本文介绍了一种通过评估氧化应激和凋亡信号通路，在缺血-再灌注损伤大鼠模型中评价 NRG1/ErbB4 信号通路心脏保护作用的实验方案。
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研究文章
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本文介绍了一种通过评估氧化应激和凋亡信号通路，在缺血-再灌注损伤大鼠模型中评价 NRG1/ErbB4 信号通路心脏保护作用的实验方案。
心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）仍是心血管疾病治疗中的重大障碍。MIRI的病理生理机制复杂，涉及氧化应激、钙超载、炎症反应和细胞凋亡等过程。NRG1/ErbB4信号通路已被证实可调节心脏中的氧化应激反应，可能减轻自由基引起的细胞损伤。本研究旨在阐明NRG1/ErbB4通路在大鼠心肌缺血-再灌注（MIRI）损伤模型中发挥保护作用的分子机制。 建立大鼠MIRI模型，共使用30只成年雄性Sprague-Dawley大鼠，随机分为五组：对照组、假手术组、MIRI组、重组NRG1组和AG1478组。采用ELISA法检测心肌组织中NRG1的浓度，Western blot法测定p-ErbB4和总ErbB4蛋白水平。通过流式细胞术评估心肌细胞凋亡率和活性氧（ROS）水平。MIRI组中，NRG1水平较对照组和假手术组显著降低（p < 0.05）。给予重组NRG1治疗后，心肌组织中NRG1水平显著升高，同时p-ErbB4/ErbB4表达比值也明显增加（p < 0.05）。与重组NRG1组相比，AG1478组的NRG1水平较低，且p-ErbB4/ErbB4比值下降（p < 0.05）。在细胞凋亡和ROS水平方面，MIRI组显著高于对照组和假手术组（p < 0.05）。重组NRG1治疗显著降低心肌细胞凋亡率和ROS水平（p < 0.05），而AG1478也能减弱这些效应，但程度较轻。NRG1/ErbB4信号通路在大鼠MIRI中发挥关键的保护作用。外源性补充NRG1可有效提高心肌中NRG1水平，激活ErbB4信号通路，减少心肌细胞凋亡，降低ROS水平，从而减轻MIRI所致的心肌损伤。
心肌缺血再灌注损伤（MIRI）是心血管疾病治疗中面临的一个关键挑战1。尽管恢复缺血心肌的血流对治疗心肌梗死至关重要，但再灌注过程本身可能加剧心脏组织损伤，从而限制治疗效果。MIRI 的机制十分复杂，涉及多种病理生理过程，其中包括氧化应激、钙超载、炎症反应和细胞凋亡2,3,4。
神经生长因子1（NRG1）及其受体Erb-B2受体酪氨酸激酶4（ERBB4）在心脏生理与病理过程中发挥关键作用。NRG1作为一种细胞外配体，可与ErbB4受体结合，激活一系列信号通路，这些通路对心脏发育、维持结构完整性以及应对心脏损伤至关重要5。新兴证据表明，NRG1/ErbB4信号通路在心脏疾病中具有重要作用。在心肌缺血-再灌注条件下，NRG1的表达和功能可能发生改变6。既往研究表明，NRG1通过激活ErbB4促进心肌细胞存活，并抑制过度的细胞凋亡。此外，NRG1/ErbB4信号通路可能调节心脏的氧化应激反应，减轻自由基引起的细胞损伤。因此，阐明NRG1/ErbB4信号通路在心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）中的功能，对于理解该损伤的生物学基础以及开发新的治疗策略具有重要意义7,8。
本研究推测NRG1/ErbB4信号通路在心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）中发挥保护作用。因此，本研究构建了心肌缺血-再灌注大鼠模型，系统探讨NRG1/ErbB4信号通路在MIRI中的作用机制。通过调控NRG1浓度，观察ErbB4活化状态、心肌细胞凋亡率及氧化应激水平的变化，本研究试图揭示NRG1/ErbB4信号通路在MIRI中产生保护作用的分子机制。本研究的创新之处在于阐明了NRG1/ErbB4信号通路在心肌缺血-再灌注损伤中的重要意义，同时为基于该通路的心脏疾病治疗策略提供了新的视角。
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实验动物
从商业供应商处获得30只成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄为8周，体重180-200 g。这些大鼠在实验前于特定病原体阴性环境中饲养1周。实验已获得南平市第一医院伦理委员会的批准（编号：NPSY202208010）。
心肌缺血-再灌注损伤的动物模型
大鼠通过腹腔注射3%戊巴比妥钠（剂量为50 mg/kg）进行麻醉。确认反射消失后，将动物置于仰卧位，并用75%乙醇对颈部和胸部区域进行剃毛和消毒。沿颈正中线做一长约2 cm的切口以暴露气管，随后使用16 G导管经口插管，以维持术中气道通畅。接着，仔细分离左侧胸大肌，暴露第三和第四肋间间隙。在该间隙处行开胸术，切开心包膜，充分暴露心脏。为诱导缺血，使用8-0尼龙缝线结扎左前降支冠状动脉（LAD），并在LAD与结扎线之间置入一段聚乙烯导管（PE-10），以实现可逆性阻塞。缺血持续45分钟，通过肉眼观察心肌变白及心电图改变来确认缺血成功。随后松解结扎线以启动再灌注，恢复血流3小时。45分钟后移除结扎线。
实验分组
将大鼠随机分为五组（每组 n = 6）。（1）对照组：大鼠接受标准饲养，不进行任何手术干预或治疗。（2）假手术组：大鼠接受开胸术及左前降支冠状动脉（LAD）穿线但不结扎，作为手术对照。（3）心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）组：大鼠接受心肌缺血-再灌注损伤造模，并经口灌胃给予生理盐水作为溶剂对照。（4）重组NRG1组：大鼠在开胸术前30分钟静脉注射5 mg/kg剂量的重组人NRG1（rh-NRG1），随后进行MIRI造模。（5）AG1478组：大鼠在开胸术前30分钟静脉注射rh-NRG1（5 mg/kg）联合ErbB受体激酶抑制剂AG1478（20 mg/kg），随后进行MIRI造模。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
