小鼠肠系膜淋巴结切除术以选择性阻断特定区域肠道的淋巴通路

摘要

本方案描述了一种可存活的小鼠肠系膜淋巴结清扫术，该手术安全且耐受性良好，可沿肠系膜淋巴结链的四个站点分别进行。本方案具有可调整性，可用于选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴通路。

摘要

免疫监视与抗原耐受在肠道微环境中处于精细的平衡状态，其中循环T细胞在局部淋巴结中的启动作用已被广泛认知。在T细胞启动之后，近期文献开始揭示一类定居于器官引流淋巴结中的非循环T细胞具有独特且不可替代的功能。这一现象在肠道中可能尤为显著，因为肠道的淋巴引流具有高度特异性。然而，为了真正理解这些局部T细胞的独特作用与全身性功能冗余之间的差异，科学界亟需一种描述清晰的方法，以分离并选择性干扰这些淋巴结。本文介绍了一种可在肠系膜淋巴结链上四个不同部位安全实施、耐受性良好的小鼠肠系膜淋巴结切除存活手术。该手术方法可灵活调整，以选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴引流通路。文中提供了详细的步骤说明、可视化辅助图示、提高手术成功率的实用技巧，以及针对术后存活不佳情况的故障排除方案。如需进一步下游分析，切除的淋巴结可立即用于后续处理。该技术最适合需要选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠淋巴引流的研究应用。

引言

T细胞是适应性免疫中主要的效应细胞类型之一，在多种疾病类别中均具有重要作用，包括感染、自身免疫和恶性肿瘤^1,2,3。T细胞发挥功能的关键步骤是由次级淋巴器官（如局部淋巴结）中的抗原呈递细胞对其进行三阶段的启动⁴。在现代医学中，对多个器官系统实施规范的肿瘤根治性切除通常包括一定程度的局部取样或整块淋巴结切除^5,6,7,8。例如，在结肠癌治疗中，共识指南建议在根治性切除术中应切除并检查至少12个淋巴结，因为这与改善的长期生存率存在明确的相关性^6,7。然而，局部淋巴结是否真的可以毫无代价地被切除？近期在小鼠中的研究表明，肿瘤引流淋巴结中含有抗肿瘤T细胞前体的储备库，这些前体可能避免了在肿瘤微环境中发生的终末分化和T细胞耗竭^9,10,11。这表明，切除如此关键的细胞群体可能会削弱正在进行的免疫监视能力。

已知小鼠肠道淋巴引流模式在肠系膜淋巴结链上具有高度特异性；例如，近端结肠几乎完全由第一淋巴结站引流，小肠由第二/第三站引流，远端结肠主要由第四淋巴结站引流¹²（图1，补充图1）。因此，通过靶向消融这些淋巴结，可中断肠道各节段与淋巴系统之间的直接通讯。为阻断淋巴结与组织之间的细胞迁移，通常使用S1P受体激动剂（如FTY720）或整合素阻断剂；然而，这些药物广泛抑制细胞迁移，因而无法用于研究特定淋巴结的独立作用^13,14。然而，由于缺乏针对每个淋巴结站的详细描述的手术切除方法，科学界在研究肠道淋巴结内免疫相互作用的局部效应方面受到限制。鉴于这一空白，本文建立并描述了一种针对小鼠各淋巴结站的肠系膜淋巴结切除存活手术。该手术的总体目标是在小鼠中安全、可靠地切除肠系膜淋巴结站（或多个站），并实现较高的术后存活率和良好的耐受性。

该操作已在多种品系的幼年和成年小鼠（例如 Balb/c、C57BL/6J、129S4）中经过测试，并易于实施，但其应用受限于需要具备可及且易于识别的淋巴结。因此，该方法可能不适用于淋巴结较正常小鼠更小或难以察觉的小鼠模型或基因型（例如淋巴毒素-α缺陷小鼠）¹⁵。此外，较年长的小鼠（>15 周）通常具有更多的内脏脂肪，使得淋巴结的识别与分离更加困难；尽管这并非绝对禁忌，但可能会影响操作的成功率或限制其实现。除上述限制外，肠系膜淋巴结切除术可实现对淋巴结的高度可控且高度选择性的干预。该方法最适合用于探究淋巴结及其相关的常驻免疫细胞与肠道各节段（例如近端结肠、远端结肠、小肠）之间局部相互作用的相关科学问题。

