基于CAGE的离子液体系统用于透皮给药的开发、表征与评价

摘要

本方案讨论了基于CAGE的离子液体体系制备过程的标准化，以确保不同科研实验室之间的可重复性，并简化整体工作流程。

摘要

离子液体因其在药物递送领域的应用而受到广泛关注，尤其在促进药物经皮渗透和增强药物透皮吸收方面展现出巨大潜力。除了能够提高皮肤屏障通透性外，离子液体还具有优异的溶解性能，可有效解决难溶性药物的溶解难题。由于其有机阳离子与阴离子之间存在显著的结构不对称性，这类功能盐在室温下保持液态。从应用角度来看，离子液体为多种治疗领域的药物递送提供了极具前景且高度可调的策略。由胆碱和香叶酸以1:2化学计量比组成的生物相容性离子液体（CAGE），在经皮递送多种活性药物成分（包括小分子、肽类、蛋白质和核酸）方面具有广阔应用前景，且对皮肤屏障功能影响极小。本文介绍了CAGE的制备、表征与评价方法，并展示了采用核磁共振波谱、差示扫描量热法、卡尔·费休滴定法进行水分含量分析等技术对CAGE进行表征的代表性结果。 离体 猪皮屏障相互作用研究

引言

皮肤是人体最大且最重要的器官，它作为一道保护屏障，能够抵御有害物质，同时防止水分流失¹。与此同时，将药物应用于皮肤或通过皮肤给药具有多种优势。与注射和口服给药相比，皮肤给药可提高患者的依从性，并避免肝脏的首过代谢²。特别是对于皮肤疾病，皮肤给药制剂在实现局部治疗效果方面表现优异，可减少全身暴露³。然而，皮肤几乎不透过的特性给成功的皮肤递药带来了显著挑战⁴。人体皮肤由三层不同结构组成：表皮、真皮和皮下组织⁴。表皮是皮肤的最外层，可进一步分为多个亚层，其中角质层位于最外层，主要由角质形成细胞构成。角质层对大多数分子具有显著的渗透屏障作用，阻碍其进入皮肤更深层⁵。这种屏障功能源于角质细胞嵌入紧密排列的脂质结构中，这些脂质主要由磷脂、固醇和神经酰胺组成，常被称为“砖- mortar”结构⁶。为了克服这一皮肤屏障，已采用化学渗透促进剂（CPEs）来递送大分子，因为它们可通过与角质层中的脂质和蛋白质相互作用，破坏角质层的结构⁷。

离子液体（ILs）已成为下一代CPEs⁸。它们由体积较大的有机阳离子和阴离子组成，以不对称方式排列，并通过弱的、非定向的离子相互作用相互配位⁹。由于这些弱分子间作用力，离子液体在100 °C以下呈液态，难以形成明确的晶体结构¹⁰。离子液体具有高度可调性，其性能高度依赖于阳离子或阴离子的选择以及这些离子之间的化学计量比，因此对不同疏水性的药物具有较强的溶解和稳定能力¹¹。离子液体分别具备脂质和聚合物的独特性质，可实现大分子的缓释和包封¹²。

基于胆碱和牻牛儿酸（CAGE）且摩尔比为1:2的生物相容性离子液体，在亲水性和疏水性化合物的透皮递送中具有重要应用。已有报道表明，CAGE可显著增强蛋白质（胰岛素）的透皮递送¹³）和核酸（siRNA¹⁴）。CAGE 由碳酸氢胆碱与癸烯酸通过盐交换反应制备，伴随产生 CO₂ 作为副产物¹⁵盐复分解反应可实现新化合物的生成 通过 在温和条件下以直接、快速且高度选择性的方式进行离子交换。通常，目前尚缺乏易于遵循的CAGE离子液体开发与评估工作流程。因此，本文提供了一种此类工作流程，详细阐述CAGE制备的各个阶段，以使不同研究背景的科研人员能够进入这一研究领域。

