本实验方案描述了通过MALAT1对miR-200c-3p/SNAI2轴的调控作用，评估其在促进上皮性卵巢癌上皮-间质转化中的功能的方法。
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本实验方案描述了通过MALAT1对miR-200c-3p/SNAI2轴的调控作用，评估其在促进上皮性卵巢癌上皮-间质转化中的功能的方法。
长链非编码RNA MALAT1 通过涉及miRNA调控的内源性竞争RNA（ceRNA）机制，调控上皮性卵巢癌（EOC）中的上皮-间质转化（EMT）和转移。本研究旨在阐明MALAT1通过与miR-200c-3p和SNAI2相互作用影响EMT及转移行为的分子通路。在EOC细胞系SK-OV-3中，通过过表达或敲低对MALAT1的表达进行遗传学操控。分别采用Western blotting、划痕愈合实验和Transwell实验评估其对EMT相关蛋白水平、细胞迁移和侵袭的功能影响。生物信息学分析鉴定出miR-200c-3p是MALAT1和SNAI2的共同靶点。MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2轴进一步通过双荧光素酶报告基因实验和免疫荧光染色得以验证，以确认其直接的分子相互作用。MALAT1过表达使SK-OV-3细胞的迁移能力增强20%，侵袭能力增强5%，同时伴随SNAI2表达显著升高（P < 0.01）。相反，MALAT1敲低则抑制了这些表型。双荧光素酶报告基因实验确认miR-200c-3p可直接结合MALAT1和SNAI2（P < 0.001）。miR-200c-3p过表达通过下调SNAI2减轻了MALAT1驱动的EMT（P < 0.05），而恢复SNAI2表达则逆转了MALAT1沉默对转移的抑制作用。该实验方案表明，MALAT1作为ceRNA通过吸附miR-200c-3p，导致SNAI2去抑制，从而促进EOC中的EMT和转移。研究结果提供了新的机制见解，并确定MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2轴可能是抑制卵巢癌转移的潜在治疗靶点。
卵巢癌（OvCa）是一种隐匿性强且常在晚期才被诊断的恶性肿瘤。该病通常在无明显症状的情况下进展，直至进入晚期，其特征主要表现为在腹膜腔内快速侵袭性生长。这一病理过程通常伴有腹水、治疗反应性降低以及预后不良1。2018年的流行病学统计数据显示，全球约有29.5万例新诊断病例，死亡病例达18.5万例，反映出疾病负担持续上升的趋势2。尽管现代治疗方案已结合手术干预和药物治疗，但由于早期检测手段有限，加之存在转移和治疗耐药问题，长期生存率仍低于45%3。许多晚期患者常在治疗后12至18个月内出现复发4。这些临床现状凸显了发现具有临床意义的诊断标志物和治疗监测策略的迫切需求。因此，识别具有临床相关性的诊断标志物具有重要价值。
目前，研究人员发现人类基因组中有相当大比例能够转录生成长链非编码RNA（lncRNA）5。lncRNA不编码蛋白质，仅以RNA形式存在，并在细胞的多种生物学功能中发挥调控作用。lncRNA具有非保守性，并表现出高度组织特异性的表达模式6。值得注意的是，在多种癌症组织中已观察到特定lncRNA的过表达现象7。竞争性内源RNA（ceRNA）机制揭示了一种全新的RNA相互作用模式。众所周知，微小RNA（miRNA）可通过与mRNA的3'非翻译区（UTR）进行序列特异性结合，从而沉默基因表达。同时，非编码RNA（ncRNA）可竞争性地结合miRNA，阻碍其与靶基因的结合能力，进而影响基因表达8。目前，ceRNA机制是解释lncRNA调控功能最广为接受的假说。编码转录本、miRNA与调控性RNA之间的三向交互作用构成了复杂的分子网络，影响肿瘤的发生与发展9。
