Method Article

柴胡在绝经后骨质疏松症大鼠模型中的骨保护作用

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这项研究中，我们使用绝经后骨质疏松症的卵巢切除大鼠模型来证明柴胡（柴胡）口服液通过抑制促炎因子和增强抗炎因子来改善骨微观结构。这表明其抗炎机制部分减轻了雌激素缺乏引起的骨质疏松症。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案旨在研究柴胡给药对卵巢切除术 （OVX） 大鼠绝经后骨质疏松症的影响。8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠采用背侧入路进行双侧卵巢切除术，建立绝经后骨质疏松模型。连续12周口服灌胃不同剂量的柴胡口服液，随后评估骨微观结构并测量炎性细胞因子水平。中高剂量柴胡治疗部分抑制了OVX大鼠的骨质流失，降低了促炎细胞因子的表达，并上调了抗炎细胞因子水平。骨破坏的严重程度从低剂量显着降低到高剂量，并且观察到骨微观结构重建的剂量相关改善。柴胡减轻了雌激素缺乏引起的骨质流失和微观结构恶化，从而抑制了该 OVX 模型中的 OP 进展。这可能是由于所涉及途径的抗炎作用造成的。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

骨质疏松症 （OP） 是一种常见的代谢性骨病，其特征是骨量减少、骨强度降低和骨微结构破坏1。OP 可表现为原发性或继发性，原发性 OP 分为绝经后 OP （PMOP）、老年性 OP 和特发性 OP（常发生在青少年中）。其中，I型PMOP主要发生在PM女性中，由于雌激素2的循环水平降低，绝经后骨密度明显下降。它是一种全身性代谢性骨病，导致破骨细胞活性增加和强烈分化3。此外，骨吸收的强度远大于其形成，导致骨量减少以及骨脆性和骨折风险增加4。

目前的研究发现，许多慢性炎症性疾病，如骨关节炎和牙周炎，都与严重的骨质流失有关，这表明炎症可能与OP5密切相关。随着PM女性年龄的增长，除了内分泌变化外，生理和免疫功能下降，身体长期处于慢性炎症状态。许多这些炎症促进因子和 T 细胞衍生的细胞因子在骨质流失中起着重要作用。因此，PMOP也被认为是一种慢性炎症性疾病6,7。

中医药在PMOP的防治方面历史悠久，临床经验丰富，注重整体管理和个体化诊疗，能同时调节内分泌和免疫系统，是绝经后妇女的福音8。它使很大一部分妇女能够获得医疗。现代药理研究和临床试验表明，中药具有多靶点、低毒低副作用、价格便宜等优点。PMOP9的中医治疗可大大降低并发症的风险。

柴胡本身具有抗炎10 和抗抑郁11的特性，它可以调节体内激素分泌12 ，并有助于身体健康13。柴胡是中医复方逍遥丸中起主要作用的主要成分，具有舒缓情绪、促进消化、肠胃吸收的作用。它还以补充气血能量以及调节月经周期症状及其相关不适而闻名14。柴胡的主要成分是柴胡皂苷，具有很强的抗炎活性，主要表现在抑制促炎细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β和IL-615。此外，它还能增强抗炎细胞因子IL-10的表达，从而减轻炎症，如结肠炎、子宫内膜炎和16型肝炎。

与标准OP治疗（包括使用双膦酸盐17、选择性雌激素受体调节剂18、狄诺塞麦19）相比，柴胡作为常用中药具有多组分、多靶点作用机制的潜在优势。标准疗法通常针对特定的骨代谢途径20（抑制破骨细胞活性），这可能与某些副作用有关，例如胃肠道不适、颌骨坏死风险增加和流感样症状，以及高昂的长期药物成本21。