方案

所有实验操作均遵循欧盟指令 2010/63，并经丹麦兽医和食品管理局批准（许可证编号：DK-13-oth-931833）。

1. 通过盐复分解反应制备CAGE

1. 香叶酸重结晶（纯度85%，分子量168.23 g/mol）
   1. 取一个500 mL圆底烧瓶，称量其重量。
   2. 称取40.0 g香叶酸于烧瓶中。这相当于0.2 mol 的香叶酸。
   3. 在圆底烧瓶中加入 (40 g × 0.85 × 0.30) / (0.70 × 0.784 g/mL) = 18.42 mL 丙酮，对香叶酸进行重结晶，香叶酸:丙酮质量比为 70:30%（w/w）。
   4. 取一个 5 L 烧杯，准备约 0.5 L 干冰和乙醇
   5. 将圆底烧瓶放入干冰-乙醇冷浴中，不进行振荡，使其外部冷却。当结晶达到平衡（对应于所加丙酮的体积，通常在0.5–2小时内）时，倾倒除去固体/重结晶月桂烯酸中的丙酮及杂质。重复此步骤5–6次，以确保获得足够的纯度。
   6. 在40 rpm条件下，通过真空旋转蒸发至少20分钟，或直至圆底烧瓶触摸时不再感觉冰冷，以除去残留的丙酮（丙游戏副本在20 °C时的蒸气压为240 mbar）。
   7. 称量并记录装有重结晶香叶酸的烧瓶质量。根据初始空烧瓶重量计算产率。预期产率范围为60–80%。
2. 盐复分解反应
   1. 根据重结晶后香叶酸的产率，计算当香叶酸与胆碱的摩尔比为2:1时所需胆碱的摩尔数。例如，若香叶酸产率为70%，则应加入0.07 mol胆碱（计算过程：0.2 × 70/100 = 0.14，0.14 ÷ 2 = 0.07）。
   2. 碳酸胆碱的纯度为80%，分子量为165.19 g/mol。因此，加入14.45 g（0.07×165.19 = 11.56 g；100/80×11.56 g = 14.45 g) 缓慢滴加胆碱碳酸氢盐，以防止溢出。
   3. 以300 rpm（或适当转速）转速搅拌样品过夜 室温（18 ± 3 小时）或直至 CO₂ 蒸发停止。
   4. 在60 °C、30 mbar条件下，通过旋转蒸发干燥样品40分钟。 首先升高温度，然后缓慢降低压力，以避免起泡。
   5. 将CAGE分装至玻璃小瓶中，体积根据预期用途而定（例如，4 mL玻璃小瓶中分装2 mL CAGE）。
   6. 在60 °C下真空干燥小瓶48小时。

2. CAGE 的表征

1. 核磁共振（NMR）波谱学
   1. 将CAGE溶解于氘代二甲基亚砜（d-DMSO）中，配制成25 mg/mL的溶液，确保终体积不少于500 µL。
      注意：氘代溶剂在核磁共振（NMR）中至关重要，可避免溶剂中的氢原子产生干扰。
   2. 将500 µL已制备的溶液转移至一支洁净、干燥的核磁管（通常直径为5 mm，根据仪器型号而定）中。用管帽密封核磁管，以防止蒸发和污染。
      注意：避免引入气泡，因为气泡可能影响磁场的均匀性。
   3. 使用核磁共振波谱仪（例如 400 MHz），参数如下：
      -扫描次数：8-16次，用于 ¹氢核磁共振（H NMR）；1,000-5,000 ¹³C NMR（取决于浓度和所需的信噪比（S/N）。
      ​- 弛豫延迟（D1）：1–2 秒 ¹H 和 ¹³C NMR
   4. 使用适当的软件处理数据。
      1. 调整以获得最佳峰形 通过 相位和基线校正。
         注意：此步骤通常在 NMR 软件中进行 处理 或 校正 选项卡（取决于所使用的软件），其中提供相位调整和基线校正的自动工具。
      2. 使用残余溶剂峰（d-DMSO）作为参考：约 2.50 ppm ¹H，约 39.52 ppm ¹³碳核磁共振（C NMR）。参见 Fulmer 等人。¹⁵用于杂质对照。
   5. 积分峰面积并将峰归属到结构中的质子（参见 图1).
2. 通过卡尔·费休滴定法测定的水分含量
   1. 将300 mg CAGE溶解于300 µL甲醇中。吸入1 mL注射器，注射前后分别称重。
   2. 根据制造商说明，使用库仑法卡尔·费休滴定仪测定水分含量。
      1. 使用注射器穿过隔膜将样品注入滴定池，输入空注射器的重量，然后按下 输入结果将以% w/w表示。
      2. 根据甲醇中的含水量调整，以获得CAGE中实际的水含量（通常为1–2% w/w）。(W_样本 = W_{样本+稀释液}*(m_样本+m_稀释液) - (W_稀释液m_稀释液)/m_样本).
3. 通过差示扫描量热法（DSC）测定CAGE的热稳定性
   1. 将每份样品取 3-5 mg 置于铝制 Tzero 样品盘中，并用密封盖封口。
   2. 使用DSC在80 °C至-80 °C的温度范围内分析样品，冷却至-80 °C前设置10分钟的等温阶段。
   3. 使用5 °C/min的恒定升/降温速率，并以50 mL/min的氮气流进行吹扫。
   4. 使用适当的软件处理数据。