最初在非小细胞肺癌转移灶中被发现，MALAT1 已被证实是在多种恶性肿瘤中广泛高表达的长链非编码RNA10。在我们之前的研究中，发现上皮性卵巢癌（OvCa）组织中MALAT1的表达水平升高，并且其表达水平与OvCa的临床分期直接相关11。本文介绍了一种在上皮性卵巢癌（EOC）细胞系SK-OV-3中通过基因手段调控MALAT1表达的实验方案，并利用qPCR、蛋白质印迹（western blotting）、双荧光素酶报告基因检测等分子生物学实验，以及划痕愈合实验和Transwell实验等功能实验，评估其对上皮-间质转化（EMT）相关蛋白表达、细胞迁移能力及侵袭潜能的影响。本研究旨在阐明MALAT1通过与miR-200c-3p和SNAI2相互作用，调控EOC中EMT过程及转移扩散的分子机制。
目前研究lncRNA与miRNA相互作用的方法通常仅采用in silico预测工具，可能缺乏实验验证。在EMT调控研究中，传统的组织学方法可能无法提供详细的分子层面信息。本研究通过采用双荧光素酶报告基因检测进行实验验证，克服了这些局限性，从而更可靠地确认了预测的相互作用。此外，结合多种功能实验（如划痕实验和Transwell实验）以及分子生物学技术，能够在细胞和分子水平上全面理解EMT过程，其研究深度超越了单一实验方法所能提供的信息。
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细胞培养与转染
SK-OV-3 人卵巢癌细胞系在标准条件下培养。细胞培养于含 89% McCoy's 5A 培养基、10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素溶液的培养基中，置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱内。每 2–3 天更换一次培养基，当细胞融合度达到 80–90% 时，使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 进行传代。用于 MALAT1 过表达和 MALAT1 沉默（shRNA）的慢病毒载体、miR-200c-3p 模拟物、抑制剂及其阴性对照，以及靶向 SNAI2 的 siRNA 及其相应的对照 siRNA 均购自商业来源。转染实验中，将 SK-OV-3 细胞以每孔 5 × 104 个细胞的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 500 µL 完全培养基，过夜贴壁。按照生产商说明书，使用脂质体转染试剂（RRID: AB_2548650）进行转染。简言之，将核酸（miRNA 模拟物/抑制剂或 siRNA）和脂质体转染试剂分别用低血清培养基稀释，室温孵育 5 分钟后混合，再室温孵育 15 分钟以形成复合物。将复合物逐滴加入细胞中。转染 6 小时后，更换为新鲜完全培养基。转染后 24–48 小时收集细胞，用于后续分析。
实时荧光定量 PCR（qPCR）
使用RNA提取试剂，按照制造商说明书从培养的SK-OV-3细胞中提取总RNA。简言之，每6孔板的每个孔加入1 mL试剂裂解细胞，随后按照提供的操作步骤，使用商业化的RNA提取试剂盒分离RNA。采用分光光度计测定RNA浓度和纯度，选择A260/A280比值在1.8至2.0之间的样品用于后续实验。使用RT Master Mix（RRID: SCR_018597）对500 ng总RNA进行反转录，反应体系为20 µL。反转录热循环条件如下：37 °C反应15 min，随后85 °C加热5 s以灭活反转录酶。所得cDNA储存于−20 °C，待用。采用商业化的miRNA qRT-PCR检测试剂盒，在实时荧光定量PCR仪上进行定量实时PCR。每个反应体系为20 µL，包含10 µL 2x qPCR预混液、1 µL特异性引物（正向和反向，10 µM）、2 µL cDNA模板以及7 µL无RNase水。热循环条件为：95 °C预变性10 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性10 s，60 °C退火延伸30 s。通过熔解曲线分析验证扩增产物的特异性。采用ΔΔCt法计算基因表达水平，以内参基因GAPDH（mRNA）或U6 （miRNA）作为对照。所有反应均设三个重复，数据以均值±标准差（SD）表示。