对相关文献的回顾发现，使用柴胡干预患有OP的PM大鼠可能具有治疗缓解作用22。因此，基于生物信息学和药理学分析以及分子对接模拟预测对接位点23，我们假设柴胡可以干预炎症过程，调节机体的免疫状态，恢复骨免疫稳态。这些将有利于骨重建状态的稳定性，达到缓解OP的预期治疗效果。

本研究连续 12 周采用柴胡口服液（浓度：1 g/mL）给药。给药方案是根据中医临床常用剂量和药代动力学研究设计的24。

该给药方法的总体目标是建立稳定且临床相关的给药方案，从而系统地评估柴胡在靶模型（绝经后骨质疏松症大鼠模型）中的持续干预效果。这种给药方式确保药物在整个实验期间保持有效的血浆浓度，为后续评估（如骨代谢指标和炎症因子水平）提供可靠的干预依据。此外，它还有助于阐明柴胡在相关疾病中的作用及其剂量效应关系，同时为中药在实验研究中的规范给药提供参考范式。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有涉及动物的实验程序均按照NIH实验动物护理和使用指南（第8版）进行，并经右江医科大学民族动物伦理委员会特别批准（批准号2024071001）。

1. 分析网络药理学

注意：网络药理学是一种结合系统生物学、计算生物学和药理学的方法，旨在通过分析生物分子网络来了解药物的作用机制和药物相互作用25。

  1. 使用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP：http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）等工具筛选具有良好口服生物利用度（OB）和药物相似性（DL）的活性化合物。将 OB 设置为 ≥30%，将 DL 设置为 ≥0.1826.搜索柴胡，点击 草药详情 ，下载所有化合物数据。将下载的文件命名为 Chaihu。
  2. 通过将核心成分的MOL ID粘贴到TCMSP数据库中，获取核心成分的目标名称。粘贴到 TCMSP 批量搜索中，选择 目标预测， 然后单击 提交。
  3. 打开UniProtsh数据库，将Target Name列复制到搜索中，找到粗体蛋白名称，与粘贴的靶蛋白名称完全相同。找到相应的蛋白质名称后，在后面的列中收集相应的基因名称。
  4. 根据相关性评分≥ 1 过滤 GeneCards （https://www.genecards.org） 数据库中的骨质疏松症相关基因，并获得所有 （5741） 基因27。
    注意：从 GeneCards 数据库中选择相关性评分为 ≥ 1 的基因的原因如下：分数≥ 1 表示该基因已记录与目标疾病的关联，清楚地将其与未报告关联的基因区分开来（评分 = 0）。该阈值确保保留具有可信疾病相关性的基因，同时避免来自不相关基因的过度干扰。较低的阈值 （<1） 可能包括没有经过验证关联的基因，从而增加假阳性。
  5. 将疾病相关基因集与药物靶点结合进行交叉后，获得相交基因。基于疾病靶点与药物活性成分的相互作用，利用Cytoscape软件构建中药-活性成分-靶点-疾病交叉网络。
  6. 通过String数据库（https://cn.string-db.org/）获取蛋白-蛋白相互作用（PPI）信息，构建PPI网络。打开 Cytoscape（https://www.cytoscape.org），在上传网络加载下载的 TSV 文件，然后选择 > TOP10 或 TOP20 计算，然后单击 提交。
  7. 创建两个表以导入 Cytoscape。创建一个名为“网络”的电子电子表格文件。在 A 列中，输入已替换为中药缩写的相同 MOL ID（CH1、CH2...）。将列 B 标记为 MOL ID，并按 MOL ID 升序排序。将列 C 标记为符号。将柴胡相关文件中的组分 ID （MOL ID） 和基因名分别复制到 B 列和 C 列中。然后删除 B 列并将 A 列重命名为 MOL ID。
  8. 将表格扩展到文本末尾。在符号列中，输入 MOL ID（CH1、CH2...），替换为中药的缩写。在MOL ID栏中，输入中药的缩写：CH。通过以上步骤，完成了信息补充和中医药-组件-靶点网络的建设。
  9. 接下来，执行第二种形式，即 TYPE 文件。创建一个新的电子表格并将其命名为 TYPE。将 A 列标记为 Term，将 B 列标记为 TYPE。将基因名称复制到术语列中，并在类型列中赋予其基因属性（目的是搜索基因，所有基因名称都会被选中，以便于作）。将成分输入到“术语”列中，并为该成分指定属性 drug1。
  10. 导入 Cytoscape 软件。导入网络上传网络文件，导入表上传类型文件。在搜索框中，键入 gene，按 Enter，以便选择所有基因，将所选基因拉到左侧，然后单击 Layout > Attribute（） > Selected （在括号中选择圆形或方形）。
  11. 将网络药理学分析结果与实验数据相结合，确定药物作用的关键化合物和分子机制。

