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光遗传学结合光纤光度记录技术在电针调控神经环路-内脏功能中的应用

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DOI：

10.3791/68667

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2025年9月19日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验旨在建立一种新方法，可同时整合光遗传学、脑内钙信号记录和胃动力监测，为实时监测躯体刺激与神经环路-内脏功能相互作用之间的关系提供一种新范式，并将其应用于针灸研究。

摘要

本方案描述了一种在活体小鼠中，通过光遗传学手段操控特定类型神经元，并实时记录电针刺激足三里（ST36）对核钙信号及胃动力影响的技术。以往对针灸疗效中枢机制的探索受到技术手段的限制。然而，光遗传学与光学成像技术的进步推动了神经科学的发展。光纤光度记录技术最初利用基因编码的钙指示剂来可视化反映神经元活动的钙动态变化，已成为在活体条件下表征脑-行为关联的关键技术。光遗传学的应用使得神经元可被基因编码，从而能够通过光刺激实现其激活或抑制，这一能力有助于建立神经回路功能与行为结果之间的因果关系。同步进行的光纤光度记录、钙信号检测与光遗传学刺激，为神经元活动的实时记录与操控提供了方法，是研究针灸中枢机制的有效途径。然而，目前仍缺乏将光纤光度钙信号记录、光遗传学与内脏功能监测技术同时应用于针灸研究的报道。本实验结果显示，电针刺激ST36可能通过调控PBNGlu-NTSGlu-DMVChAT神经环路来影响胃动力，对该环路进行光遗传学刺激可产生相同效应；当两种刺激叠加后，钙信号与胃动力的变化达到最大。本研究建立了一种将光遗传学、脑内钙信号记录与胃动力监测同步整合的新方法，为实时监测躯体刺激与神经环路-内脏功能相互作用关系提供了新的研究范式。

引言

近年来，生物分子荧光传感器的快速发展推动了光纤光度法在分子生物学中的应用，促进了体内记录1。这一技术进步实现了对大脑神经元活动变化的实时监测。结合光遗传学技术，可对神经元进行操控，其优势在于仅需插入光纤即可同时开展光遗传学干预与光纤记录。该方法联合内脏功能记录，具有良好的时间分辨率和核团水平的靶向性，可用于观察针刺如何通过调节神经元活动来调控内脏功能。

大量研究表明，针灸对胃肠功能具有独特的调节作用2,3,4，但其确切的中枢机制仍不明确。许多中国古代医学典籍（如《黄帝内经》）也记载，足三里穴（ST36，位于膝关节外侧后方，腓骨头下方约2 mm处5）常用于治疗胃肠道疾病。近期研究显示，参与胃生理过程（如摄食行为6、停止进食7、食欲抑制8）和病理过程（如胃痛9、胃功能障碍10）的核团包括旁束旁核（PSTn）、背缝核（DRN）、外侧旁臂核（LPB）、孤束核（NTS）以及迷走神经背运动核（DMV）。研究表明，对ST36进行电针刺激可增加DMV中c-Fos+细胞的数量，从而增强孤束核尾侧亚核中c-Fos+的表达11。此外，已有文献记载，旁中心核（PBN）构成旁中心核复合体的一部分，可向下投射至延髓的NTS，在整合内脏感觉信息（如胃肠信号）中发挥重要作用12,13。上述信息提示，针灸可能通过PBNGlu-NTSGlu-DMVChAT神经环路调节胃动力。在胃的生理与病理过程中，谷氨酸能神经元主要参与LPB和NTS的功能14，而胆碱能神经元则主要参与DMV的功能15。研究针灸对神经环路及内脏功能的调节作用，有助于更清晰地理解针灸的作用机制，并为针灸干预内脏疾病的临床应用提供理论依据。

然而，由于技术限制，目前关于电针调节内脏功能的神经环路机制的研究仍然有限。因此，本研究提供了简化的操作指南，以介绍病毒注射的详细步骤。值得注意的是，本文阐述的方法可用于阐明针刺调节多种内脏功能所涉及的神经环路机制。

因此，本研究旨在探讨针灸对胃动力的调节作用，该作用可能与PBNGlu-NTSGlu-DMVChAT神经环路相关。研究将结合光遗传学与光纤光度法进行钙成像记录，旨在建立钙成像与光遗传同步的技术方案，为内脏功能及神经环路研究提供一种全新的研究框架。

