本实验旨在建立一种新方法，可同时整合光遗传学、脑内钙信号记录和胃动力监测，为实时监测躯体刺激与神经环路-内脏功能相互作用之间的关系提供一种新范式，并将其应用于针灸研究。
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* These authors contributed equally
本实验旨在建立一种新方法，可同时整合光遗传学、脑内钙信号记录和胃动力监测，为实时监测躯体刺激与神经环路-内脏功能相互作用之间的关系提供一种新范式，并将其应用于针灸研究。
本方案描述了一种在活体小鼠中，通过光遗传学手段操控特定类型神经元，并实时记录电针刺激足三里（ST36）对核钙信号及胃动力影响的技术。以往对针灸疗效中枢机制的探索受到技术手段的限制。然而，光遗传学与光学成像技术的进步推动了神经科学的发展。光纤光度记录技术最初利用基因编码的钙指示剂来可视化反映神经元活动的钙动态变化，已成为在活体条件下表征脑-行为关联的关键技术。光遗传学的应用使得神经元可被基因编码，从而能够通过光刺激实现其激活或抑制，这一能力有助于建立神经回路功能与行为结果之间的因果关系。同步进行的光纤光度记录、钙信号检测与光遗传学刺激，为神经元活动的实时记录与操控提供了方法，是研究针灸中枢机制的有效途径。然而，目前仍缺乏将光纤光度钙信号记录、光遗传学与内脏功能监测技术同时应用于针灸研究的报道。本实验结果显示，电针刺激ST36可能通过调控PBNGlu-NTSGlu-DMVChAT神经环路来影响胃动力，对该环路进行光遗传学刺激可产生相同效应；当两种刺激叠加后，钙信号与胃动力的变化达到最大。本研究建立了一种将光遗传学、脑内钙信号记录与胃动力监测同步整合的新方法，为实时监测躯体刺激与神经环路-内脏功能相互作用关系提供了新的研究范式。
近年来，生物分子荧光传感器的快速发展推动了光纤光度法在分子生物学中的应用，促进了体内记录1。这一技术进步实现了对大脑神经元活动变化的实时监测。结合光遗传学技术，可对神经元进行操控，其优势在于仅需插入光纤即可同时开展光遗传学干预与光纤记录。该方法联合内脏功能记录，具有良好的时间分辨率和核团水平的靶向性，可用于观察针刺如何通过调节神经元活动来调控内脏功能。
大量研究表明，针灸对胃肠功能具有独特的调节作用2,3,4，但其确切的中枢机制仍不明确。许多中国古代医学典籍（如《黄帝内经》）也记载，足三里穴（ST36，位于膝关节外侧后方，腓骨头下方约2 mm处5）常用于治疗胃肠道疾病。近期研究显示，参与胃生理过程（如摄食行为6、停止进食7、食欲抑制8）和病理过程（如胃痛9、胃功能障碍10）的核团包括旁束旁核（PSTn）、背缝核（DRN）、外侧旁臂核（LPB）、....
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所有操作均遵循美国国立卫生研究院制定的实验室动物护理与使用指南，并获得中国台湾针灸研究所动物护理与使用伦理委员会的批准 & 艾灸，中国医学科学院。选用体重25 g的成年雄性C57小鼠进行病毒注射和光纤植入。动物实验方案严格遵循国家标准的要求 "实验动物福利伦理审查指南" （GB/T 35892-2018）并经机构伦理委员会批准。
注意：在病毒注射和光纤植入过程中保持环境清洁。整个操作过程中需佩戴口罩。在病毒高表达期（21-28 天）后，进行 ST36 电针刺激和光遗传学操作以记录胃运动。动物饲养于中国医学科学院针灸研究所动物实验中心，环境条件受控（温度：22-24 °C，湿度：50%-60%，12 小时明暗循环），可自由获取食物和水。所用试剂与设备的具体信息见材料表。
1. 术前准备
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将病毒注射至小鼠的臂旁核（PBN）、孤束核（NTS）和迷走神经背侧运动核（DMV），并在DMV植入光纤（图1A-G）。在病毒表达高峰期，记录ST36电针刺激和光遗传学刺激后胃内压的变化以及DMV内的钙信号。本研究旨在观察ST36电针刺激和光遗传学刺激对胃动力的调节作用，该作用可能与PBNGlu-NTSGlu-DMVChAT神经环路相关。
在基线条件下，记录的180秒内胃内压峰值和钙信号未出现显著变化（图2A）。当施加光遗传学刺激或在ST36穴位进行电针刺激时，胃内压峰值和钙信号均明显升高。然而，与ST36电针刺激相比，光遗传学刺激引起的钙信号升高更为显著，而胃内压的升高则较弱（图2B、C）。同时施加光遗传学刺激和ST36电针刺激时，胃内压峰值和钙信号均显著增强，效果超过单独.......
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针灸的核心科学问题在于通过刺激穴位调节自主神经，进而调控靶器官功能。Q. Ma 的研究结果表明，针灸对远端器官功能的调节作用源于躯体-自主神经反射，该反射可激活交感神经和/或副交感神经通路，尤其与胃肠道疾病及全身性炎症相关18。然而，现有研究主要集中在周围神经或孤立脑区的探索19,20。单个神经元通过具有特定投射关系的神经环路协同工作，以处理信息21。这些神经环路对于阐明针灸调节靶器官功能的机制至关重要。然而，仅记录针灸刺激后神经核团中神经元的激活情况，或仅评估针灸对内脏功能的影响，尚不足以直接建立穴位刺激、自主神经调节与靶器官调控三者之间的关联18。
在光纤光度法中，通过光激活光敏蛋白并记录钙荧光蛋白荧光强度的变化，来测量神经元群体的活动水平14。利用基因编码的钙指示剂检测C.......
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作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金（编号：82174518，82474661）、中央级公益性科研院所基本科研业务费（编号：ZZ-2023008）以及中国中医科学院科技创新工程（编号：CI2021A03402）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 病毒 | |||
| rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA (AAV2/9) | BrainVTA | Cat#PT-0020 | |
| rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs (AAV2/9) | BrainVTA | Cat#PT-12637 | |
| rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA (AAV2/9) | BrainVTA | Cat#PT-10973 | |
| 其他 | |||
| 1 μL 微量注射器 | Hamilton | 80135 | |
| 3M EPSP 单组分通用粘接剂 | Dental World Official | 41269 | |
| 针灸针 | ZhongYanTaiHe | 0.25/13s | |
| CED Micro1401-4 | CED(England) | 1401-4 | |
| 牙科水泥/室温固化树脂 | YAMAHACHI DENTAL | N/A | |
| 精细镊子 | RWD | F11028-13 | |
| 玻璃管 | World Precision Instruments | 504949 | |
| HANS-200A | HANS Institute | HANS-200 | |
| Inper Signal（软件） | Inper | N/A | |
| Inper Studio(Venus) | Inper | B1502 | |
| 乳胶气囊 | Harward Apparatus | BS4 73-2787 | |
| 多通道光纤记录系统（Vista Pro） | Inper | R5268 | |
| Neurolog digitimer 型号 | Digitimer | NL900D | |
| 光纤插芯 | Inper | V8475 | |
| Spike 2（软件） | CED(England) | N/A | |
| 立体定位仪（含坐标计算器） | David Kopf Instruments | KOPF 942 | |
| 三溴乙醇 | Sigma | T48402 | |
| tribromoethanol | Sigma | T48402 |
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