图尿素 1: 解剖学标志物在各站点的位置 的 肠系膜淋巴结链. (A未标记的和（B四个主要肠系膜淋巴结站的标记示意图 原位近端结肠的引流主要为 通过 1号区域主要为近端结肠，小肠主要位于2/3号区域，远端结肠主要位于4号区域。（DC=远端结肠，ICV=回结肠血管，PC=近端结肠，CEC=盲肠，IV/JV=回肠血管/空肠血管，SI=小肠）。比例尺：1.5 cm。 请点击此处查看此图的放大版本。

方案

所有操作均按照耶鲁大学动物护理与使用委员会（Yale Institutional Animal Care and Use Committee）的规程进行。为建立本实验流程，采用了8至12周龄的C57BL/6品系野生型小鼠，并设置年龄、性别和基因型相匹配的假手术对照组。实验包含雄性和雌性小鼠，体重范围为18至25 g。所用试剂和设备详见材料表。

1. 仪器、动物及手术室的准备

1. 对所有手术器械进行灭菌。确保手术台面和麻醉鼻罩用70%乙醇擦拭清洁。
2. 设置吸入式麻醉蒸发器装置，配备鼻罩及废气抽吸系统以清除过量麻醉气体。准备一个带有循环温水垫的手术操作台面，用于维持动物体温，并将所需物品置于方便取用且无菌的位置。
   注意：本操作无需使用手术显微镜；然而，可考虑使用该仪器以改善视野可视化效果。
3. 通过给予2%-3%的吸入式异氟烷，同时以2 L/min的氧气流速诱导麻醉 通过 经机构批准的方案，从吸入式麻醉蒸发器设备中取出鼻锥
   1. 通过确认呼吸频率约为30-40次/分钟且对后足夹捏无反应，确保麻醉深度适当。定期重新检查麻醉深度，并相应调整异氟烷流量。
      注意：也可使用可注射麻醉剂。
4. 遵循所在机构关于适当镇痛和局部麻醉的指导原则。例如，皮下注射长效镇痛剂如3.25 mg/kg的缓释布托啡诺（buprenorphine XR），并在预定切口部位按每5g体重最多0.04 mL的剂量，皮下注射1 mg/mL的利多卡因溶液。
5. 将动物仰卧位固定，涂抹眼用润滑剂，拔除或剪去腹部毛发，先用聚维酮碘溶液对腹部进行消毒，再用70%乙醇处理图2A).
6. 使用无菌手套，并在动物体表覆盖无菌手术巾，留出通向手术区域的窗口。整个操作过程中须保持无菌状态。

图图 2：肠系膜淋巴结切除术主要操作步骤的代表性图像. (A拔除并灭菌的腹部观察窗。B) 通过皮肤和白线做0.5 cm切口。 (C) 通过将回肠置于右侧、近端结肠置于左侧、盲肠置于下方，暴露肠系膜淋巴结链。第一个肠系膜淋巴结位于回结肠动脉旁（白色箭头）。D) 切除的肠系膜淋巴结（虚线箭头）。比例尺：0.5 cm。E) 离体 肠系膜淋巴结（白色箭头；2.5 mm × 3 mm）。刻度 = 1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 肠系膜淋巴结切除术准备

1. 沿中线做一道0.5–1 cm的切口穿过皮肤。钝性分离皮肤与腹壁，辨认腹白线。通过腹白线做一道0.5–1 cm的切口，以进入腹膜腔（图4B).
   注意：为了更好地暴露第2/3/4站淋巴结，可考虑将切口向头侧延长，但不应超过软骨性剑突。
2. 向腹腔内注入1 mL体温的无菌生理盐水 通过 使用钝头灌胃针，并将无菌手术巾润湿以备进行肠管定位。用无菌湿润的棉签经切口识别并取出盲肠。
   1. 避免使用锐器处理肠管，以免造成损伤。应定期润湿手术巾和肠管，防止因干燥而受损。
      注意：小鼠的盲肠通常位于腹腔的左下象限，但也可位于其他任一象限。
3. 明确需要切除的目标肠系膜淋巴结站，并遵循以下具体说明（即 3.1–3.4）。参见 图1A,B 用于解剖学标志和识别。

