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探索蛋白质-聚糖相互作用：核磁共振技术的进展

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DOI：

10.3791/68674

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2025年8月26日

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

本文内容

摘要

本基于核磁共振（NMR）的实验方案利用氰病毒素-N（cyanovirin-N）与D-甘露糖研究弱蛋白-聚糖相互作用。通过结合配体检测与蛋白检测方法，该方案可定位结合位点、检测变构效应并鉴定碰撞复合物。该方法概述了样品制备与数据分析流程，为聚糖特异性诊断及识别机制提供重要的结构与动态信息。

摘要

蛋白质-聚糖相互作用在许多生物过程中起着核心作用，并且日益被视为感染性疾病、炎症性疾病和肿瘤性疾病诊断策略中有前景的靶点。然而，表征这些相互作用（尤其是当它们较弱且具有瞬时性时）在技术上仍具挑战性。核磁共振（NMR）波谱技术在近生理条件下研究此类相互作用具有独特优势，可提供原子分辨率水平的结构与动态信息。本研究中，我们提出了一种整合型NMR实验方案，以甘露糖特异性凝集素cyanovirin-N与单糖D-甘露糖为模型体系，用于研究低亲和力的蛋白质-聚糖相互作用。该方案结合了基于配体和基于蛋白质的NMR方法，全面绘制结合位点，并检测细微的结合事件，包括潜在的别构效应或碰撞复合物。该方案的关键步骤包括精细的样品制备、浓度的精确控制以及谱图标准化，以确保数据的可重复性和可靠性。溶液中的NMR技术能够检测到其他方法通常难以捕捉的瞬时相互作用。尽管弱相互作用对生命活动至关重要，但现有文献更倾向于研究高亲和力复合物，而低亲和力复合物在许多重要生物学功能（如信号转导和细胞间通讯）中同样具有重要意义。该技术为研究蛋白质-聚糖识别提供了强有力的平台，有望成为基于聚糖特异性相互作用发现新型诊断标志物的重要工具。

引言

蛋白质-聚糖相互作用在多种生物学过程中起着基础性作用，包括细胞间识别、免疫应答调节以及病原体与宿主之间的相互作用1,2。这些分子相互作用具有高度特异性和动态性，在生理和病理机制中均发挥关键作用3,4,5。此类相互作用的一个经典例子是凝集素（lectins），即能够特异性识别并结合聚糖的蛋白质。例如，Cyanovirin-N（CVN）因其能够以高亲和力与高甘露糖寡糖发生相互作用，已被广泛用作实验模型进行研究5,6,7。

除了凝集素外，许多糖基化蛋白（如整合素）也在识别和细胞信号传导中发挥关键作用。整合素是一类跨膜受体，其亚基常发生糖基化修饰，从而影响其稳定性以及对配体（包括聚糖）的亲和力5,8,9,10。然而，由于聚糖本身具有内在的异质性和柔性，使得传统结构生物学方法难以解析这些相互作用的结构特征，因此对该类相互作用进行结构表征仍具挑战性。在此背景下，开发能够在溶液中捕捉此类相互作用的先进方法对该领域，特别是糖生物学领域，具有重要意义11,12。

核磁共振（NMR）波谱技术已成为在原子水平上研究蛋白质-配体相互作用的有力工具。与其他技术（如X射线晶体学和冷冻电子显微镜）不同，NMR能够在接近生理条件下研究生物大分子相互作用，从而提供关于结构和动力学的深入信息。这种灵活性使研究人员能够调节环境参数，如pH值（通常为4.0–8.0）、离子强度（例如0–500 mM NaCl）和温度（一般为273–330 K），从而根据蛋白质-聚糖复合物的具体特性优化实验条件。此外，NMR在分析瞬时性和弱相互作用方面具有显著优势，而这类相互作用通常是蛋白质识别聚糖过程的典型特征13,14。

已采用多种核磁共振（NMR）技术研究蛋白质-聚糖相互作用，包括基于蛋白质和基于配体的方法。从蛋白质角度出发，异核单量子相干（HSQC）滴定法被广泛用于通过监测配体加入后化学位移的变化来定位结合位点。弛豫弥散实验能够检测发生在微秒至毫秒时间尺度上的构象变化和化学交换过程，从而揭示聚糖识别过程中的动态特性15,16。这些基于蛋白质的技术通常要求样品浓度在50 µM至2 mM之间，具体取决于蛋白质的稳定性和标记效率17,18。