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方案

所有操作均遵循美国国立卫生研究院制定的实验室动物护理与使用指南，并获得中国台湾针灸研究所动物护理与使用伦理委员会的批准 & 艾灸，中国医学科学院。选用体重25 g的成年雄性C57小鼠进行病毒注射和光纤植入。动物实验方案严格遵循国家标准的要求 "实验动物福利伦理审查指南" （GB/T 35892-2018）并经机构伦理委员会批准。

注意：在病毒注射和光纤植入过程中保持环境清洁。整个操作过程中需佩戴口罩。在病毒高表达期（21-28 天）后，进行 ST36 电针刺激和光遗传学操作以记录胃运动。动物饲养于中国医学科学院针灸研究所动物实验中心，环境条件受控（温度：22-24 °C，湿度：50%-60%，12 小时明暗循环），可自由获取食物和水。所用试剂与设备的具体信息见材料表。

1. 术前准备

  1. 对经过高温灭菌的手术器械进行消毒，并用70%乙醇清洁手术区域。
  2. 麻醉：向小鼠腹腔注射1.25%三溴乙醇（0.2 mL/10 g体重）。通过评估足趾夹捏反射的消失情况来判断麻醉深度。
  3. 剃除小鼠头部毛发，并将其固定在配备耳杆和门齿杆的立体定位仪上。在小鼠眼睛上涂抹红霉素眼膏，以防止手术灯光造成损伤。
  4. 将光纤插芯（插芯尺寸：1.25 mm白色插芯，光纤类型：200/0.37，光纤长度：5.5 mm，插芯针型号：V8475）浸泡于75%乙醇中30分钟，随后用生理盐水冲洗掉70%乙醇。
  5. 用石蜡（800-900 nL）填充微量注射器（1 µL）。加热熔化玻璃管并拉成两段。使用针头研磨机将其中一段的尖端磨尖，作为注射针。为确保微量注射器的气密性，用胶枪将石蜡填充的玻璃管与注射器尖端连接。

2. 病毒注射手术

  1. 沿中线从眼睛到颈部后方切开头皮，暴露颅骨。随后切除颈部肌肉，暴露枕骨。用过氧化氢（H2O2）擦拭骨面30秒，再用干燥的棉签清洁，以去除皮下筋膜和结缔组织（图1A）。
    注意：此步骤有助于将牙科水泥更好地覆盖在枕骨上，从而使光纤更稳定地固定。
  2. 调平颅骨。
    1. X轴调平：在冠状缝上标记两个距离前囟点3.5 mm的点，并连接两点形成一条线。该线的中点为零点。在骨面上距离该原点3.5 mm处，Z轴方向的高度差绝对值应≤0.03 mm。
    2. Y轴调平：在人字缝上标记两个距离人字点3.5 mm的点，取两点中点，并将该中点与人字点连接成一条线。该线的中点为另一个零点。此零点与X轴调平时所确定的零点之间在骨面处的Z轴高度差绝对值应≤0.03 mm。
  3. 用记号笔标记病毒注射的立体定位坐标。PBN区域：-1.1 mm 前后方向（AP，Y轴），-5.45 mm 内外方向（ML，X轴），-3.3 mm 背腹方向（DV，Z轴）（以前囟点为零点）；NTS区域：-0.35 mm AP，0.2 mm ML，-3.3 mm DV（以枕骨最高点为零点）；DMV区域：-0.35 mm AP，0.0 mm（枕骨最高点），-3.5 mm DV（以枕骨最高点为零点）（图1B）。使用高速微型钻头（钻头直径0.8 mm）在指定位置钻穿颅骨，暴露脑表面。随后用精细镊子轻轻刺破并移除硬脑膜，向钻孔处滴加生理盐水以保持脑表面湿润。
  4. 在颅骨表面（钻孔区域除外）涂抹Single Bond Universal粘合剂，并光照30秒使其固化。在涂抹粘合剂前必须保持颅骨表面干燥，以确保牢固粘附。此外，涂抹过程中应避免将粘合剂沾到肌肉上。
  5. 将微量注射器固定在立体定位仪的机械臂上。吸入250 nL病毒液（rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA）。当针尖接触脑表面时，将深度（Z轴）调至0。将针缓慢下降至臂旁核（PBN）目标位置，以35 nL/min的速度向PBN区域注射病毒。注射完成后，保持针头原位10分钟，然后以6 mm/min的速度缓慢撤出。随后将针头浸入含有生理盐水的离心管中进行清洗（图1C，D）。
    注意：后续所有病毒的注射剂量均为250 nL；DMV区域为100 nL16,17。
  6. 采用相同方法，将rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs注射至孤束核（NTS），并将rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA注射至迷走神经背核（DMV）（图1D）。所有病毒滴度均≥1 × 1012 VG/mL。

