瓶。点击 弹出洗 涤按钮，然后在弹窗中点击“是”。这将排空反应堆室，并从介质源瓶中补充介质。
3. 在15 mL锥形管中准备正确数量的微载体，每种病症各一个。
   注意：微载流子数量、骨料表面积和细胞种子密度将取决于您的应用。建议注入绝对数量的微载体，达到75 cm^² 的可用微载体生长面积，以与T75瓶进行比较。
4. 让微载流子在管内沉淀;在不去除微载体的情况下，尽可能多地抽取上清液，以便为细胞和新鲜培养基腾出空间。

3. 单元和微载体注入

1. 确保自动主控和校准功能成功完成。
2. 点击软件窗口，就像按照标准的悬浮单元流程进行接种一样。
3. 在弹窗中输入注示此阶段未发生细胞注入。
4. 手动作暂停反应器混合，并在瓶架管线上加装白色C型夹。
5. 取出每个消耗品并转移到BSC。将废弃的滤材从废弃和灌注瓶中取出并丢弃。
   1. 如果你计划在研究的任何阶段采集调质培养基，务必清除大灌注瓶内所有废物，以及灌注瓶内较小的1.5毫升管子。
6. 取出未添加血清的生长培养基并丢弃。用~20毫升无菌PBS冲洗L瓶后丢弃。在L瓶中加入25毫升血清补充培养基。
7. 把消耗品放回各自的POD。在实验剩余时间内将媒体源瓶冰藏保存。每天补充冰块。
   注意：湿冰可以搭配冷冻袋来延长温度控制时间。
8. 用PBS冲洗反应堆并冲洗管线。
   1. 点击冲 洗瓶 子按钮，启用瓶子L 的单选 按钮，选择 输出废弃物，然后点击 开始冲洗MSC血清。
      注意：这将使新加入的hMSC介质通过该管线，确保不再有非FBS补充介质进入反应堆。
   2. 再次点击 冲洗瓶 子按钮，选择“瓶子回收” 的单选 按钮，开始冲水。这样可以将防粘着冲洗液冲刷过管线，确保其为进入反应器做好准备。
   3. 在瓶子内容窗口中，在软件中注明MSCserum位于瓶子R中，而该瓶实际上包含PBS。
   4. 进入手动作，对废水瓶进行三次抛出-清洗循环。
9. 向反应器添加抗粘附冲洗液。
   1. 回到瓶中内容物窗口，标注MSCserum位于瓶子RR，实际上瓶中含有抗粘着冲洗液。
   2. 进入手动作，对废水瓶进行一次抛出清洗程序。
      注意：之前的PBS洗涤是为了防止DMEM中的任何组件干扰抗附着洗涤;现在，反应器应充满含有微量PBS的抗附着冲洗液。
10. 30分钟后，使用防粘附溶液，用PBS冲洗耗材。
    1. 在瓶子内容窗口中，在软件中注明MSCserum位于瓶子R中，而该瓶实际上包含PBS。
    2. 进入手动作，对废水瓶进行三次抛出-清洗循环。
    3. 回到瓶子内容窗口，在软件中注明MSCserum位于瓶子L中，瓶子L包含hMSC培养基。
11. 清空反应器，等待注入电池和微载流子。在手动作面板中，点击 “再接种 ”，并让系统停留在仪表盘指示接种反应堆的阶段。
    注意：这里的“接种”一词仅指将用于扩殖的细胞注入微生物反应器。
12. 添加额外的电阻以调制混频速度，使其与默认的R0电阻保持一致。
13. 从瓶子里取出细胞，用血细胞计计数。在BSC中进行所有开放手术以确保无菌。
    1. 吸取培养基，然后用5-10毫升预热PBS清洗。抽取PBS，向瓶中加入5毫升胰蛋白酶+ EDTA。
    2. 在37°C下培养5分钟，或直到所有细胞明显从烧瓶表面抬起。
    3. 加入10毫升预热的hMSC培养基以中和胰蛋白酶活性。取出液体内容物，放入15毫升离心管中。
    4. 以300 x g 离心机分离细胞5分钟。丢弃上清液，将细胞沉淀重新悬浮在适当体积的hMSC培养基中进行计数。对于完全融合的T75瓶，合适的容量通常为2-4 mL，这可产生每毫升约1-2E6细胞的细胞浓度。
    5. 将悬浮细胞样本与等量的Trypan Blue活性染料混合，并将混合物放入血细胞计计数。按照制造商的说明数电池。
14. 计算达到15万个细胞所需的细胞溶液体积，并将这些溶液移入等待的15毫升锥形管中，内含每种条件的微载体。将管内容量补充到2.2到2.5毫升之间，加入新鲜温热的hMSC培养基。
    注意：每个15 mL锥形装置的体积应略大于2 mL，这样注入时反应器会略微过满以避免气泡，气泡将在后续步骤中进行平衡。
15. 在T75烧瓶控制中加入相应体积的细胞。
16. 一次处理一到两个消耗品，把消耗品从POD中取出并带入BSC。
17. 用绿色4英寸钝针在5毫升注射器中取出细胞和微载体。将细胞和微载体注入反应器。
18. 将消耗品返回基站，重复此过程直到所有消耗品都注入完毕。
19. 点击 软件窗口 表示接种已完成。当软件返回正常主页时，移除消耗品输出线上的白色夹具。
20. 进入手动作，执行“弹出多余”功能，输出端口设置为P进行灌注。启动静态混音模式，使用1680秒开启和120秒关机。静电混音时，保持混频频率在5赫兹。
21. 关闭光学密度参考测量。
    1. 打开MBS客户端并点击 连接。请输入引号中包含的以下命令：“ dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1”
    2. 点击 发送，等待命令成功发送的确认，然后关闭MBS客户端。
22. 24小时后，关闭静态混音模式，重新启用正常混音。将混音频率降低到1.5 Hz。