基于配体的核磁共振（NMR）技术通过聚焦结合过程中糖链的变化，提供互补的信息。饱和转移差谱（STD-NMR）在识别参与识别过程的糖链表位方面尤为有用，因为它可以选择性地饱和与蛋白质紧密接触的配体区域的核磁共振信号19,20。通过梯度谱观测水-配体相互作用（Water-Ligands Observed via Gradient Spectroscopy, WaterLOGSY）21,22 和转移核Overhauser效应谱（Tr-NOESY）为评估配体结合及相互作用过程中的构象变化提供了额外手段23。此外，Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）弛豫实验有助于识别那些使用常规方法难以检测的弱结合和瞬时相互作用24。基于配体的实验通常在蛋白质浓度为10–50 µM的条件下进行，可能需要优化混合时间与饱和参数25。值得注意的是，这些方法可能受限于糖链溶解度低，或在使用小分子配体时信噪比较差的问题。

这些核磁共振（NMR）方法共同为阐明蛋白质-聚糖相互作用的结构与动态特性提供了全面的框架。随着灵敏度和同位素标记策略的不断进步，该技术在糖生物学中正变得日益重要，为分子识别机制提供了新的视角，并在药物开发和生物标志物发现方面具有潜在应用价值。然而，这些方法的成功依赖于多种因素，例如样品的均一性、聚糖的复杂性，以及是否存在柔性或无序区域，这些可能拓宽NMR信号或阻碍谱图解析26。NMR是研究瞬时事件的有力手段，而瞬时事件正是结构生物学中的一个主要挑战。

CVN 能够以纳摩尔级亲和力识别高甘露糖型寡糖中存在的 α(1,2)-连接的甘露糖残基27,28,29。然而，它对单糖 D-甘露糖的识别能力较弱。在本研究中，我们通过分析 CVN 与 D-甘露糖的相互作用，展示核磁共振（NMR）技术在研究瞬时相互作用方面的强大能力。

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方案

注意：所有涉及细菌培养物和缓冲液制备的步骤均须根据机构生物安全规程进行。使用个人防护装备（PPE），在处理开放培养物或化学品时，如需则应在生物安全柜或化学通风橱内操作。

1. 蓝藻病毒素-N的表达

  1. 将编码 CVN 基因并插入 pET26a 载体的质粒转化至 E. coli BL21 感受态细胞中。
  2. 在 1 L 的超级肉汤培养基（每升含 32 g 胰蛋白胨、20 g 酵母提取物、5 g NaCl）中培养细胞，添加卡那霉素（50 µg/mL）、0.5%（w/v）葡萄糖和 1.6 mM MgSO4。在 37 °C 下以约 250 rpm 持续振荡培养。
  3. 为制备15N 标记的 CVN，使用15NH4Cl 作为唯一氮源，在改良的 M9 最小培养基中培养细胞。
    1. 通过混合 200 mL 无菌的 5 倍浓度 M9 盐溶液（含 64 g/L Na2HPO4、15 g/L KH2PO4、2.5 g/L NaCl、5 g/L NH4Cl）制备 1 L M9 最小培养基。
    2. 加入 2 mL 1 M MgSO4（0.22 µm 滤膜除菌）、0.1 mL 1 M CaCl2（0.22 µm 滤膜除菌）和 4 g 葡萄糖（终浓度 0.4%，溶于无菌蒸馏水中并经 0.22 µm 滤膜除菌）。
    3. 用无菌蒸馏水定容至 1 L。
      注意：可根据需要添加氨基酸或维生素等补充物。
  4. 监测培养物，直至其光密度（OD600）达到约 1.2。然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），使其终浓度为 1.0 mM，以诱导蛋白表达。
  5. 在诱导后于 37 °C 继续培养 20 小时。
  6. 在 4 °C 下以 7,000 × g 离心 10 分钟收集细胞。
  7. 按以下步骤分离周质组分：
    1. 将细胞沉淀重悬于 0.4 倍体积的含 20% 蔗糖和 1 mM EDTA 的 30 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中，在室温下振荡孵育 10 分钟。
    2. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟。
    3. 将所得沉淀重悬于 0.4 倍体积的冰冻蒸馏水中，在冰上振荡孵育 10 分钟。
    4. 再次在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟。
    5. 收集上清液，即为周质组分，用于蛋白提取。
      注意：所有缓冲液必须含有蛋白酶抑制剂混合物，以防止蛋白降解。

