方法文章

FRET稀释法分析蛋白质组装间的动态交换

DOI：

10.3791/68678

⸱

2025年9月19日

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了反射蛋白A1的纯化与共价标记，以及一种FRET稀释检测法，用于表征反射蛋白在蛋白组装体之间动态交换随时间变化的情况。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作为头足类动物可调虹彩现象的分子驱动因素，反射蛋白A1（reflectin A1）的可调相变行为一直是生物材料工程研究的焦点。通过调节盐浓度和反射蛋白A1的净电荷密度，可促使该蛋白形成动态聚集体，作为液-液相分离过程中的中间态。这些反射蛋白聚集体的尺寸受限于蛋白阳离子间库仑排斥作用的中和程度，在初始阶段仍与周围溶液中的单体或寡聚体进行动态交换。本研究结合荧光共振能量转移（FRET）稀释实验、动态光散射（DLS）和蛋白质浓度测定，表征了反射蛋白A1聚集体与稀相之间蛋白质双向交换通量随聚集体形成时间的变化关系。该FRET稀释实验能够区分蛋白质单向或双向进出蛋白聚集体的过程，因此可用于聚集体形成过程中的动态监测。区分动态聚集体与动力学受阻聚集体对于理解其生物物理起源至关重要，而这一新型FRET稀释实验方法亦可推广应用于其他蛋白质聚集体的生物物理研究中。

引言

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可调结构色 枪乌贼科 鱿鱼的虹彩细胞中由反射蛋白介导1,2,3虹彩细胞含有广泛且规则的膜内陷结构，形成富含蛋白质的布拉格层状结构堆叠，能够以依赖角度和波长的方式反射光线。1,4,5,6乙酰胆碱触发的信号级联反应最终导致阳离子型反射蛋白的磷酸化1,2,7，减少蛋白质内和蛋白质间的静电排斥，从而驱动反射蛋白在布拉格层状结构中从流体动力学半径为10-50 nm的颗粒凝聚为致密的液相凝聚物3,8,9反射蛋白 A1 体外 形成尺寸稳定的组装体，其半径大于10 nm，且组装体尺寸通过蛋白质净电荷密度精....

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方案

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所用试剂和设备列于材料表中。

1. 蛋白质纯化与共价标记

  1. 转化
    1. 将反射蛋白 A1 和反射蛋白 A1 C232S 基因（GenBank KF661517.1）克隆至 pj411 质粒中。
    2. 使用热激法将质粒转染至 Rosetta 2 (DE3) 细胞28。
    3. 将转染后的细胞涂布于含 50 µg/mL 卡那霉素的琼脂平板上。
    4. 挑取单个孤立菌落，加入含 50 µg/mL 卡那霉素的 5 mL TB（优质肉汤）中，于 37°C、250 rpm 摇床中过夜培养。
    5. 按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用于测序。
  2. 蛋白表达、裂解及包涵体纯化
    1. 将 5 mL 培养物接种至含 50 µg/mL 卡那霉素的 1 L LB（溶菌肉汤）中，于 37°C 摇床中培养。当 A600 达到 0.6–0.7 时，加入 IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至终浓度 5 mM 以诱导表达。
    2. 16 小时后，于 12,000 xg 离心 10 分钟收集菌体。弃去上清液，将菌体沉淀置于 -80°C 冰箱中冷冻保存。
    3. ....

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结果

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将含有供体荧光团标记蛋白和受体荧光团标记蛋白的反射蛋白A1组装体与未标记的反射蛋白A1组装体稀释后，观察到相对于未稀释组装体在588 nm处的FRET发射出现初始下降（图2A）。0分钟龄组装体的FRET值与阳性对照相似，而1620分钟龄组装体（即组装形成后与未标记及标记反射蛋白组装体混合之间的时间）的FRET值低于阴性对照（图2A）。以Em588/Em520比值对组装体年龄作图显示，整个组装体群体最初完全处于动态交换状态，且随着组装体年龄增加，动态交换程度逐渐降低（图2B）。对于24小时龄的组装体，仅有19%的群体参与了动态交换（图2B）。

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讨论

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在纯化过程中，蛋白质损失的一个常见原因是包涵体沉淀在包涵体纯化方案的所有步骤中未能完全重悬，以及最终将纯化的包涵体重悬于8 M尿素、5% v/v乙酸溶液中时操作不当。包涵体的复溶可能需要在40 mL锥形管中使用小型磁力搅拌子进行长达24小时的剧烈搅拌。为避免蛋白质在滤膜上发生显著损失，我们用离心步骤取代了FPLC和HPLC前的过滤操作，即在15,000 × g 条件下离心70分钟，以澄清溶液并去除可能堵塞液相色谱系统的较大颗粒。包涵体的相对纯度允许在纯化过程中省略FPLC步骤，单独使用HPLC可能已足以纯化reflectin A130；然而，反相HPLC柱将需要更频繁的深度清洗。为保持方案的完整性，本方案中仍包含了FPLC步骤。