4. 微生物反应器运行

1. 每天监测微生物反应器，确保没有问题干扰实验。确保培养基源瓶保持>5毫升培养基，以顺利灌注反应器。
2. 根据需要更换冰桶，以保持介质瓶的温度控制。保持防光帘覆盖在微生物反应器前端，以防止挥发性介质成分因光而降解。
3. 确保没有气泡进入反应堆。别忘了定期更换TCPS烧瓶控制中的介质。

5. 微生物反应器收获

1. 确保BSC无菌并准备运行。
   1. 将以下所需试剂在珠子或水浴中加热至37°C：~25毫升温热的hMSC培养基，10毫升温热的PBS，以及1.5毫升10 mg/mL的Pronase，用于收获。
2. 准备瓶架以供收获。
   1. 在软件中为每个POD启用手动作模式。
   2. 用白色C型夹在管线的净空部分夹住消耗品输入线。
   3. 把消耗品移到BSC上。取出废弃物瓶内的内容物并丢弃。
   4. 用~20毫升PBS冲洗废液瓶后丢弃。评估培养基瓶内剩余的体积，必要时补充新鲜（冷）hMSC培养基。
      注意：这里需要>4毫升培养基才能完成收获所需的三次喷出洗涤循环。
   5. 在废液瓶内衬~5毫升冷的hMSC培养基以缓冲收集液体。
3. 从微生物反应器中提取细胞。
   1. 使用1毫升注射器，抽取200微升10 mg/mL的Pronase，并吸入约300-400微升空气。
   2. 拧开侧口喷油管盖，向无针阀接头喷70%乙醇。拆除固定打结侧口喷射管的胶带，解开结。解开白色泪滴夹。
   3. 连接1毫升注射器，轻柔地将Pronase注入反应器。用空气将液体沿注入管线推进，确保所有液体内容物都送入反应器。
   4. 重新接合泪滴形夹，重新盖上侧口喷油管。将耗材放回POD，重新连接所有管线，移除白色C型夹，继续混合。
   5. 确保废水瓶和介质瓶都被冰封保存。开始一个5分钟的定时器，让Pronase消化反应器内的微载流子。
   6. 5分钟后，通过确认微载流子在反应堆中已不再可见，确认它们是否已经降解。如果微载体仍然可见，则预留一分钟进行消化。如果没有微载流，继续。
   7. 采集细胞。进入手动作模式，将循环次数的#设置为3，输出端口设置为W以废弃，然后点击 “抛射清洗”。
   8. 抛出清洗程序完成后，将消耗品取回BSC，并用10或20毫升注射器取出废料瓶中的内容物。
   9. 将废物瓶中的内容物倒入一个15毫升的锥形离心管中。以300 x g 离心5分钟，抽取上清液，评估细胞颗粒大小。
   10. 将细胞沉淀重新悬浮在1-5毫升的培养基或PBS中，并在血细胞计上计数细胞数量。对所有消耗品重复这一步骤。
4. 用你平常的细胞培养方案采集瓶状的菌株。MSC的典型协议见3.13。