2. 核磁共振实验

注意：所有实验均在 298 K 下使用 1H/15N/13C 三共振反向检测探头（见材料表）在 14.1 T 条件下完成。

  1. 基于配体的实验
    1. 样品制备
      1. 制备两个样品：一个含有CVN，另一个不含CVN（仅配体对照）。每个样品包含600 µL含50 mM NaCl的磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中80 µM的CVN。
      2. 加入D-甘露糖至终浓度为4 mM。
      3. 加入5%（v/v）D2O 至每个样品。
      4. 将样品转移至一支5 mm NMR管中。
      5. 使用相对于蛋白质50倍摩尔过量的配体。
        注意：通常建议配体过量范围为10倍至1000倍，对于小分子蛋白质，宜采用较低的过量倍数。
    2. D-甘露糖归属的光谱采集
      1. 获取二维 TOCSY 和二维 1H-13使用标准脉冲序列的C HMBC谱
        2D TOCSY：采用激发塑形进行水峰抑制的相敏总相关谱（TOCSY）（DIPSI2ESGPPH）。
        二维HMBC 1H-13C 异核多键相关梯度选择非去耦合检测（HMBCGPNDQF）。
        注意：这些实验旨在进行D-甘露糖的化学位移归属，但由于化学位移归属不在本研究范围内，相关结果未予展示。
    3. 通过配体的化学位移扰动（CSP）绘制配体结合图谱
      1. 用于样品制备及¹H-¹³C HSQC谱图采集，将D-甘露糖溶于含50 mM NaCl和5% D₂O的磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中，配制成4 mM溶液2O. 将溶液分为两份样品：一份含80 µM CVN，另一份不含CVN（仅配体对照）。
        注意：这些谱图将用于确定 D-甘露糖与 CVN 相互作用时的化学位移扰动（CSP）。
      2. 用于设置 1H-13C HSQC 采集参数，使用标准脉冲序列 HSQCETGPSI（梯度选择和灵敏度增强） 1H-13C HSQC）。设定以下采集参数：
        时域（TD）：1024 × 128 复数点（¹H × ¹³C 维度）
        谱宽（SW）：¹H 为 10.0171 ppm（6009.615 Hz），¹³C 为 80 ppm（12069.106 Hz）
        载波频率：¹H 为 4.7 ppm，¹³C 为 75 ppm
        - 扫描次数：448。
      3. 使用以下公式计算化学位移扰动（CSP）：
        CSP calculation formula, chemical shift perturbation equation, NMR analysis, scientific research.
        其中 Delta proton chemical shift symbol, relevant for NMR spectroscopy studies. 和 Δδ<sub>C</sub> symbol, chemical shift difference, NMR spectroscopy analysis, molecular structure study. 表示在存在CVN的情况下D-甘露糖的化学位移差异图1A，红色标记）和游离D-甘露糖（图1B).
    4. 通过饱和转移差（STD）技术绘制配体结合图谱
      1. 创建新数据集并配置 STD-NMR 实验参数。可采用两种实验策略：（i）筛选不同的饱和频率以优化信噪比；（ii）固定饱和频率并改变饱和时间以评估信号累积效应。
      2. 使用 zgpr 脉冲序列设置 1D ¹H NMR 实验。调节波谱仪至 ¹H 通道，进行匀场，并测量硬脉冲 90° 脉冲宽度（例如，在 -10.6 dB 衰减下约为 10 µs，相当于约 11.482 W）。
      3. 将¹H 载波频率中心设在约 4.7 ppm 处，对应水信号。
      4. 选择 STDDIFFESGP.3 脉冲序列，并按如下参数配置采集参数：
        根据样品要求设置谱宽。
        将扫描间延迟（d1）设置为 4 s。
        根据预期实验确定饱和时间（d20）。
        加载包含偏共振饱和频率（-40 ppm）和仅用于饱和蛋白质信号的共振频率的FQ2LIST。
        注意：共振频率必须对应蛋白质质子，且与任何配体信号至少相距1000 Hz，以避免直接饱和。
      5. 测试以下共振饱和频率以确定最佳条件：-0.59 ppm、0.73 ppm 和 8.1 ppm（参见 图 2A).
        注意：选择0.73 ppm作为共振饱和频率，因其可提供最佳的信噪比。使用该频率时，STD放大因子（ASTD) 作为饱和时间的函数进行定量分析。为此，在不同的饱和时间（0.5、1、1.5、2、2.5、3 和 4 s）下采集STD谱图，以构建STD增强曲线（图2B）。相应的 A性传播疾病 数值随后被绘制成饱和时间的函数关系图（图2C），从而评估饱和转移的效率，该效率与配体氢原子和蛋白质的接近程度及作用时间成正比。A性传播疾病 因子定义为：