2. 分子对接

注意：分子对接是一种计算技术，用于预测小分子（配体）与靶蛋白或生物分子28之间的最佳结合模式和亲和力。

  1. 受体和配体制备
    1. 受体（蛋白质）来源：从 RCSB 蛋白质数据库 （https://www.rcsb.org） 获取目标蛋白质的 PDB 文件。搜索 3Q4B（IL-6 受体示例），单击下载 PDB 格式>文件。
    2. 通过单击编辑 >删除>水、外来离子和非必需配体（保留关键辅助因子，如金属离子） >单击>杂原子来删除晶体学水分子。通过单击 “编辑”>“氢”>“添加”来添加缺失的氢原子。另存为 protein.pdbqt。通过单击 “编辑>电荷”>“计算 Gaseiger”，然后单击“网格”>“大分子”>选择“另存为 PDBQT”>。
    3. 配体（小分子）来源：从 PubChem （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 下载配体结构。搜索 Saikosaponin A （CID：6443568），单击 3D 构象异构体>下载 SDF。
    4. 使用Open Babel软件将SDF格式的Saikosaponin A文件转换为具有低能三维构象的PDB格式文件，并将其命名为saikosaponinA。
  2. 停靠参数设置（自动停靠工具）
    1. 加载受体和配体文件。导入小分子文件 saikosaponin A 并将其保存为 PDBQT 文件。随后，加载受体和配体：单击对 接>大分子>打开，选择 IL6_receptor.pdbqt;然后单击对 接>配体>打开，选择 saikosaponinA.pdbqt。
    2. 配置网格框：单击 网格>网格框，调整框大小以完全包含活动站点（使用左侧面板上的控制拨盘进行微调），然后通过单击文件 >关闭保存当前 并命名为文件 grid.gpf 来保存当前设置。
    3. 设置 AutoGrid 运行程序：单击 “运行 AutoGrid”，选择 grid.gpf 文件，然后单击 “启动”。接下来，配置对接参数：依次，在对接菜单下，单击 大分子 ，选择蛋白质文件 IL6_receptor.pdbqt;单击 配体 ，选择小分子文件saikosaponin A.pdbqt;设置遗传算法并确认;调整对接参数并确认。最后，在“输出”中，选择 拉马克 （4,2） 算法，将文件命名为 dock.dpf，然后保存。
    4. 执行 AutoGrid 并保存结果：单击 Run AutoDock，选择 dock.dpf 文件，然后启动模拟。完成后，单击 “写入复杂”，命名复杂结构，并将其保存为 PDBQT 格式。
  3. 使用 PyMOL 进行结果分析
    1. 使用Open Babel软件将从上一个分子对接步骤获得的PDBQT格式文件转换为PDB格式。然后将PDB格式文件导入PyMOL软件，进行后续可视化作。
    2. 找到配体并将其单独分离：选择配体后，通过单击 Sele 然后从 颜色中选择 颜色来更改其颜色。在“Sele”列中，单击“作”下的“ 提取对象 ”，将配体提取为新的独立对象。
    3. 氢键距离测量：在sele列中，单击 “作”，找到“极性接触”，然后单击“ 到对象中的其他原子”;氢键将显示为黄线。单击向导列中的 测量 选项，按顺序单击 氢键两端的原子 ，然后单击 完成 完成测量。
  4. 导出图像：单击“在文件中 将图像导出为 PNG” 。如果需要高清渲染，请输入 ray 300（像素可调）并按 Enter。

