用于透皮给药的基于CAGE的离子液体系统的开发、表征和评估

Summary

该协议讨论了制备基于CAGE的离子液体系统的标准化，以确保可重复性并简化不同科学实验室的整体工作流程。

Abstract

离子液体最近因其在药物递送中的应用而获得显着认可，特别是它们在实现皮肤药物渗透和增强药物渗透方面的潜力。除了增强阻隔渗透性外，离子液体还具有优异的溶剂化性能，解决了溶解难溶性药物的挑战。由于有机阳离子和阴离子之间的不对称性很大，这些官能盐在室温下保持液态。从应用角度来看，离子液体提供了一种有前途且高度可调的方法来服务于多个治疗领域。一种由胆碱和老叶酸 （CAGE） 组成的生物相容性离子液体，化学计量离子比为 1：2，在透皮递送多种活性药物成分（包括小分子、肽、蛋白质和核酸）方面具有巨大潜力。这对皮肤屏障功能的影响很小。在此，我们分享了CAGE的制备、表征和评估方法。使用核磁共振波谱、差示扫描量热法、用于含水量分析的卡尔费休滴定法以及猪皮肤的 离体 屏障相互作用研究显示了 CAGE 表征的代表性结果。

Introduction

皮肤是人体最大、最重要的器官，是抵御有害物质的保护屏障，同时还可以防止水分流失¹.同时，将药物涂抹在皮肤上并通过皮肤具有广泛的优势。与注射剂和口服给药相比，皮肤给药可提高患者的依从性并避免肝脏的首过代谢²。特别是对于皮肤病，皮肤给药的制剂在提供局部效果方面表现出色，减少全身暴露³。然而，皮肤几乎不渗透的性质极大地挑战了成功的皮肤输送⁴。人体皮肤由三个不同的层组成：表皮、真皮和皮下组织⁴.表皮是皮肤的外层，可进一步分为不同的亚层，角质层是最外层，主要由角质形成细胞组成。角质层是大多数分子的突出渗透屏障，抑制它们转运到皮肤的更深层⁵。这种屏障功能源于嵌入紧密堆积脂质排列中的角质细胞的存在，主要包括磷脂、甾醇和神经酰胺，通常称为^{实体结构6}。为了克服这种皮肤屏障，化学渗透增强剂 （CPE） 已被用于递送大分子，因为它们通过与角质层中存在的脂质和蛋白质相互作用来破坏角质层的结构⁷。

离子液体 （IL） 已成为下一代 CPE

Protocol

所有实验程序均按照欧盟指令 2010/63 进行，并获得丹麦兽医和食品管理局的批准（许可证号。DK-13-oth-931833）。

1.盐复分解反应制备CAGE

1. 天竺葵酸的再结晶（85% 纯度，摩尔重量 168.23 g/mol）
   1. 取一个 500 mL 圆底烧瓶并测量其重量。
   2. 在烧瓶中称取 40.0 克天竺葵酸。这相当于 0.2 摩尔的香叶酸。
   3. 在 70：30% （w/w） 的香叶酸中重结晶香叶酸：丙酮：向圆底烧瓶中加入 （40 g*0.85*0.30）/（0.70*0.784 g/mL） = 18.42 mL 丙酮。
   4. 取一个 5 L 烧杯，准备大约 0.5 L 干冰和乙醇。
   5. 将圆底烧瓶放入干冰-乙醇冷混合物中，不要旋转以允许外部冷却。当结晶达到平衡时，从固体/再结晶的香叶酸中倒出丙酮和杂质（大约对应于添加丙酮的体积，通常在 0.5-2 小时内）。重复此步骤 5-6 次以确保足够的纯度。
   6. 通过在真空下以 40 rpm 旋转蒸发至少 20 分钟或直到圆底烧瓶在接触时不再感觉冷来去除剩余的丙酮（丙酮在 20 °C 时的蒸气压为 240 mbar）。
   7. 称量并记下烧瓶和重结晶的香叶酸的质量。根据初始空烧瓶重量计....

Results

核磁共振光谱
该技术的目的是通过使用 ¹H 和 ¹³C NMR 波谱分析氢原子和碳原子的化学环境来确认 CAGE 的成功形成。由此产生的光谱提供了特征性的化学位移、分裂模式和积分值，反映了合成的 IL 的分子结构和组成。 图1 中的质子核磁共振谱证实了老叶酸与胆碱的摩尔比为2：1。这从积分值中可以明显看出，其中与香叶酸（9）相对应的峰用作校准的参考。结果，胆碱的积分值大约是老叶酸的一半，与预期的化学计量一致。

图1和图2中的NMR光谱证实了CAGE的成功合成，正如Zakrewsky等人之前所证明^的16。

Discussion

本工作中描述的CAGE的制备方法采用文献¹⁵。然而，重要的是要承认合成过程对各种外部因素很敏感，这些因素会影响最终产品的性能。因此，一旦准备好，就应使用核磁共振波谱等技术对 CAGE 系统进行表征，以确认 CAGE 的形成。

如图1所示，CAGE的质子谱图说明了每个分子的质子的化学位移。参考文献¹⁶中提供了¹H NMR和¹³C NMR光谱的详细峰分配。先前已有报道称，由于COOH，OH和H₂O基团之间的质子交换增强，水的存在可以增加¹H NMR中某些峰的相对强度¹⁶。核磁共振实验期间也可能出现的一些可能问题是由于管子脏而导致的宽峰的存在，由于样品浓度低而导致的信号差以及由于不正确的参考而导致的化学位移错误

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5毫米核磁共振管	西格玛·奥尔德里奇	41121705
丙酮	VWR	23L064039
铝制Tzero锅	TA乐器	90,16,83,901
水通装置	Biox 系统
布鲁克Avance III NMR	布鲁克		核磁共振光谱仪器
碳酸氢胆碱	西格玛·奥尔德里奇	C7519
皮节	齐默尔生物气象
差动扫描量热器	TA乐器
乙醇	VWR	23J314009
膨胀聚苯乙烯	保丽龙
弗朗茨扩散电池	PermeGear
凝霜酸	西格玛·奥尔德里奇	427764
嫁接胶带	副胶片
卡尔·费舍尔滴定器	梅特勒·托莱多	30252662
甲醇	VWR	85681.32
PBS	费舍尔科学	10388739
TA 通用分析 2000 软件	TA乐器		用于DSC数据分析的软件
TopSpin 软件	布鲁克		用于核磁数据分析的软件