        Spectroscopy formula, \(A_{STD} = \frac{I_{STD}}{I_{o}} \frac{[L]_{T}}{[P]}\), analytical method.
        我STD 是共振开启谱与共振关闭谱之间信号强度的差异，I0 是失谐谱中的信号强度，[L]T 是配体的总浓度，以及[P] 为蛋白质浓度。该归一化处理可消除浓度差异的影响，从而实现不同实验条件下结果的可比性。STD效应依赖于自旋扩散和缓慢的分子翻滚，以有效地将饱和度从蛋白质传递至结合的小分子配体。较大的蛋白质（翻滚较慢）可实现更高效的饱和以及磁化在蛋白质内部的更有效传播19,30,31,32.
      6. 将扫描次数（ns）设为64，并对实验进行4次循环（loop 4）平均。
      7. 将扫描总数计算为：总扫描数 = ns × l4。在直接维度（TD）中使用 32,768 个复数点，谱宽（SW）为 10.0171 ppm（6,009.615 Hz）。
      8. 将扫描间延迟（d1）设为 4 s，采集时间（AQ）设为 2.7262976 s。总弛豫延迟等于 d1 + AQ。
      9. 将饱和脉冲设置如下：持续时间 50 ms；波形为高斯形（p42）；受控 通过 程序9（SP9）
      10. 使用包含 T 的 STD 脉冲序列变体1ρ滤波器用于抑制残余蛋白质信号。根据蛋白质分子量设定自旋锁定时间（d29）：对于较大的蛋白质，使用较短的自旋锁定时间（约20 ms）；对于较小的蛋白质，使用较长的时间（> 40 毫秒。
        注意：所有STD谱均在599.93 MHz（BF1）下采集。d29参数的调整至关重要，需在尽量降低蛋白质背景信号的同时保持配体信号的完整性。如有必要，应通过实验经验优化该参数。
    5. 配体结合定位 通过 1H-R2
      1. 从Bruker标准库中选择CPMG_ESGP2D脉冲程序。该序列基于Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）实验，结合了激发 sculpting 技术以实现水信号抑制33.
      2. 将实验设置为二维采集。
        注意：这是一个伪二维实验，仅使用直接维度获取化学位移信息。
      3. 将采集参数设置如下：
        时域（TD）：在直接¹H维中为32,768个复数点。
        （TD1）：2 分。
        谱宽（SW）：7.9932 ppm（4,795.396 Hz）。
        扫描间延迟（d1）：4 秒。
        载波频率（o1）：4.7 ppm（以水信号为中心）。
        扫描次数（ns）：8。
        伪扫描次数（ds）：4。
        CPMG 延迟（d20）：≤1 毫秒（即短于 1⁄3 J_HH）。
        平均次数（TDav）：200。
      4. 运行实验，共200个循环，每个循环8次扫描，总计累积1,600次扫描。根据所需的CPMG循环总时间（T）调整变量计数器列表（vclist）。CPMG）。此处选择进行 2 个循环的 TCPMG8 毫秒和 200 个循环被选为 T 的参数CPMG=800 毫秒。
      5. 运行两次 1H-CPMG实验，分别针对含有蛋白质的样品（4 mM D-甘露糖和80 µM CVN）以及游离D-甘露糖（4 mM D-甘露糖）进行。
      6. 绘制 1每个 T 的氢谱CPMG通过 命令 efp（指数乘法，后接傅里叶变换和相位校正）或 sinm（正弦乘法，相移 90°，SSB=2），后接 fp（傅里叶变换和相位校正）。根据最佳处理策略调整窗函数。
        注意：本实验中使用了 sinm 和 fp。第 1st 序列将是具有 T 的光谱CPMG 8 毫秒（vclist 中的第一个）以及第 2 个nd 序列将持续800 ms（在vclist中为第二个）。处理后的 1H-谱图被绘制在 图3.
      7. 计算 CPMG 商值（Q） 通过 公式 3
        ​Q calculation formula; ratio of bound to free emission intensities at different times (diagram).
  2. 基于蛋白质的实验
    1. 样品制备
      1. 制备 600 µL 含 436 µM 均一标记的样品 15N标记的CVN溶于含50 mM NaCl和5%氘代水（D₂O）的磷酸钠缓冲液（pH 7.4）中2O）。将D-甘露糖滴加至样品中，最终浓度为60 mM。滴定过程使用5 mm核磁共振管。
    2. 共振指认（可选验证步骤）
