基于微型生物反应器的锚定依赖型间充质基质细胞制备及其在急性呼吸窘迫综合征中的应用

摘要

本文描述了一种用于生产贴壁依赖性细胞的微载体-微型生物反应器方案，该细胞具有作为细胞治疗产品的潜力。以急性呼吸窘迫综合征为应用示例，本方案展示了与传统培养瓶工艺条件相比相当的细胞产量以及更有利的基因表达谱。该方案可拓展应用于其他贴壁依赖性细胞及不同的适应症。

摘要

基于细胞的治疗是多种健康状况下正在兴起的一种治疗策略。然而，生产足量且高质量的细胞仍然是当前活跃的科学与技术挑战。最终的细胞产品无法进行灭菌处理，因此无菌性以及基于设计质量（quality-by-design）的考量至关重要。对于贴壁依赖性细胞，目前在研发和工业规模上仍采用培养瓶扩增方式，这种方法需要较大的空间占用，限制了对生化环境（pH、CO₂ 和 O₂、营养物质与代谢物的扩散梯度）的控制，并提供可能影响最终细胞质量的物理信号。这些挑战推动了基于生物反应器的生产方式的应用，但此类方法通常在体积规模上带来操作难题，对于探索性的台式研究或工艺开发而言，可能成本过高。已有报道表明，利用微型生物反应器结合微载体进行细胞治疗产品的生产，可在培养过程中实现对特定测试细胞来源类型——间充质基质细胞的生化环境控制。为初步评估细胞在体外的in vitro质量，急性呼吸窘迫综合征被考虑作为一个潜在的应用场景。本文所展示的方法由于采用小体积（2 mL）和微型生物反应器内严格的生化控制，能够在台式规模实现快速的工艺开发。为实现贴壁依赖性细胞类型（如间充质基质细胞）在该系统中的培养，需对微型生物反应器工艺进行大量改进，并采用通过微流控工艺自主制备的明胶微载体平台。本文进一步详细阐述了在微型生物反应器中培养此类贴壁依赖性细胞所使用的方法及工艺参数，旨在帮助其他研究人员将这些实践方法适配至其各自的研究场景和细胞来源类型中。

引言

将活细胞用作治疗性产品，近年来已成为应对多种健康挑战的有前景的新治疗选择。例如，嵌合抗原受体（CAR）T细胞已使那些对所有既往可用疗法均耐药的所谓“液体肿瘤”——白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤——患者实现了持久缓解¹。最近，一种间充质干细胞/基质细胞（MSC）产品（Ryoncil）获批用于治疗患有类固醇耐药性急性移植物抗宿主病（SR-aGvHD）的儿童，该疾病的死亡率超过>50%²。然而，要将此类疗法拓展至其他尚未满足的临床需求，还需对治疗手段本身以及该产品的开发与制造方法进行深入研发。

一个尚未满足的临床需求体现在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者中。本文以 ARDS 为例，提供一个具体的应用场景，用以说明该方法及其结果，并探讨可能扩展至其他疾病靶点的应用前景。ARDS 是一种危重（数小时至数天内快速进展）、常见（美国每年病例超过>20万例）且致死率高（病死率为27%–46%，取决于病情严重程度）的临床病症，在 COVID-19 大流行期间，由于 SARS-CoV-2 感染患者的主要死因通常为 ARDS，该病重新受到广泛关注^3,4。ARDS 的特征是肺血管通透性增加，导致间质性肺水肿、肺泡积液，以及包括中性粒细胞和红细胞在内的细胞成分渗入肺泡腔