3. 光纤植入手术

  1. 将光纤插芯固定在光探针支架上，并将其连接至立体定位仪的机械臂。设定植入坐标，对应于DMV病毒注射位点上方约100 µm的位置（图1E，F）。
  2. 将1–3 g牙科水泥与1 mL室温固化树脂混合，直至均匀。迅速将混合物涂抹于光纤插芯周围及颅骨表面，保留光纤插芯上端5 mm部分暴露。待水泥固化后，松开支架螺丝，抬起并取下支架（图1G）。
  3. 使用可吸收外科缝线（6-0）缝合小鼠枕部头皮。将小鼠从立体定位架上取出，置于温暖环境中恢复麻醉。待动物恢复自由活动后，转移至清洁宽敞的笼具中饲养，每笼饲养4–5只，自由摄食饮水。
    注意：实验过程中观察到，较大的笼具更有利于小鼠正常活动，对维持其体重至关重要。增加空间还可降低意外触碰植入光纤的可能性，从而减少潜在损伤。体重达25 g或以上的小鼠在接受针灸时表现出显著的胃内压变化。

4. 球囊置入手术

  1. 在病毒表达高峰期（21–28 天），禁食小鼠 4–5 小时，随后对小鼠进行麻醉 通过 腹腔注射1.25%三溴乙醇（0.1 mL/10 g体重）。15分钟后，腹腔注射10%氨基甲酸乙酯溶液（0.15 mL/10 g体重）。通过确认足趾夹捏反射消失来评估麻醉深度。
  2. 剃除腹部和ST36区域的毛发。打开加热垫并设置温度为37 °C，手术过程中将动物始终置于加热垫上以维持恒定的体温。
  3. 将乳胶气球连接至注射器，注入空气以检查乳胶气球（BS4 73-2787）是否漏气。
  4. 暴露剑突下方的胃及部分十二指肠。在幽门远端0.5–1 cm处，于十二指肠上做一长约0.3 cm的小切口。
  5. 通过十二指肠切口将球囊沿肠管方向插入胃内，结的位置置于幽门窦处。
  6. 取下注射器针头，吸入5 mL纯水，排出空气，将注射器另一端与球囊连接。向上拉动注射器鲁尔锁以抽出球囊内的气体，然后向下推动鲁尔锁将纯水注入球囊。将该装置连接至三通旋塞阀和压力传感器。

5. 胃内压与钙成像的同步记录

  1. 打开Neurolog Digitimer型号、CED Micro1401-4、Inper Studio、多通道光纤记录系统、Inper信号软件和Spike 2软件。设置Inper软件，使其钙信号记录由Spike2软件和光遗传刺激器触发，确保Inper软件记录的钙信号与Spike2软件记录的胃内压在时间上同步，并与激光刺激对齐。
  2. 打开连接至球囊的所有三通阀，旋转Neurolog Digitimer型号上的ZERO旋钮，在Spike 2软件中观察基线是否已调整至0点。待球囊内压力与大气压平衡后，向球囊内注入纯水，使胃内压显示为15–35 cm H2O。当胃内压和钙信号均达到稳定状态后，在迷走神经背侧运动核（DMV）中记录60秒的胃内压和钙信号基线数据（图2A）。

6. 足三里电针刺激与激光刺激

  1. 将一根针灸针（0.25 mm × 25 mm）插入左侧 ST36 穴位，并连接至电针仪（10 Hz，1 mA）。在记录胃内压和钙信号变化的同时，进行持续 60 秒的电针刺激。
  2. 待胃内压和钙信号基线稳定后，通过光纤输送光遗传学刺激（635 nm，5 ms，5 Hz，30 mW），持续 60 秒，同时监测胃内压和钙信号的变化。
  3. 当胃内压和钙信号的基线再次稳定后，联合应用 ST36 电针刺激（10 Hz，1 mA）与光遗传学刺激（635 nm，5 ms，5 Hz），持续 60 秒，并记录胃内压和钙信号的变化。