      1. 使用已报道的化学位移值确认溶液中游离CVN的归属34采集以下三共振谱：HNCO、HNCA、HNCACB 和 CBCACONH35,36,37.
        注意：这些实验仅用于验证化学位移归属，由于化学位移归属并非本方案的主要目标，因此未展示相关结果。
    3. 通过蛋白质化学位移扰动分析揭示D-甘露糖在CVN上的结合位点
      1. 获取 1H-15N HSQC 谱 15在298 K下对N标记的CVN进行D-甘露糖滴定，依次加入D-甘露糖，使其终浓度分别为：0、1、2、5、10、20、40和60 mM。
      2. 设置 1H-15使用布鲁克标准库中的相敏FHSQCF3GPPH脉冲序列进行N型Fast-HSQC实验。采用以下参数：
        时域（TD）：1024 × 140 个复数点 1H 和 15N 维
        谱宽（SW）：16.0274 ppm（9615.385 Hz） 1H 维度和 34 ppm（2067.119 Hz）处 15N 维度
        载波频率：4.7 ppm（1H）和119 ppm（15N)
        扫描次数：128。
      3. 使用以下公式计算化学位移扰动（Δδ）：
        Chemical shift perturbation formula, CSP=sqrt(ΔδH²+(ΔδN/10)²), NMR analysis, equation.
        其中 Delta proton chemical shift symbol, relevant for NMR spectroscopy studies. 和 Δδ<sub>N</sub> symbol, key indicator in nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy analysis. 存在和不存在 D-甘露糖时 CVN 的化学位移差异图 4A).
        注意：系数10用于校正质子维与氮维之间光谱宽度的差异。
      4. 计算解离常数（KD通过绘制每个残基的CSP值相对于D-甘露糖浓度的变化曲线，将所得数据按以下方程（5）拟合为单一位点结合等温线。
        Equilibrium binding equation, CSP, formula; diagram for ligand-receptor interaction analysis.  方程 5
        其中 [PT] 是滴定中使用的蛋白质浓度（CVN），[PT] 是配体浓度（D-甘露糖），以及 CSPmax 是配体在饱和浓度下的CSP CSPmin 在缺乏配体的情况下。
    4. 绘制D-甘露糖与CVN的结合位点 通过 的 15N-R2 蛋白质的位置
      1. 测量 15N-R2 在无和有60 mM D-甘露糖的条件下，测定CVN各残基的数值。所有实验均在298 K下进行。
      2. 设置 15N-R2 使用布鲁克标准序列库中的基于CPMG的相敏脉冲序列HSQCT2ETF3GPSI3D进行实验。采用以下参数：
        时域（TD）：1024 × 128 个复数点 1H 和 15N 维，伪维度中有 8 个点。
        谱宽（SW）：16.0274 ppm（1H；9615.385 Hz）和34 ppm（15N；2067.119 Hz
        载波频率：4.7 ppm（1H）和119 ppm（15N).
        扫描次数：32次。（v）变量计数器列表：1、8、2、6、3、5、4 和 7，对应于弛豫延迟（T放松分别为 16.96、135.68、33.92、101.76、50.88、84.96、67.84 和 118.72 ms。
      3. 将伪三维谱作为一系列类似HSQC的谱图进行处理 1H/15使用 NMRPipe 进行氮相关弛豫谱分析38，按照软件教程（参见 材料表 有关教程的链接，请参见相关说明。
      4. 将处理后的谱图导入合适的核磁共振分析平台（例如，CCPNMR）39）。选择所有谱图并应用“跟随强度变化”工具，绘制每个交叉峰的强度随T的变化曲线放松 并使用单指数函数拟合衰减曲线以提取 15N-R2 每个残基的值。
      5. 根据67.84 ms处的HSQC样谱的信噪比计算实验误差。处理谱图中仅包含噪声的区域，并使用以下命令将其转换为文本文件：
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt
      6. 使用统计软件（例如 Origin(Pro)，版本 2021）确定噪声区域的标准差。将此值定义为噪声强度 I噪声.
      7. 使用以下公式计算每个残基的实验误差：
        R2 error equation; NMR data analysis formula for relaxation time, intensity, and noise analysis.
        注意：必须使用实验误差而非拟合误差。在进行比较时，实验误差决定了结果解释的限度 15N-R2 在无D-甘露糖和有D-甘露糖条件下。