3. 肠系膜淋巴结站的解剖与切除

1. 第一淋巴结站（近端结肠引流；补充图1A，B'）。
   1. 将外置的肠段置于湿润的手术巾上，盲肠朝下，近端结肠朝上，回肠末端朝向术者右侧（动物左侧；图1A，图2C）。
   2. 辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。使用有角度的精细镊子，通过将闭合的镊子插入淋巴结与回结肠血管之间的间隙并轻轻张开镊子，钝性分离第一淋巴结站。
      1. 取出镊子，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管（图3A，B）。
         注意：若出现明显出血，应终止操作，并按照机构批准的方案人道处死动物。
   3. 可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可使用9-0黑色单丝尼龙缝线和精细镊子进针，在淋巴结链上进行可选的缝扎结扎（在第一淋巴结站远端1 mm和近端1 mm处各缝一针间断缝合）（图3C，D）。
   4. 轻柔地向尾侧牵拉已结扎的淋巴结站，使用精细剪刀从头侧向尾侧切除目标淋巴结站（图3E）。
      注意：小鼠通常有一支来自回结肠动脉的小而可见的供血血管进入淋巴结后部。该血管出血可通过棉签轻压止血，直至实现止血。

图 3：肠系膜淋巴结清扫术（第一站）的标注图像及说明。（A）正确调整肠管方向以暴露第一站肠系膜淋巴结（白色箭头）。（B）在回结肠动脉（蓝色箭头）与淋巴结之间建立分离平面。（C）对进入淋巴结顶端的供血血管（蓝色箭头）进行缝扎，同时通过退出两结构之间的间隙（白色箭头）以避开回结肠血管主干。（D）对淋巴结基底部进行缝扎，再次注意并避开回结肠动脉的远端分支。（E）沿已建立的组织平面切除淋巴结，保持高位分离，将缝扎线留在原位（黑色箭头）。（F）确认止血效果，观察回结肠动脉的远端分支以确保血流正常，并注意淋巴结原所在位置（虚线箭头）已无残留淋巴结组织。比例尺：0.5 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 第二淋巴结站（中段-远端小肠引流）
   1. 同样轻柔地将小肠完整取出。将暴露的肠管置于湿润的敷料上，盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧（动物左侧；图1A）。
   2. 辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。第二站起始于回肠/空肠血管汇合处（图1B）。
      1. 使用弯头精细镊子，通过将闭合的镊子插入淋巴结与结肠血管之间的间隙并轻轻张开，钝性分离第二淋巴结站。
      2. 取出镊子，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管。同时需特别注意回肠和空肠血管，若受损将造成严重后果。
         注：若出现明显出血，应立即终止操作，并人道处死动物。
   3. 可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可沿淋巴结链使用9-0黑色单丝尼龙线和精细镊子进行可选的缝扎结扎（在第二淋巴结站远端和近端各1 mm处分别施以单个间断缝合），以推动缝针（补充图2A）。
   4. 轻柔地将结扎的淋巴结站向尾侧牵拉，使用精细剪刀从头侧向尾侧方向切除目标淋巴结站（补充图2B）。
      注：小鼠常有一条细小但可见的供血血管从回结肠动脉发出，进入淋巴结后方。该血管出血可通过棉签轻压止血，直至实现止血。
3. 第二和第三淋巴结站（近端-中段-远端小肠引流；补充图1C,D'）
   1. 轻柔地将整个小肠完全取出，直至达到后方固定点（屈氏韧带）。将暴露的肠管置于湿润的敷料上，盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧（动物左侧；图1A）。
   2. 辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。第二站起始于回肠/空肠血管汇合处（图1B）。
      1. 使用弯头精细镊子，通过将闭合的镊子插入淋巴结与结肠血管之间的间隙并轻轻张开，钝性分离第二和第三淋巴结站。
      2. 取出镊子，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管。同时需特别注意回肠和空肠血管，若受损将造成严重后果。
         注：若出现明显出血，应立即终止操作，并人道处死动物。
   3. 可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可使用9-0黑色单丝尼龙线和精细镊子沿淋巴结链进行可选的缝扎结扎（通常在第二/第三淋巴结站远端1 mm、两侧各1 mm及近端1 mm处施以单个间断缝合），以推动缝针（补充图3B、C）。
      1. 注意位于回肠/空肠血管束浅表的传入淋巴管（补充图3B）。缝扎时应确保结扎线位于淋巴管深部、主要血管结构浅部，避免损伤回肠/空肠血管束，否则将造成严重后果。
   4. 轻柔地将结扎的淋巴结站向头侧牵拉，使用精细或超精细剪刀从尾侧向头侧方向切除目标淋巴结站。
      注：在继续操作前，确保小肠保持粉红色且灌注良好。意外结扎回肠/空肠血管将导致小肠缺血。
4. 第四淋巴结站（远端结肠引流；补充图1E、F'）
   1. 轻柔地将整个小肠完全取出，直至达到后方固定点（屈氏韧带）。将暴露的肠管置于湿润的敷料上，盲肠朝下，近端结肠朝上，小肠朝向术者右侧（动物左侧；图1A）。
   2. 辨认沿结肠纵向走行的肠系膜淋巴结链。第四站位于远端结肠内侧、第三站外侧（图1B、图4A）。
      1. 使用弯头精细镊子或超精细剪刀，通过将闭合的镊子或剪刀插入淋巴结与结肠血管及周围脂肪组织之间的间隙并轻轻张开，钝性分离第四淋巴结站。
      2. 取出镊子或剪刀，重复此操作2-3次，或直至形成足够安全切除的分离平面。避免损伤主要的结肠血管。
         注：若出现明显出血，应立即终止操作，并人道处死动物。
   3. 可选步骤：为降低邻近淋巴结侧支循环的理论风险，可对每个可识别的淋巴结使用9-0黑色单丝尼龙线和精细镊子进行可选的缝扎结扎（通常在每个淋巴结1 mm处施以单个间断缝合），以推动缝针（图4B–D）。
   4. 轻柔地将结扎的淋巴结站向头侧牵拉，使用超精细剪刀从尾侧向头侧方向切除目标淋巴结站（图4D、E）。