3. 离体 皮肤屏障相互作用评估

1. 猪皮的皮片机处理
   1. 将可发性聚苯乙烯（EPS）切割成适合皮片机刀片的尺寸，并用植皮胶带包裹。使用解剖刀取自猪背部区域的皮肤。此处皮肤来源于3.5月龄的雌性丹麦长白猪或约克夏猪（30–40 kg）。
   2. 去除肌肉和脂肪组织。 为便于进行皮片切取，必须确保组织的基底侧平整且均匀。
   3. 使用毛发修剪器尽可能去除皮肤上的毛发。
   4. 用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）冲洗皮肤，以去除血液和松散的毛发。
   5. 用刀将皮肤切成较小的片状（5 cm × 15 cm），以适配EPS块的尺寸。
   6. 用针将皮肤固定在EPS块上。
   7. 将皮片机设定为0.5 mm厚度，并对皮肤进行切片。
   8. 将切好的皮片夹在两层植皮胶带之间，并在-70 °C下保存。
2. 经表皮水分流失（TEWL）
   1. 将1片试剂溶解于200 mL超纯水中，配制磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。在超声波水浴中脱气20分钟。
   2. 打开与Franz扩散池相连的水浴装置。向每个池中加入约12 mL脱气后的PBS和一个磁力搅拌子。开启磁力搅拌（例如600 RPM），确保受体室介质均匀混合，但不产生湍流。注意，并非所有Franz扩散池系统均可精确控制搅拌速度。调节加热装置，使受体介质温度达到37 °C。
   3. 使用解剖刀将皮片切成直径约3 cm（或适当尺寸）的圆形片，并使用夹具和密封圈小心地将皮片安装到Franz扩散池上，确保角质层朝上。
   4. 接着，使用玻璃巴斯德移液管将受体室完全充满PBS，确保液面达到标示已知体积的刻度线。通过轻轻翻转扩散池去除气泡。水化30分钟。
   5. 开启TEWL测量仪，并根据制造商指南平衡20分钟，直至读数稳定。
   6. 将TEWL探头置于每个Franz池上，在软件中点击开始。保持探头位置，直至显示测量值。
   7. 在皮肤表面加入300 µL样品（每组设三个重复，n=3），并在Franz池上方覆盖植皮胶带以实现封闭。在37 °C（受体介质温度）下孵育24小时。
   8. 用无尘擦拭布擦拭组织表面以去除样品。静置30分钟。
   9. 测量每个扩散池的TEWL值，以评估样品对皮肤屏障的影响。将TEWL值相对于暴露前数值进行计算，并以PBS对照组为基准进行校正（相对TEWL = (TEWL_post−TEWL_pre/TEWL_pre)/(TEWL(PBS)_post−TEWL(PBS)_pre/TEWL(PBS)_pre))×100）。

结果

NMR 谱图
该技术的目标是通过¹H 和 ¹³C 核磁共振（NMR）波谱分析氢原子和碳原子的化学环境，以确认 CAGE 的成功合成。所得谱图提供了反映所合成离子液体分子结构和组成的特征化学位移、裂分峰型及积分值。图1 中的氢谱证实了月桂烯酸与胆碱的摩尔比为 2:1。这一点从积分值中可以明显看出：以对应于月桂烯酸（9）的峰作为校准参考，胆碱各峰的积分值约为月桂烯酸的一半，与预期化学计量比一致。

核磁共振谱在 图1 和 图2 确认CAGE的成功合成，如Zakrewsky等人先前所证实的那样¹⁶.

讨论

本文所述的CAGE制备方法源自文献¹⁵。然而，必须指出的是，该合成过程对多种外部因素较为敏感，这些因素可能影响最终产物的性质。因此，CAGE体系制备完成后，应采用核磁共振（NMR）光谱等技术对其进行表征，以确认CAGE的形成。

如图1所示，CAGE的质子谱展示了每种分子中质子的化学位移。¹H NMR和¹³C NMR谱图的详细峰归属见参考文献¹⁶。先前已有报道指出，水的存在可能通过增强COOH、OH和H₂O基团之间的质子交换，从而提高¹H NMR中某些峰的相对强度¹⁶。在NMR实验过程中可能出现的一些问题包括：由于管路污染导致峰形变宽、样品浓度过低导致信号弱，以及因参考标准设置不当引起化学位移误差¹⁷。因此，在进行NMR波谱分析时，必须使用氘代溶剂，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mm NMR 管	Sigma Aldrich	41121705
丙酮	VWR	23L064039
铝制 Tzero 样品盘	TA Instruments	90,16,83,901
Aqua Flux 测量装置	Biox Systems
Bruker Avance III NMR	Bruker		NMR 谱仪
胆碱碳酸氢盐	Sigma Aldrich	C7519
皮肤切片机	Zimmer Biomet
差示扫描量热仪	TA Instruments
乙醇	VWR	23J314009
发泡聚苯乙烯	Styrofoam
Franz 扩散池	PermeGear
牻牛儿酸	Sigma Aldrich	427764
封口膜	Parafilm
Karl Fischer 滴定仪	Mettler Toledo	30252662
甲醇	VWR	85681.32
PBS	Fischer Scientific	10388739
TA universal analysis 2000 软件	TA Instruments		DSC 数据分析软件
TopSpin 软件	Bruker		NMR 数据分析软件