3. Micro-CT分析

  1. 腹膜内注射雌性SD大鼠（32周龄，320-350g）戊巴比妥钠（40mg / kg）进行深度麻醉，通过没有角膜反射（棉签触摸时不眨眼）和疼痛反射（镊子捏时没有后肢收缩）确认。
    1. 进行后肢隔离手术。腹腔注射喷巴比妥钠，剂量为手术麻醉剂量（40mg/kg）的3-5倍，对大鼠实施安乐死，仰卧，沿腹股沟韧带在耻骨联合上方1cm处做一个3cm的横向切口。钝地解剖薄肌和缝匠肌之间的间隙，露出股动脉（搏动性管状结构）。使用 4-0 缝合线结扎股动脉两端，在中间留下一个未结扎的部分，然后用眼科剪刀截断血管并横切它。
    2. 向内旋转下肢，使股骨头从髋臼上脱位，切断关节囊和圆韧带，保持股骨头完整性。将完整的后肢浸入预冷的盐水中，然后在4%甲醛溶液中固定24-48小时。
  2. 成像设置：将固定股骨送到设施进行显微 CT 扫描。打开 Micro-CT 设备并选择 小动物骨扫描 预设程序。使用以下扫描参数：X 射线电压 = 90 kV，X 射线电流 = 80 μA，视场 （FOV） = 36 mm，像素大小 = 72.0 μm，旋转 = 360°，扫描持续时间 = 14 分钟。
  3. 将固定大鼠的左腿股骨放入样品架中，固定待拍摄的股骨骺，启动装置，等待机器自检完成。启动预览扫描（低分辨率快速扫描）以确认样品居中，然后调整感兴趣区域以覆盖整个股骨。
  4. 扫描和拍摄完成后，X射线光源将自动关闭。此时，机器内部的辐射值超标，绝对禁止在没有防护用品的情况下取出样品。
  5. 图像分析：使用扫描仪的内置软件分析骨参数（骨矿物质密度 [BMD]、小梁数）。保存并导出重建的图像以供进一步评估。

4. 用于从大鼠骨组织中提取RNA的实时荧光定量PCR

  1. 去除右股骨的粘连肌肉和筋膜。将 100-200 毫克骨组织切成小块。加入 2-3 个研磨珠和 500 μL RNA 提取缓冲液。使用组织研磨机在 70 °C 下以 70 Hz 均匀化 5 分钟。
  2. 相分离：离心后，溶液分离成上层水相（含有RNA）和下层暗沉淀物（含有蛋白质、DNA和多糖）。小心地将 500 μL 上清液转移到新的不含 RNase 的 1.5 mL 管中。
  3. 根据制造商的说明处理从分离中获得的上层溶液以提取总 RNA。
  4. 将异丙醇加入裂解液中后，轻轻倒置试管以混合溶液，并在室温下静置10分钟。此时进行目视检查;如果观察到白色絮状RNA沉淀（粘附在管壁上），则表明RNA已被有效沉淀。
  5. 使用 200 μL 移液器吸头吸出残留液体。将白色 RNA 沉淀保留在管底部/壁上。将RNA重悬于50-100μL不含RNase的水中，并储存在-80°C。
  6. 在无核酸酶管中混合 2 μL RNA 模板、10 μL 预混液、2 μL DNase 和 5 μL 无核酸酶水。通过移液轻轻混合。
  7. 在 37 °C 下孵育 2 分钟以去除基因组 DNA 污染。在55°C下孵育15分钟。反应结束时，在85°C下孵育5分钟以中止反应。
  8. 通过将逆转录的DNA放在冰上来配置实时荧光定量PCR系统。预混合所有组分：10 μL qPCR SYBR 绿色预混液（无 Rox）、正向引物和反向引物各 0.4 μL 以及 8.2 μL 无 RNase 水，分开并加入 1μL DNA，在冰上作，避光。
  9. 按如下方式运行qPCR程序：在95°C下预变性5分钟，1个循环，然后在95°C下变性10秒，持续40个循环。在 60 °C 下在 SYBR Green 通道中进行退火、延伸、荧光采集 30 秒，持续 40 个循环。获得温度范围为 65-95 °C 的熔解曲线，增量为 0.5 °C/步，增量为 5 秒/步。所使用的引物如 表1所示。