动物通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）实施安乐死。心脏组织在再灌注后立即采集，并在冰上用适量冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）进行匀浆。匀浆液随后在4 °C条件下以1200 × g 离心10分钟，以分离上清液。上清液中NRG1的浓度使用 commercially available NRG1 ELISA试剂盒进行定量，严格按照制造商说明书操作。简言之，将样品和标准品加入ELISA板孔中，在室温下孵育推荐时间，随后洗涤并加入检测抗体。使用酶标仪在指定波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算NRG1水平。样品体积为100 µL，抗体稀释比例为1:100，吸光度检测波长设定为450 nm。
Western blot 分析
从麻醉的大鼠中取出心脏组织，并用预冷的 PBS 冲洗以去除残留血液。每颗心脏取约 0.5 g 左心室组织，称重后置于 500 µL 新鲜配制的 RIPA 裂解缓冲液中。将组织置于冰上使用机械组织研磨器充分匀浆至完全裂解，随后在冰上孵育 30 分钟以确保蛋白质充分提取。裂解物于 4 °C 以 12,000 × g 离心 15 分钟，去除不溶性碎片。使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量总蛋白（例如每泳道 30 µg）进行 SDS-PAGE 电泳分离。随后，使用湿转系统在 100 V 条件下电转 90 分钟，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在含 5% 脱脂奶粉的含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）中室温封闭 1 小时。随后，膜在 4 °C 与抗磷酸化 ErbB4（p-ErbB4）和总 ErbB4 的一抗共同孵育过夜，两种抗体均按 1:1000 稀释。洗膜后，室温下与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育 1 小时。使用增强型化学发光（ECL）底物显色，并通过凝胶成像系统采集信号。使用 ImageJ 软件对条带强度进行定量分析，计算 p-ErbB4 与总 ErbB4 的比值以评估磷酸化水平。
流式细胞术
通过流式细胞术评估心肌细胞凋亡。将心脏组织精细剪碎，并使用II型胶原酶（1 mg/mL）和蛋白酶（例如胰蛋白酶，0.25%）混合液在37 °C条件下轻柔振荡消化20-30分钟。加入等体积的胎牛血清（FBS）以终止酶消化反应。细胞悬液经70 µm尼龙滤网过滤后，在4 °C下以300 × g离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于结合缓冲液中，按照试剂盒说明书加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）进行孵育。室温避光孵育15分钟后，立即进行流式细胞术分析。早期凋亡细胞定义为Annexin V阳性而PI阴性，晚期凋亡或坏死细胞则对两种标记物均为阳性。对各实验组的凋亡率进行定量并比较。设门策略采用十字门/矩形门设置。进行仪器检测时，十字门设为虚线，所有参数均保持一致以确保数据筛选的可重复性。根据细胞浓度调整流速（维持在1000个细胞/秒），低速上样可避免喷嘴堵塞。
活性氧（ROS）水平的检测
从心脏组织中分离心肌细胞，随后以 300 × g 离心 5 分钟，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。根据制造商说明书，将细胞与 10 µM 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）染料在 37 °C 避光孵育 30 分钟。染色后，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除未结合的过量染料。通过流式细胞术立即检测细胞内 ROS 水平，检测 DCFDA 氧化后产生的荧光强度。使用 FlowJo 软件定量各样本的平均荧光强度（MFI），以比较不同实验组间的 ROS 水平。门控策略如上所述（流式细胞术部分）。
统计学分析
采用 SPSS 软件进行数据分析，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析结合 Tukey 事后检验，两两比较采用 Student t 检验。当 p 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。
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NRG1 对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用
流式细胞术分析显示，与对照组和假手术组相比，MIRI 组的细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）。与 MIRI 组相比，重组 NRG1 组和 AG1478 组的细胞凋亡率均显著降低（P < 0.05）。相比之下，重组 NRG1 组的细胞凋亡率低于 AG1478 组（P < 0.05）（图 1 和 表 1）。这些结果表明，NRG1 对 MIRI 诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用。
NRG1 缓解由 MIRI 诱导的氧化应激
流式细胞术分析显示，与对照组和假手术组相比，MIRI 组心肌组织中的活性氧（ROS）水平显著升高（P < 0.05）。相比之下，重组 NRG1 组和 AG1478 组的 ROS 水平均低于 MIRI 组（P < 0.05），且 NRG1 组的 ROS 水平显著低于重组 AG1478 组（P...