注意：RNA提取试剂为危险化学品，具有腐蚀性，可能引起皮肤和眼睛刺激，应在通风橱中操作。含该试剂的废弃物应按照当地危险废物处理规定进行处置。
划痕实验
将 SK-OV-3 细胞以 5 × 104 个细胞/孔的密度接种于 24 孔板中，培养至细胞融合度达到约 90–100%，形成均匀的单层。随后使用 10 µL 无菌移液枪头在每孔中央的细胞单层上划出直线划痕。为确保一致性，所有孔中划痕操作均保持相同的角度和压力。划痕后，加入 PBS 轻柔洗涤两次以去除脱落的细胞。接着将细胞置于无血清的 McCoy's 5A 培养基中培养，以最小化增殖效应。分别在划痕后立即（0 h）、24 h 和 48 h 使用倒置显微镜在 10 倍放大下拍摄划痕区域的图像。使用 ImageJ 软件测量各时间点的划痕宽度，并以相对于初始宽度的伤口闭合百分比计算细胞迁移率。
Transwell 实验
将SK-OV-3细胞以每孔5 × 103 个细胞的密度接种至Transwell小室的上室（上室含200 µL 1%完全培养基，下室含1 mL 5%完全培养基），在37 °C、5% CO2 的湿润环境中孵育24小时后进行后续分析。孵育24小时后，取出小室，用PBS洗涤3次，随后用4%多聚甲醛（PFA）固定15分钟。PBS洗涤后，用1%结晶紫溶液对细胞进行染色。染色完成后，用PBS冲洗细胞，并在倒置显微镜下观察。
注意：结晶紫是一种生物染料，若被摄入或接触皮肤可能有害。操作时应小心谨慎，并根据当地法规妥善处理废弃物。
双荧光素酶报告基因检测
转染后的细胞在标准培养条件下（37 °C、5% CO2 的湿化环境）孵育48小时，随后进行裂解。孵育48小时后，细胞被裂解，并在4 °C下以5,000 × g 离心5分钟。取50 µL上清液转移至96孔板中，随后依次向各孔加入100 µL荧光素酶试剂和100 µL海肾荧光素酶试剂。使用Luminometer上的双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶和海肾荧光素酶活性。通过将海肾荧光素酶活性归一化至荧光素酶活性，以校正转染效率的差异。
免疫荧光检测
SK-OV-3 细胞在室温下用 4% PFA 固定 15 分钟，随后用 PBS 洗涤 3 次。为阻断非特异性结合，细胞在室温下用含 5% 正常山羊血清的 PBS 孵育 1 小时。阻断后，细胞在 4 °C 下与抗 E-cadherin（RRID: AB_2833860）、N-cadherin（RRID: AB_2837725）和 Vimentin（RRID: AB_2835318）的一抗抗体在 1:200 稀释比例下孵育过夜。次日，细胞用 PBS 洗涤 3 次，并在 37 °C 避光条件下与相应的荧光标记二抗 [抗小鼠 IgG-FITC（RRID: AB_2843438）和抗兔 IgG-FITC（RRID: AB_2843439）] 在 1:500 稀释比例下孵育 1 小时。
注意：多聚甲醛具有毒性，且为潜在致癌物。操作时应小心，佩戴适当个人防护装备（PPE），如手套和护目镜。含 PFA 的废弃物应作为危险废物处理。
统计分析
对于两组之间的比较，采用t检验；对于多组比较，则应用方差分析（ANOVA）。数据以均值 ± 标准差表示。统计学显著性定义为 *p < 0.05，**p < 0.01，以及 ***p < 0.001。所有实验均进行三次生物学重复（n = 3）。
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SK-OV-3细胞迁移与侵袭能力的调控 MALAT1
实验流程概述如下 图1. 为探究……的作用 MALAT1 在卵巢癌细胞迁移和侵袭研究中，我们在SK-OV-3细胞中调控了其表达。经敲低后 MALAT1，qPCR 确认了显著的抑制作用 MALAT1 水平（p < 0.05; 图2A）。划痕实验显示，SK-OV-3细胞的迁移能力下降了10%。 MALAT1 敲低组与对照组相比（p < 0.01; 图2B）。Transwell迁移实验进一步证实了这些结果，显示细胞迁移减少了2...