5. 动物准备

  1. 获得48只雌性未产SD大鼠（SPF级，8周龄，体重200-220克）。
  2. 在实验程序之前，使所有大鼠在SPF级隔离设施中适应7天的隔离期，并饲养在SPF控制的实验室环境中（温度：22-24°C，湿度：45%-55%）。

6.受试药物的制备

  1. 取得柴胡口服液（中国国家医药品批准第Z41021539号）。该配方含有柴胡（北方来源）作为活性成分，辅料包括调味剂、蔗糖和丙二醇。每 10 mL 小瓶含有相当于 10 g 粗草本的提取物。

7.卵巢切除大鼠模型的制备

  1. 术前准备：快速大鼠12小时，随 意 取水。通过高压灭菌所有手术工具进行器械灭菌。
  2. 麻醉和准备：通过腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）给予。通过评估角膜反射缺失（用棉签接触角膜时不眨眼）和脚趾捏反射缺失（夹紧时后肢无回缩）来检查麻醉深度。15-20分钟后，剃除手术部位，用碘消毒，并用开窗单覆盖。手术过程中涂抹维生素A眼药膏（含15,000 IU/g），防止动物眼睛干燥（表2）。
  3. 卵巢切除大鼠模型：在专用的无菌手术室进行手术。所有人员都穿着全套隔离服。手术前用 75% 乙醇 （表 2） 擦拭台面和周围设备，并打开紫外线灯至少 30 分钟，以消除空气和表面上的微生物。
    1. 在背部皮肤上切开1厘米的切口，钝地解剖皮下组织，捏起肌肉层，做一个1厘米的切口。找到脂肪垫并将其外部化以识别卵巢（鲜红色）。用4-0缝合线结扎输卵管，切除卵巢组织，并将其放入含有4%多聚甲醛的50mL离心管中（表2）。
  4. 伤口闭合和消毒：缝合前将青霉素粉撒入伤口。用6号不可吸收缝合线缝合肌肉层，用2号缝合线闭合皮肤。用碘对闭合切口进行消毒，并涂抹外用青霉素粉。
  5. 术后护理：将老鼠放入新鲜的笼子中，并配有温水瓶和毛巾，以保持体温。术后24小时禁食（允许水）动物，以防止肠梗阻。连续 3 天每天将青霉素粉涂抹在切口部位。
    1. 在手术切口周围注射利多卡因（1%-2%浓度，最大5mg/kg），以减轻术后即刻疼痛。提供持续镇痛 3-5 天，根据疼痛严重程度逐渐减量剂量，以避免突然停药。
    2. 醒来前保持动物处于侧卧位或头朝下位，以防止舌头掉落和气道阻塞;醒来后允许自主舒适的定位。将术后动物与其他动物隔离，直到完全康复，以避免战斗或交叉感染（图1）。

8. 实验分组和给药

  1. 分组：将共40只SD大鼠分为五组（每组n=8只），即正常对照、模型对照、低浓度柴胡、中浓度柴胡和高浓度柴胡。
  2. 对于中等剂量 （5 mL/kg） 组，根据29,30 中的指南选择剂量。低浓度组：2.5 mL/kg、中浓度组：5 mL/kg和高浓度组：10 mL/kg的浓度梯度比为1：2：4。
  3. 给药：使用口服强饲法，每日给药一次。对于正常对照组和模型对照组（接受双侧卵巢切除术的动物），用等量的生理盐水进行口服灌胃。手术后第 1 周开始治疗并持续 12 周。