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由于恢复缺血心肌组织的灌注可能反而加重心肌损伤，心肌缺血再灌注损伤（MIRI）在心血管疾病治疗中仍然是一个重大难题。MIRI的发生机制是多因素的，涉及氧化应激、钙超载、炎症反应以及线粒体功能障碍9,10。
NRG1 是一种细胞外配体，通过与心肌细胞表面的 ErbB4 受体结合，激活下游信号通路11,12。p-ErbB4 是受体激活的标志，可进一步激活包括 PI3K/Akt 和 MEK/ERK 在内的多条下游信号通路。在生理状态下，NRG1 与 ErbB4 的相互作用可激活 PI3K/Akt 和 MAPK 等细胞内信号通路，这些通路对调控心肌细胞的存活、增殖、分化和代谢至关重要。在心肌缺血过程中，NRG1/ErbB4 通路的激活可促进心肌细胞的存活与修复，从而减少细胞凋亡，保护心脏免受进一步损伤。然而，该通路的过度激活也与心肌肥厚和心力衰竭等心脏相关疾...
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作者声明无利益冲突。
本工作由福建省自然科学基金（资助号：2024J011604、2023J011877）和福建省卫生健康委员会青年研究项目（资助号：2019-9-25）资助。
作者贡献：
Maozhi Huang 领导了本研究项目的设计与构思，规划并制定了实验方案，参与了关键实验，并撰写了论文初稿。Jianping Zheng 在整体研究中做出了同等贡献，包括研究设计、数据收集和论文撰写。Xianlu Cheng 参与了研究设计，负责样本采集和数据分析。Chaoqun You 协助论文的撰写与结构编排。Ziguo Chen 核查了数据，并协助改进了方法与材料部分。Ling Jiang 在整个研究过程中提供了学术监督与指导。Shanghua Xu 指导了项目的总体方向，协调资源，并对最终论文进行了审阅与修改。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AG1478 | BioLab Technology | WD102925 | 干预药物 AG1478 |
| Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒 | 美仑 | MA0220 | 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| BCA 蛋白定量检测试剂盒 | 美仑生物 | MA0082-2 | WB 蛋白定量 |
| 化学发光成像系统 | Bio-Rad (美国) | ChemiDoc Touch | Western blot 成像 |
| 盐酸氰美马嗪 | 华牧动物健康 | 20220601 | 动物模型麻醉剂 |
| ECL 检测试剂盒 | 美仑生物 | MA0186-1 | WB 化学发光 |
| ERbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | WB 一抗 |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCalibur | 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | WB 上样内参抗体 |
| HRP 标记山羊抗小鼠 IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | 免疫组织化学 |
| HRP 标记山羊抗兔 IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | 免疫组织化学 |
| 酶标仪 | Thermo | K3 | ELISA 检测 |
| 15% PAGE 凝胶制备试剂盒 | 美仑生物 | MA0384 | WB 电泳 |
| p-ERbB4 | Affinity | AF3445 | WB 一抗 |
| 预染蛋白 Marker | 美仑生物 | MA0342 | WB 电泳 |
| 大鼠神经调节蛋白-1 (NRG-1) ELISA 检测试剂盒 | 美曼 | MM-61434R2 | ELISA 检测 |
| 活性氧 (ROS) 检测试剂盒 | 美仑 | MA0219 | WB 检测 |
| rhNRG1 | BioLab Technology | WD091127 | 干预药物 NRG1 |
| RIPA 裂解缓冲液 | 美仑生物 | MA0151 | Western blot 蛋白提取 |
| SDS-PAGE 上样缓冲液 (5x) | 碧云天 | P0015L | WB 电泳 |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma | 151-21-3 | WB 电泳 |
| 舒泰 50 | 维克 (法国) | 8X22A | 动物模型麻醉剂 |
| 垂直蛋白电泳系统 | Bio-Rad (美国) | POWER PAC 200 | Western blot 电泳 |
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