α-D-甘露糖和β-D-甘露糖构象体的核磁共振谱分析；化学位移图。
图1：在CVN存在下D-甘露糖的化学位移扰动。（A）在CVN存在下D-甘露糖的1H-13C-HSQC谱图。（B）游离D-甘露糖的1H-13C-HSQC谱图。谱图中的标签显示了各个化学位移归属及其相应的异头构型（α或β）。红色标签表示归属于结合态构象的信号，黑色标签表示归属于游离态构象的信号。（C）在有（绿色）和无（蓝色）CVN存在时1H-13C-HSQC谱图的叠加。（D）α-和β-D-甘露糖的化学结构，突出显示观察到的化学位移扰动（CSP），该值根据公式（1）计算得出。绿色圆圈下方显示了CSP数值。红色圆圈代表在CVN存在时消失的β-异头氢信号。请点击此处查看该图的放大版本。

核磁共振谱和饱和转移差分析；显示不同时间下以 ppm 为单位的放大倍数的图表。
图 2：在 CVN 存在下 D-甘露糖的饱和转移差（STD）谱图。（A）在不同饱和频率下获得的 STD 谱图：-0.59、0.73 和 8.1 ppm。（B）在不同饱和时间下获得的 STD 谱图：0.5、1、1.5、2、2.5、3 和 4 秒。（C）根据公式 2 计算的 STD 放大因子（ASTD）随饱和时间的变化关系。请点击此处查看该图的放大版本。

NMR spectra of D-mannose binding to CVN; chemical shift diagrams; exchange dynamics analysis.
图3: 1H-R2 存在与不存在CVN情况下D-甘露糖的反应情况。 (AD-甘露糖预期结果的图示 1结合物与非结合物的 H-CPMG 谱图（使用 R 采集）2 弛豫时间为8 ms和800 ms时，在无CVN（底部）和有CVN（顶部）条件下的信号强度。Q值根据公式3计算得出。在无相互作用情况下（Q ≈ 1），配体在有无蛋白质存在时，两种弛豫时间下的信号强度保持相似。当发生结合时（Q < 1） < 1)，对于含有蛋白质的样品，信号强度随弛豫时间的增加而降低。B) D-甘露糖游离态与结合态之间化学交换的示意图。根据化学位移差（Δω）与交换速率常数（kex = k在 + k关闭），系统将处于慢速、中速或快速交换状态。C)1游离D-甘露糖及在CVN存在下的D-甘露糖的氢核磁共振谱，显示在8毫秒和800毫秒弛豫时间下信号强度的差异。针对特定氢原子（H6β，H3β，H5α，H4β显示了较低的Q值，表明与CVN的相互作用更强，并指明了参与结合的糖类区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。

化学位移扰动分析图、蛋白质结构及结合动力学图。
图 4：化学位移扰动（CSP）分析揭示 CVN 中参与 D-甘露糖结合的残基。（A）柱状图显示 CVN 在滴定 10 mM（上图）和 60 mM（下图）D-甘露糖时主链酰胺（15N-1H）的化学位移扰动（CSP）。水平线表示平均 CSP 加一个或两个标准差（av + sd，av + 2 sd），用作识别显著扰动残基的阈值。（B）将显著扰动的残基映射到 CVN 与二糖 Manα1-2Manα 形成的复合物结构上（PDB ID: 1IIY40）。CSP 超过 av + 2 sd 阈值的残基以红色突出显示，位于 av + sd 与 av + 2 sd 之间的残基以蓝色显示。二糖 Manα1-2Manα 分子以橙色显示，以指示其结合位置。（C）代表性结合曲线，显示 CSP 随 D-甘露糖浓度的变化。数据根据方程 5 按单一位点结合模型进行拟合以估算 KD，结果显示结合亲和力存在差异，其中 D44 的相互作用最强（KD = 1.1 ± 0.35 mM），E41 最弱（KD = 35 ± 29 mM）。请点击此处查看该图的放大版本。