6. 分析微生物反应器条件和烧瓶条件下的细胞，用于下游应用

注：用于生成重点结果的分析方法简要如下，详见Krupczak、Farruggio和Van Vliet（2024）²⁰页。

1. 环境控制：利用微生物反应器提供的图形用户界面，在培养期间访问并显示消耗品各集成传感器的数据。这些数据包含在随微生物反应器附带笔记本电脑上的Breez Explorer软件中。
2. 细胞产量：如上所述采集MSC，并以300 x g 沉淀5分钟。小心去除上清液，并将细胞沉淀充分悬浮于适当容量的PBS或hMSC培养基（1-2毫升）中。取一块悬浮细胞混合物，与等量的锥蓝染料混合。将染色后的样品混合物微移液器移入血细胞计芯片，并用自动或手动血球计测量细胞数量和存活率。
3. 通过下文所述的两步逆转录定量聚合酶链反应检测基因表达。
   1. RNA纯化：使用RNeasy Mini套件，按照制造商说明从每个样品中分离和纯化RNA。简而言之，将细胞裂解，将细胞内容转移到纯化自旋管中，并用每个缓冲液清洗样本，去除可能干扰后续PCR的多余细胞成分、核酸和蛋白质。
   2. cDNA转换：使用高容量逆转录试剂盒和热循环器，按照制造商说明将纯化RNA转化为互补DNA（cDNA）。简而言之，解冻套件组件，通过根据采样数量将组件组合成主混音。将等量纯化RNA和各10微升的主混合液装入PCR板的每个孔中，同时注意追踪每个样本身份的位置。按照制造商的热循环仪方案完成逆转录反应。
   3. qPCR：使用经验证避免引子二聚体的外显子跨越序列引物，在384孔qPCR板上装载正向引物、反向引物、模板cDNA、无核酸酶水和主混合液，容量适中（通常为1 μL、1 μL、1 μL、7 μL、10 μL），并为每个基因和样本使用多个技术复制孔。如有必要，将内容分拆到多个板块以捕获所有基因靶点。确保特定基因靶标的所有样本都装入同一板块，以避免结果在板块间的差异，并且每个板块都有合适的管家基因和无模板对照。在合适的qPCR机上测量荧光强度，并使用ΔΔCt方法进行相对定量以计算基因表达。

结果

该微生物反应器使得在约10天的培养中对环境因素进行监测和调控。环境因素，包括pH值（图2A）、温度（图2B）、溶解氧（图2C）和二氧化碳（图2D），在微生物生物反应器条件下被精确测量和维持，但在培养期间的烧瓶条件下则未被测量。图2A-D中的数据展示了同一POD的代表性结果以便澄清，但迄今为止，已有30多个独立试验观察到pH、温度、溶解氧和二氧化碳稳定性的定量相似。pH值、温度、溶解氧和二氧化碳并未像标准细胞培养中常见的那样在烧瓶条件下测量;为了确认基于瓶子的TCPS条件相对较低的环境控制会导致这些指标的变异性，参考了类似时间尺度下的pH变异，详见

讨论

本方案描述了利用微载体-微生物反应器方法进行扩建、引发和收获细胞的方法。该工艺使得依赖锚定的细胞如MSC能够在生物反应器平台优越的生化控制下（相较于传统TCPS瓶）在台面上增加细胞数量，适合快速工艺开发。进一步，研究表明微载体-微生物反应器生成MSCs可形成引发的细胞表型，可能在治疗ARDS方面具有增强的治疗效力。

基于生物反应器的方法是为工艺开发和电池制造提供重要优势，包括监测和调节环境变量的能力，包括pH值、温度、二氧化碳和溶解氧。鉴于这些参数的波动可能对细胞产量和表型产生不利影响，缺乏这些功能的培养平台（包括传统TCPS瓶）可能产生质量和数量不稳定且不可预测的细胞批次。然而，大多数市面上为锚定依赖细胞培养设计的生物反应器平台，其运行量或规模不适合且成本过高，不适合探索性台式研究（例如，典型的小型搅拌罐生物反应器工作容积为~3升）。因此，该方案相对于现有方法的重要性在于能够采集细胞并提供有利的生物反应器特性——改进生化控制、减少开放作——在适合实验台研究、快速原型制作和研究工艺开发的作规模下实现。该方法使TCP...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗粘附冲洗液	干细胞技术	7010
生物安全柜
Breez微生物反应器	米利波尔西格玛
离心机
锥形管，15毫升
锥形管，50毫升
杜尔贝科改良鹰型中等低血糖	吉布科	11885084
乙醇
胎牛血清	吉布科	A5670701
血细胞计
实验室磁带
微载流子
微离心管，1.5毫升
显微镜
针，钝针，4英寸，18号	亚马逊	B0D663ZR6D
磷酸盐缓冲盐水	科宁	21-040-CM
普罗纳斯，来自灰链霉菌	米利波尔西格玛	10165921001
血清学移液器，10毫升	VWR	75816-100
无菌去离子水
注射器过滤器，0.22微米，无菌	Celltreat 科学产品	229762
注射器，1毫升	BD	309628
注射器，20毫升	BD	302830
注射器，5毫升	BD	309646
注射器，50毫升	BD	309653
组织培养聚苯乙烯瓶，T75	赛莫飞世尔科学	130190
特里潘蓝	西格玛·奥尔德里奇	T8154-100ML