方案

1. 微型生物反应器的设置与准备

1. 准备所需数量的微型生物反应器耗材
   1. 确保生物安全柜（BSC）已开启并处于无菌状态。通过刺破新耗材外层铝箔袋顶部将其移除，并保留铝箔袋直至本实验结束（以便在出现缺陷时记录批号信息）。打开外部泡罩包装，取出并丢弃其中的水化包，随后丢弃外部泡罩包装。
   2. 用70%乙醇喷洒内部泡罩包装，并将其移入生物安全柜内。打开内部泡罩包装后丢弃。
   3. 使用无菌注射器，拔出活塞，并将喷嘴连接至0.22 µm无菌滤器。将50 mL未灭菌的超纯水倒入注射器筒内。手持注射器置于一个待用的无菌50 mL离心管上方，重新插入活塞，将经过滤灭菌的水注入该收集管中。
   4. 取下瓶架上连接至LL瓶的透明塑料帽。使用一支新的无菌50 mL注射器，拔出活塞，并将喷嘴连接至LL瓶。将灭菌过滤后的水倒入注射器筒内，然后注入LL瓶。
      ​注意：无针连接口可能在制造商的灭菌过程中发生粘连，因此您可能需要多次连接和断开注射器，以打破瓶口密封并成功注入液体。或者，也可使用管路焊接仪将储液瓶以无菌方式连接至相应瓶子的可焊接管路上。
   5. 采用相同方法，向L瓶中加入25 mL不含FBS的低糖DMEM培养基，向R瓶中加入25 mL无菌PBS，向RR瓶中加入8 mL抗黏附冲洗液。每种液体均需使用新的无菌注射器。
   6. 根据实验所需数量，重复上述操作处理其余耗材。
   ....

结果

微型生物反应器能够在培养过程中持续监测和调控环境因素，时间长达约10天。在培养期间，微型生物反应器条件下可精确测量并维持pH（图2A）、温度（图2B）、溶解氧（图2C）和二氧化碳（图2D）等环境参数，而普通培养瓶条件下则无法实现。为便于说明，图2A-D展示的是单个POD的代表性结果，但截至目前，在超过30次独立实验中均观察到了pH、温度、溶解氧和二氧化碳稳定性的定量相似结果。在培养瓶条件下未对pH、温度、溶解氧和二氧化碳进行测量，这符合标准细胞培养操作的常规做法；为证实TCPS培养瓶条件下的环境控制能力相对较弱，确实会导致这些参数出现波动，本文参考了类似时间尺度下的pH变化情况，总结于¹⁸。该研究.......

讨论

本方案描述了一种采用微载体-微型生物反应器方法扩增、启动并收获细胞的技术。该过程能够在台式规模下，利用生物反应器平台（相较于传统的组织培养塑料表面培养瓶）对间充质干细胞（MSCs）等贴壁依赖性细胞实现更优的生化调控，从而增加细胞数量，适用于快速工艺开发。此外，本文还证明了通过微载体-微型生物反应器生产的MSCs可获得一种启动状态的细胞表型，可能在治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）中表现出增强的治疗效力。

基于生物反应器的方法在工艺开发和细胞制造方面具有重要优势，包括能够监测和调控环境参数，如pH、温度、二氧化碳和溶解氧。由于这些参数的波动可能对细胞产量和表型产生不利影响，缺乏此类功能的培养平台（包括传统的组织培养处理塑料瓶，TCPS）可能产生质量和数量不一致且不可预测的细胞批次。然而，大多数市售的用于贴壁依赖性细胞培养的生物反应器平台其运行体积或规模不适合探索性的台式研究，且成本过高（例如，典型的小型搅拌罐生物反应器工作体积约为3升）。因此，本方案相较于现有方法的意义在于，在适合台式研究、快速原型构建和探索性工艺开发的操作规模上，实现了细胞收获并提供了生物反应器的优势特性——更优的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗黏附冲洗液	Stemcell Technologies	7010
生物安全柜
Breez 微型生物反应器	MilliporeSigma
离心机
锥形管，15 mL
锥形管，50 mL
杜尔贝科改良伊格尔培养基，低糖	Gibco	11885084
乙醇
胎牛血清	Gibco	A5670701
血细胞计数板
实验室封口膜
微载体
微量离心管，1.5 mL
显微镜
钝头针，4"，18号	Amazon	B0D663ZR6D
磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-CM
蛋白酶（源自灰色链霉菌）	MilliporeSigma	10165921001
血清移液管，10 mL	VWR	75816-100
无菌去离子水
注射器滤器，0.22 µm，无菌	Celltreat Scientific Products	229762
注射器，1 mL	BD	309628
注射器，20 mL	BD	302830
注射器，5 mL	BD	309646
注射器，50 mL	BD	309653
组织培养用聚苯乙烯培养瓶，T75	Thermo Fisher Scientific	130190
台盼蓝	SigmaAldrich	T8154-100ML