野生型 reflectin A1 是一种难以进行共价标记的蛋白质，因为它仅在 pH 值为 4.5 或更低时才以单体形式存在10,11,

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由美国陆军研究办公室通过资助编号W911NF-19-2-0026和W911NF-23-1-0330的协同生物技术研究所提供支持。所包含信息的内容不一定反映政府的立场或政策，不应推断出官方认可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 μL 量程微量移液器
2 μL 量程微量移液器
2-[(5-荧光素基)氨基甲酰基]乙基甲烷硫代磺酸盐Santa Cruz Biotechnologiessc-216155CAS 351330-42-2
20 μL 量程微量移液器
200 μL 量程微量移液器
3-(N-吗啉代)丙磺酸，4-吗啉丙磺酸Sigma-AldrichM1254CAS 1132-61-2
乙酸Sigma-AldrichA6283CAS 64-19-7
乙腈Sigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
琼脂粉Carolina Biological842133CAS 9002-18-0
铝箔
Amicon Ultra 离心滤膜管，10 kDa 截留分子量Millipore SigmaUFC5010080.5 ml 容量
Amicon Ultra 离心滤膜管，10 kDa 截留分子量Millipore SigmaUFC90100815 ml 容量
分析天平
苯并核酸酶（Benzonase）Millipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
BugBuster 蛋白提取试剂Millipore Sigma70584-3
Cary Eclipse 荧光分光光度计Cary-Eclipse
Cary Eclipse 软件
Corning 50 ml 离心管Millipore-SigmaCLS430829
一次性注射器，Luer-Lok 接头，10 mLCole-ParmerUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichD8418CAS 67-68-5
干冰
双泵 FPLC 系统
双泵 HPLC 系统
乙醇Millipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
落地式离心机转子，500 ml 瓶容量
落地式离心机 
冷冻冰箱，-80°C
通风橱
盐酸胍Thermo ScientificAAA135430B50-01-1
HiTrap SP HP 阳离子交换层析柱Cytiva17115101
盐酸Sigma-Aldrich258148-25MLCAS 7647-01-0
培养箱
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）Sigma-AldrichI6758-1G
硫酸卡那霉素Sigma-AldrichK1637CAS 25389-94-0
冷冻干燥机
溶菌酶Thermo Scientific90082
磁力搅拌子
磁力搅拌板
微型 pH 电极 S7Metler Toledo51343160
带温控功能的微量离心机
Millex PVDF 注射式滤器MilliporeSLGVR33RS0.22 μm，33 mm 直径
Milli-Q Millipak 滤器Millipore SigmaMPGP002A1
Milli-Q 超纯水纯化系统Millipore Sigma
NaClThermo ScientificAA12314A9CAS 7647-14-5
Nalgene 离心瓶，型号 3120Millipore-SigmaB1283-4EA用于细菌沉淀
带培养箱的轨道摇床 
PC
培养皿Sigma-AldrichP5731-500EA
pj411 质粒DNA 2.0
Protein LoBind  锥形管EppendorfEP301083025 ml 容量
Protein LoBind  微量离心管EppendorfEP0224311020.5 ml 容量
Pyrex 带挡板锥形瓶，1,000 mlMillipore-SigmaCLS44501用于细菌培养孵育
Pyrex Griffin 烧杯，2,000 mLMillipore-SigmaCLS10002L用于所有缓冲液和溶液配制 
Pyrex 圆形培养基储存瓶，1,000 mlMillipore-SigmaCLS13951L用于所有缓冲液和溶液的储存，可与抽滤瓶配套使用
Qiaprep Spin Miniprep 试剂盒Qiagen27104
冰箱
Rosetta 2(DE3) 感受态细胞Novagen71397-3
Slide-a-lyzer 透析夹，10K 截留分子量Thermo ScientificPI663830.5 ml 容量
三水合乙酸钠Sigma-AldrichS8625CAS 6131-90-4
氢氧化钠Sigma-Aldrich567530-250GMCAS 1310-73-2
Steritop 真空瓶顶滤器Millipore SigmaS2GPT05RE0.22 μm 无菌滤膜
微量比色皿，50 μL 容量Starna Cells16.40F-Q-10/Z15
磺基罗丹明甲烷硫代磺酸盐（sulforhodamine methanethiosulfonate）Santa Cruz Biotechnologiessc-220172CAS 386229-71-6
三氟乙酸Sigma-Aldrich106232-25GCAS 407-25-0
胰蛋白胨Spectrum Chemical T1333
尿素Thermo ScientificAAA123600ECAS 57-13-6
紫外-可见分光光度计
酵母提取物Gibco211929

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al.

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