蛋白质动力学分析；游离态与结合态下的R2弛豫速率比较；散点图与结构示意图。
图5：CVN在游离态及与D-甘露糖结合态下的15N-R2分析。（A, B）分别测量CVN在（A）游离态和（B）D-甘露糖结合态下各残基的横向弛豫速率（15N-R2）。（C）每残基的R2值差异（ΔR2 = R2bound− R2free）图示。蓝色和红色线分别表示与平均值相差一个和两个标准差（av ± sd 和 av ± 2 sd）。具有显著ΔR2值的残基已标注。（D）ΔR2值在CVN与二糖Manα1-2Manα复合物结构上的映射（PDB ID: 1IIY40）。ΔR2值高于或低于av± 2 sd的残基以红色显示；介于av± sd与av± 2 sd之间的残基以蓝色显示。D-甘露糖分子以橙色显示，以指示其结合位置。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

在本研究中，我们介绍了用于研究蛋白质-聚糖相互作用的核磁共振实验。蛋白质-聚糖分子识别是众多涉及细胞外基质（ECM）的生物学过程的基础，包括细胞黏附、迁移、增殖以及各种其他形式的细胞间通讯的调控。

本研究中，我们选择使用单糖 D-甘露糖，其被描述为一种弱结合配体。目标是阐述测量瞬时相互作用的方法，并强调其在阐明结合机制中的重要性。采用三种不同的基于配体的核磁共振（NMR）方法来表征配体的相互作用位点。

第一种方法是评估在CVN存在下D-甘露糖的化学位移扰动（CSPs）。为此，我们在相同的缓冲条件下记录了含有相对于CVN过量50倍的D-甘露糖样品的1H-13C-HSQC谱图（图1A）以及游离D-甘露糖的谱图（图1B）。两种异头构型均观察到化学位移变化（图1C）。值得注意的是，β-D-甘露糖的扰动更为显著，提示...

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讨论

核磁共振（NMR）波谱法是一种研究蛋白质-聚糖相互作用的多功能方法，尤其适用于检测弱且短暂的相互作用，例如CVN与D-甘露糖之间所观察到的相互作用。本文所述方案结合了基于配体和基于蛋白质的NMR方法，能够更全面地表征相互作用界面。

该实验方案的关键步骤包括精确控制蛋白质和配体浓度的样品制备、光谱参数的标准化，以及核磁共振实验的适当选择。数据的可重复性在很大程度上取决于样品的稳定性，尤其是在对溶剂饱和效应敏感的STD和WaterLOGSY21,43等实验中尤为如此。

通过从配体和蛋白质两个角度采用互补的核磁共振（NMR）方法，本研究得以验证结合位点，并检测潜在的变构效应或碰撞复合物的形成，这些现象通常难以观测。 通过 分离方法

在实际操作中，该方案可能需要根据所研究的体系进行调整。对于溶解度较低或表达量较低的蛋白质，可采用选择性同位素标记（...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

我们感谢国家核磁共振中心Jiri Jonas（CNRMN）提供核磁共振波谱仪的使用。我们感谢Carole Bewley博士与我们分享CVN与Manα1-2Manα复合物的化学位移归属。我们还感谢资助机构FAPERJ和CNPq的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
13C 葡萄糖Cambrige Isotopic Lab.CLM-481
15N 氯化铵Cambrige Isotopic Lab.NLM-467
氯化钙Sigma-AldrichC4901
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-Aldrich4693159001
D2OCambrige Isotopic Lab.DLM-4
D-甘露糖Sigma-AldrichM2069-5G
氯化镁Sigma-AldrichM8266
NMRPipe软件教程链接: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
磷酸氢二钾 (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786
氯化钾 (KCl)Sigma-AldrichP3911
磷酸二氢钾 (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Shigemi 管BrukerZ1Z10684A
氯化钠 (NaCl)Sigma-AldrichS9625
磷酸氢二钠 (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
磷酸二氢钠 (NaH2PO4)Sigma-AldrichS97263
Bruker 600 MHz 波谱仪Bruker
Bruker 800 MHz 波谱仪Bruker
硫胺素Sigma-AldrichT1270
三共振 TXI 探头Bruker
胰蛋白胨Sigma-Aldrich93657
酵母提取物Sigma-AldrichY1625

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