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卵巢癌（OvCa）是第五大常见的妇科恶性肿瘤，仍是女性健康的主要威胁2。然而，大多数病例在晚期才被发现，这显著限制了有效治疗的选择，导致总体生存率的改善极为有限12。癌症转移是上皮性卵巢癌（EOC）患者死亡的主要因素之一13。新兴证据表明，长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）在EOC的发病机制中发挥关键调控作用14。其中，lncRNA MALAT-1 和 miR-200 在包括卵巢癌在内的多种肿瘤中表现出异常表达模式15,16。然而，MALAT1 在卵巢癌中发挥其致癌作用的分子通路尚未完全阐明。
miRNA 在癌症生物学中以其肿瘤抑制功能而著称。相反，lncRNA 能够有效隔离 miRNA，使其无法结合靶 mRNA。这种...
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作者声明无任何利益冲突。
本工作由福建省自然科学基金项目（2021J011378）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm PVDF 膜 | Beyotime | FFP32 | |
| 全功能 miRNA qRT-PCR 检测试剂盒 | FulenGen | QP115 | |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | ST025 | |
| 化学发光底物 | 苏州海星生物科技有限公司 | TCH-C335 | |
| 化学发光底物 | Millipore | WBKLS0100 | |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | beyotime | RG027 | |
| 胎牛血清 | 苏州海星生物科技有限公司 | FBP-C550 | |
| 山羊抗小鼠 IgG FITC | Affinity | S0007 | |
| 山羊抗兔 IgG FITC | Affinity | S0008 | |
| Lipofectamine 2500 | 广州英信生物科技有限公司 | sj-lip-2500 | |
| MALAT1 干扰慢病毒 | 上海吉凯基因化学有限公司 | LV-MALAT1-sh | |
| MALAT1 过表达慢病毒 | 上海吉凯基因化学有限公司 | LV-MALAT1-OE | |
| McCoy's 5A 培养基 | 苏州海星生物科技有限公司 | GUMD-B305 | |
| miR-200c-3p 模拟物 | 上海吉凯基因化学有限公司 | mic-hsa-200c-3p | |
| 多功能酶标仪 | Perkin Elmer | Envision 2100 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | 苏州海星生物科技有限公司 | GUSA-R002 | |
| 磷酸酶抑制剂混合液 | GSbioth | GS1439A | |
| 一抗 E-cadherin | Affinity | BF0219 | |
| 一抗 N-cadherin | Affinity | AF5239 | |
| 一抗 Vimentin | Affinity | AF7013 | |
| PrimeScript RT 主混合液 | Takara | RR036A | |
| 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad | CFX96 | |
| 冷冻离心机 | eppendorf | 5810R | |
| RIPA 裂解缓冲液 | GSbioth | GS504A | |
| SDS-聚丙烯酰胺凝胶 | Beyotime | P0012A | |
| 二抗 山羊抗小鼠 IgG FITC | Affinity | S0007 | |
| 二抗 山羊抗兔 IgG FITC | Affinity | S0008 | |
| SNAI2 siRNA | 广州英信生物科技有限公司 | si-hsa-snail2 | |
| StarBase 数据库 | 中山大学 | http://starbase.sysu.edu.cn | |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | 鼎国生物 | BCA02 | |
| 细胞培养箱 | Heraeus | Hera cell 150 | |
| 成像分析系统 | Bio-Rad | GEL DOC 1000 | |
| 倒置显微镜 | Mshot | MI152-N | |
| RNA 提取试剂盒 | ECOTOP | EK-1328-50T | |
| TRIzol 试剂 | 广州英信生物科技有限公司 | T751379 | |
| 通用电泳电源 | wixscientific | WIX-EP600 |
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