图4：肠系膜淋巴结清扫术（第四站）的标注静态图像及说明。（A）正确摆放肠道方向，以显露位于远端结肠内侧、第三站外侧的第四站肠系膜淋巴结区域（白色箭头）。（B、C）钝性分离淋巴结区域后，对每个可识别的淋巴结进行缝扎（黑色箭头），需确保包含所有供应该淋巴结的血管（蓝色箭头）。（D）沿先前建立的组织平面切除淋巴结，操作时保持高位贴近淋巴结组织，将缝扎结留于原位（黑色箭头）。（E）完成淋巴结区域切除后（白色箭头），确认止血效果，可见缝扎结（黑色箭头），并观察到淋巴结原所在位置的空腔（虚线箭头）无残留淋巴结组织。比例尺：0.2 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 完成肠系膜淋巴结清扫术

1. 观察回结肠血管、回肠血管和/或空肠血管的远端分支，以确保血供完整。血流灌注良好的肠段呈鲜亮粉红色，并可见搏动。
   1. 使用棉签将腹腔内容物复位至腹膜腔内。复位前需注意清除肠管上的棉絮、绒毛、手术巾碎片或缝线残留，以免引起额外的手术后炎症反应。
   2. 通过确认肠段保持鲜亮/粉红色（灌注良好）而非暗淡/灰白/紫色（缺血），确保肠管未在其系膜上发生扭转。
2. 在关闭腹腔前，向腹腔内注入1 mL体温的无菌生理盐水，以补充不显性液体丢失/蒸发。使用6-0单丝聚丙烯缝线连续缝合，分两层（腹壁和皮肤）关闭腹腔。
3. 在伤口处涂抹无菌外科胶。
   注：也可使用间断缝合或伤口夹闭器进行皮肤缝合。

5. 术后护理

1. 将动物转移到一个清洁的笼子中，笼子一半置于循环温水垫上，一半置于其外，并可自由获取食物和水。
2. 让动物从麻醉中恢复，并密切监测其是否出现痛苦迹象。若动物未能及时从麻醉中恢复并表现出正常行为（如呼吸频率增加、自主翻身、行走、理毛等），应实施人道安乐死。
3. 当所有动物均从麻醉中恢复后，将笼子送回动物饲养设施，提供自由获取的水、食物、垫料和环境丰富材料 ad libium。
4. 术后每12小时对小鼠进行一次评估，持续3天，观察疼痛或痛苦迹象（如弓背姿势、活动减少、互动减少、理毛不良等）。对表现出痛苦迹象的小鼠实施人道安乐死。
5. 若使用永久性缝线（如6-0单丝聚丙烯缝线），应在术后第10天检查切口，并移除任何残留的缝线材料。

6. 淋巴结处理

1. 将切除的组织立即放入含有 500 µL 磷酸盐缓冲液（PBS）的 1.5 mL 微量离心管中，进行浮力测试。通过观察组织在 PBS 中的沉降情况确认是否为淋巴结：淋巴结会下沉，而意外切除的脂肪组织则会上浮（图 5A）。
   注意：切除的淋巴结区域可立即用于后续下游处理。
2. 如需进行活细胞实验，将切除的淋巴结区域置于细胞培养基（如 DMEM、RPMI）或 PBS 中，并置于冰上保存。如计划进行组织学分析，则将切除的淋巴结区域放入固定液（如 10% 中性缓冲甲醛、4% 多聚甲醛）中。