9. 实验后分析和数据收集

  1. 对五个动物组进行以下分析：骨结构的显微CT和大鼠股骨组织中炎性细胞因子mRNA表达的测定。
  2. 收集数据，包括股骨小梁微观结构的可视化图像;定量骨参数（包括骨矿物质密度、骨体积分数、小梁厚度标准差、小梁间距、小梁数和连接密度）;股骨组织中促炎细胞因子（IL-6、IL-17）和抗炎细胞因子（IL-4、IL-10）的相对mRNA表达水平。
  3. 使用 GraphPad Prism 10.1.2 软件通过单因素方差分析 （ANOVA） 进行数据分析。均值组间差异的统计学显着性定义为 p < 0.05。使用 Tukey 检验执行事后多重比较。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GO功能与KEGG通路富集分析

我们依靠生物信息学中的GO和KEGG富集分析来预测柴胡对PMOP的潜在作用机制。对与柴胡有效成分相交的疾病靶基因进行GO富集分析，共产生2138个显著条目，并列出了每组的前十个显著结果 （图2D）。关于生物过程 （图2A），相交基因主要参与对脂多糖和活性氧的反馈。在细胞成分部分 （图2B）中，相交基因主要涉及细胞分泌颗粒的管腔和含胶原蛋白的细胞外基质。在分子功能方面 （图2C），参与交叉基因的主要因素是核受体活性和...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PMOP 是一种全身性骨代谢紊乱，常发生在 PM 女性身上，它是由缺乏雌激素导致成骨细胞-破骨细胞平衡被破坏，导致破骨细胞骨吸收增强和成骨细胞骨生成减少引起的31。越来越多的研究表明，体内炎症因子的水平也会影响破骨细胞和成骨细胞之间的分化，促炎因子的过度表达有助于破骨细胞的分化32。同样，抗炎因子的过度表达会抑制破骨细胞的表达33。这表明使用抗炎驱动的方案治疗 PMOP 可能是可行的。

中药柴胡在临床上被广泛用于治疗炎症、预防感冒和流感、调节体内激素分泌、保护肝脏34.草药配方中的柴胡是与其他药物联合治疗 PMOP 的现成产品35.因此，我们想证明柴胡治疗PMOP的能力是从其自身的药理特性--抗炎的角度出现的。

在实验过程...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了百色市科研与技术开发计划、2025年广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（项目编号：2025KY0549）的支持。作者感谢伦敦帝国理工学院的 Dev Sooranna 博士和 YMUN 的稿件编辑。ZY 和 LYR 对这项工作做出了同等贡献。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.9%氯化钠注射液 华人制药电话：1712059
1&次;PBS 赛默飞世10010023
75% 酒精 南京试剂C069156931
95%乙醇 南京试剂C0691520075
无水乙醇麦克林E809056
柴胡 河南百泉药房有限公司Z41021539
脱钙液&NBSP;太阳能生物E1171
红霉素软膏&NBSP;广州白云山药业集团有限公司白云山河济公制药厂H44023088
异丙醇 济南金日和化工有限公司23727-29-9
青霉素 V 钾胶囊四川制药H20103156
聚甲醛（CH2O）n碧奥泰姆P0099
聚维酮碘消毒剂&NBSP;广东恒健药业有限公司H44023924
实时荧光 PCR 试剂盒亿森生物科技11201ES03型
RNA提取试剂盒单纳德生物技术MI20201S
RNA 逆转录试剂盒宇工生物科技EG15123S
戊巴比妥钠 上海吉祥生物科技有限公司JX082085
曲唑 赛默飞世15596026CN

References

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