7. 病毒注射和光纤放置的组织学检查

  1. 完成上述实验步骤后，用生理盐水灌注小鼠，并用4%多聚甲醛固定 通过 立即取出小鼠心脏，采集小鼠脑组织。使用20%和30%蔗糖溶液进行梯度脱水，随后用速冻包埋剂包埋并切片。将脑切片与小鼠脑图谱比对，观察病毒注射和光纤植入位置是否准确。病毒注射和光纤植入的精确定位保证了胃内压和钙信号数据的有效性图1H，I).

8. 数据分析

  1. 使用Inper数据分析软件分析钙信号数据，使用Spike2软件分析胃动力数据。比较刺激时（60秒）与刺激前（60秒）的钙信号或胃动力振幅差异，以观察不同刺激对胃动力和钙信号的调节作用。图2中显示的所有数据均为原始数据图。

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结果

将病毒注射至小鼠的臂旁核（PBN）、孤束核（NTS）和迷走神经背侧运动核（DMV），并在DMV植入光纤（图1A-G）。在病毒表达高峰期，记录ST36电针刺激和光遗传学刺激后胃内压的变化以及DMV内的钙信号。本研究旨在观察ST36电针刺激和光遗传学刺激对胃动力的调节作用，该作用可能与PBNGlu-NTSGlu-DMVChAT神经环路相关。

在基线条件下，记录的180秒内胃内压峰值和钙信号未出现显著变化（图2A）。当施加光遗传学刺激或在ST36穴位进行电针刺激时，胃内压峰值和钙信号均明显升高。然而，与ST36电针刺激相比，光遗传学刺激引起的钙信号升高更为显著，而胃内压的升高则较弱（图2B、C）。同时施加光遗传学刺激和ST36电针刺激时，胃内压峰值和钙信号均显著增强，效果超过单独...

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讨论

针灸的核心科学问题在于通过刺激穴位调节自主神经，进而调控靶器官功能。Q. Ma 的研究结果表明，针灸对远端器官功能的调节作用源于躯体-自主神经反射，该反射可激活交感神经和/或副交感神经通路，尤其与胃肠道疾病及全身性炎症相关18。然而，现有研究主要集中在周围神经或孤立脑区的探索19,20。单个神经元通过具有特定投射关系的神经环路协同工作，以处理信息21。这些神经环路对于阐明针灸调节靶器官功能的机制至关重要。然而，仅记录针灸刺激后神经核团中神经元的激活情况，或仅评估针灸对内脏功能的影响，尚不足以直接建立穴位刺激、自主神经调节与靶器官调控三者之间的关联18。

在光纤光度法中，通过光激活光敏蛋白并记录钙荧光蛋白荧光强度的变化，来测量神经元群体的活动水平14。利用基因编码的钙指示剂检测C...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金（编号：82174518，82474661）、中央级公益性科研院所基本科研业务费（编号：ZZ-2023008）以及中国中医科学院科技创新工程（编号：CI2021A03402）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
病毒
rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA (AAV2/9)BrainVTACat#PT-0020
rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs (AAV2/9)BrainVTACat#PT-12637
rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA (AAV2/9)BrainVTACat#PT-10973
其他
1 μL 微量注射器Hamilton80135
3M EPSP 单组分通用粘接剂Dental World Official41269
针灸针ZhongYanTaiHe0.25/13s
CED Micro1401-4CED(England)1401-4
牙科水泥/室温固化树脂YAMAHACHI DENTALN/A
精细镊子RWDF11028-13
玻璃管World Precision Instruments504949
HANS-200AHANS InstituteHANS-200
Inper Signal（软件）InperN/A
Inper Studio(Venus)InperB1502
乳胶气囊Harward ApparatusBS4 73-2787
多通道光纤记录系统（Vista Pro）InperR5268
Neurolog digitimer 型号 DigitimerNL900D
光纤插芯 InperV8475
Spike 2（软件）CED(England)N/A
立体定位仪（含坐标计算器）David Kopf InstrumentsKOPF 942
三溴乙醇SigmaT48402
tribromoethanolSigma T48402

参考文献

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