结果

为验证该操作的准确性，对11只年龄、性别和基因型匹配的4至6周龄C57BL/6J品系同窝小鼠进行了肠系膜淋巴结切除术。每只小鼠的操作时间在5至15分钟之间。所有小鼠均耐受良好，围手术期存活率为100%。切除的样本立即置于冰上PBS中。所有样本均迅速沉降，表明脂肪含量较低。将切除的样本（以及另外4个独立的内脏脂肪对照样本）通过100 µm细胞筛网研磨，并用PBS洗涤。细胞悬液在4°C下以450 × g离心5分钟，随后在冰上用100 µL PBS孵育60分钟，加入以下抗体及浓度：FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）小鼠单克隆抗体（1:100；5 μg/mL）以及用于检测活率的DAPI（1:100；15 μg/mL）。细胞用PBS洗涤后，在4°C下以450 × g离心5分钟，并在冰上用1%多聚甲醛固定20分钟。最后再用PBS洗涤一次，4°C下以450 × g离心5分钟，重悬于PBS中。

流式细胞术在耶鲁大学流式细胞术中心完成。使用本方案成功提取淋巴结的结果在11/11个样本中得到验证，CD45+活细胞比例均达到或超过80%，相比...

讨论

本文描述了一种可在四个淋巴结站位分别进行的安全且耐受性良好的小鼠生存状态下肠系膜淋巴结切除术。该手术的主要局限性在于，淋巴结沿肠系膜链的分布与术中暴露的直接可视性之间存在间接关系。第一站淋巴结可完全直接暴露，操作简便。第二站淋巴结通常可见，但其暴露程度取决于手术视野的拓展情况。^nd 至 4^th 可通过向头侧延长皮肤/腹壁切口来改善手术入路。然而，由于远端结肠存在后方附着结构，通过该切口进一步暴露远端结肠最远端及直肠的范围有限，且存在损伤深部结构的风险。

另一个重要的局限性是假传入支和/或侧支淋巴管的形成。已有研究表明，在腘窝淋巴引流区，侧支淋巴管可能在手术切除后2-7天内即开始形成，并在2-3周内获得功能性收缩能力^16,17。尽管目前尚不清楚肠系膜淋巴结引流区是否也遵循这种早期功能性侧支形成的模式，但已知移植的肠系膜淋巴结至少在术后5周时已与受体的淋巴系统建立吻合，实现功能性引流¹⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉回路	任何		或可注射麻醉剂
BD LSRII 流式细胞仪（或同等设备）	BD 生物科学		配备 FACS Diva 软件（用于流式细胞术）
长效丁丙诺啡	任何		用于镇痛
细胞培养基	任何		（用于活细胞技术；例如 DMEM 或 RPMI）
DAPI	Biolegend	422801	工作浓度：15 ug/mL
乙醇（70% 水溶液）	任何		用于清洗
FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）	Biolegend	109806	工作浓度：5 ug/mL
镊子：弯头精细尖头镊	Roboz	RS-5058	材料：Dumoxel；型号 #5，45 度角；尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm
镊子：尖头镊子	Roboz	RS-4960	材料：Dumostar；型号 #1；尖端尺寸：0.20 × 0.12 mm
镊子：尖头镊子	Roboz	RS-4966	材料：Dumostar，生物尖头；型号 #3；尖端尺寸：0.08 × 0.04 mm
利多卡因	任何		用于镇痛
金属灌胃针	任何		20/22 号可重复使用直型口服灌胃针，不锈钢材质。
持针器	Roboz	RS-6410	Castroviejo持针器；直型
可选：    双颈/双臂显微镜LED灯	任何
可选： 伊文思蓝染料	Sigma	E2129-10G	用于可选的淋巴示踪。
可选： 手术显微镜	Leica	MZ9.5	Leica Mz9.5 体视显微镜
磷酸盐缓冲液（PBS）	任何
聚维酮碘溶液	任何		用于皮肤准备/消毒
剪刀：超细尖头剪刀	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas；3 mm 切割刃；弯型 （适用于3/4号位点）
剪刀：尖头剪刀	Roboz	RS-5650SC	Surecut Castroviejo 剪刀 （适用于1/2/3号节点）
剪刀：中号剪刀	Roboz	RS-5676	诺伊斯；13毫米切割刃；直型
手术胶	任何		3M Vetbond 组织粘合剂
缝线：6-0 蓝色单丝聚丙烯	任何
缝线：9-0黑色单丝尼龙缝线	任何		（可选）也可使用稍大的8-0规格缝线。
组织固定剂	任何		（用于计划进行组织学检测；例如，10%中性缓冲甲醛或4%多聚甲醛）
温水循环加热垫	任何