小鼠肠系膜淋巴结切除术以选择性阻断特定区域肠道的淋巴通路

摘要

本方案描述了一种可存活的小鼠肠系膜淋巴结清扫术，该手术安全且耐受性良好，可沿肠系膜淋巴结链的四个站点分别进行。本方案具有可调整性，可用于选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴通路。

摘要

免疫监视与抗原耐受在肠道微环境中处于精细的平衡状态，其中循环T细胞在局部淋巴结中的启动作用已被广泛认知。在T细胞启动之后，近期文献开始揭示一类定居于器官引流淋巴结中的非循环T细胞具有独特且不可替代的功能。这一现象在肠道中可能尤为显著，因为肠道的淋巴引流具有高度特异性。然而，为了真正理解这些局部T细胞的独特作用与全身性功能冗余之间的差异，科学界亟需一种描述清晰的方法，以分离并选择性干扰这些淋巴结。本文介绍了一种可在肠系膜淋巴结链上四个不同部位安全实施、耐受性良好的小鼠肠系膜淋巴结切除存活手术。该手术方法可灵活调整，以选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴引流通路。文中提供了详细的步骤说明、可视化辅助图示、提高手术成功率的实用技巧，以及针对术后存活不佳情况的故障排除方案。如需进一步下游分析，切除的淋巴结可立即用于后续处理。该技术最适合需要选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠淋巴引流的研究应用。

引言

T细胞是适应性免疫中主要的效应细胞类型之一，在多种疾病类别中均具有重要作用，包括感染、自身免疫和恶性肿瘤^1,2,3。T细胞发挥功能的关键步骤是由次级淋巴器官（如局部淋巴结）中的抗原呈递细胞对其进行三阶段的启动⁴。在现代医学中，对多个器官系统实施规范的肿瘤根治性切除通常包括一定程度的局部取样或整块淋巴结切除^5,6,7,8。例如，在结肠癌治疗中，共识指南建议在根治性切除术中应切除并检查至少12个淋巴结，因为这与改善的长期生存率存在明确的相关性^6,7。然而，局部淋巴结是否真的可以毫无代价地被切除？近期在小鼠中的研究表明，肿瘤引流淋巴结中含有抗肿瘤T细胞前体的储备库，这些前体可能避免了在肿瘤微环境中发生的终末分化和T细胞耗竭^9,10<....

方案

所有操作均按照耶鲁大学动物护理与使用委员会（Yale Institutional Animal Care and Use Committee）的规程进行。为建立本实验流程，采用了8至12周龄的C57BL/6品系野生型小鼠，并设置年龄、性别和基因型相匹配的假手术对照组。实验包含雄性和雌性小鼠，体重范围为18至25 g。所用试剂和设备详见材料表。

1. 仪器、动物及手术室的准备

1. 对所有手术器械进行灭菌。确保手术台面和麻醉鼻罩用70%乙醇擦拭清洁。
2. 设置吸入式麻醉蒸发器装置，配备鼻罩及废气抽吸系统以清除过量麻醉气体。准备一个带有循环温水垫的手术操作台面，用于维持动物体温，并将所需物品置于方便取用且无菌的位置。
   注意：本操作无需使用手术显微镜；然而，可考虑使用该仪器以改善视野可视化效果。
3. 通过给予2%-3%的吸入式异氟烷，同时以2 L/min的氧气流速诱导麻醉 通过 经机构批准的方案，从吸入式麻醉蒸发器设备中取出鼻锥
   1. 通过确认呼吸频率约为30-40次/分钟且对后足夹捏无反应，确保麻醉深度适当。定期重新检查麻醉深度，并相应调整异氟烷流量。
      注意：也可使用可注射麻醉剂。
4. 遵循所在机构关于适当镇痛和局部麻醉的指导原则。例如，皮下注射长效镇痛剂如3.2....

结果

为验证该操作的准确性，对11只年龄、性别和基因型匹配的4至6周龄C57BL/6J品系同窝小鼠进行了肠系膜淋巴结切除术。每只小鼠的操作时间在5至15分钟之间。所有小鼠均耐受良好，围手术期存活率为100%。切除的样本立即置于冰上PBS中。所有样本均迅速沉降，表明脂肪含量较低。将切除的样本（以及另外4个独立的内脏脂肪对照样本）通过100 µm细胞筛网研磨，并用PBS洗涤。细胞悬液在4°C下以450 × g离心5分钟，随后在冰上用100 µL PBS孵育60分钟，加入以下抗体及浓度：FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）小鼠单克隆抗体（1:100；5 μg/mL）以及用于检测活率的DAPI（1:100；15 μg/mL）。细胞用PBS洗涤后，在4°C下以450 × g离心5分钟，并在冰上用1%多聚甲醛固定20分钟。最后再用PBS洗涤一次，4°C下以450 × g离心5分钟，重悬于PBS中。

流式细胞术在耶鲁大学流式细胞术中心完成。使用本方案成功提取淋巴结的结果在11/11个样本中得到验证，CD45+活细胞比例均达到或超过80%，相比.......

讨论

本文描述了一种可在四个淋巴结站位分别进行的安全且耐受性良好的小鼠生存状态下肠系膜淋巴结切除术。该手术的主要局限性在于，淋巴结沿肠系膜链的分布与术中暴露的直接可视性之间存在间接关系。第一站淋巴结可完全直接暴露，操作简便。第二站淋巴结通常可见，但其暴露程度取决于手术视野的拓展情况。^nd 至 4^th 可通过向头侧延长皮肤/腹壁切口来改善手术入路。然而，由于远端结肠存在后方附着结构，通过该切口进一步暴露远端结肠最远端及直肠的范围有限，且存在损伤深部结构的风险。

另一个重要的局限性是假传入支和/或侧支淋巴管的形成。已有研究表明，在腘窝淋巴引流区，侧支淋巴管可能在手术切除后2-7天内即开始形成，并在2-3周内获得功能性收缩能力^16,17。尽管目前尚不清楚肠系膜淋巴结引流区是否也遵循这种早期功能性侧支形成的模式，但已知移植的肠系膜淋巴结至少在术后5周时已与受体的淋巴系统建立吻合，实现功能性引流¹⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉回路	任何		或可注射麻醉剂
BD LSRII 流式细胞仪（或同等设备）	BD 生物科学		配备 FACS Diva 软件（用于流式细胞术）
长效丁丙诺啡	任何		用于镇痛
细胞培养基	任何		（用于活细胞技术；例如 DMEM 或 RPMI）
DAPI	Biolegend	422801	工作浓度：15 ug/mL
乙醇（70% 水溶液）	任何		用于清洗
FITC标记的抗小鼠CD45.2（104）	Biolegend	109806	工作浓度：5 ug/mL
镊子：弯头精细尖头镊	Roboz	RS-5058	材料：Dumoxel；型号 #5，45 度角；尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm
镊子：尖头镊子	Roboz	RS-4960	材料：Dumostar；型号 #1；尖端尺寸：0.20 × 0.12 mm
镊子：尖头镊子	Roboz	RS-4966	材料：Dumostar，生物尖头；型号 #3；尖端尺寸：0.08 × 0.04 mm
利多卡因	任何		用于镇痛
金属灌胃针	任何		20/22 号可重复使用直型口服灌胃针，不锈钢材质。
持针器	Roboz	RS-6410	Castroviejo持针器；直型
可选：    双颈/双臂显微镜LED灯	任何
可选： 伊文思蓝染料	Sigma	E2129-10G	用于可选的淋巴示踪。
可选： 手术显微镜	Leica	MZ9.5	Leica Mz9.5 体视显微镜
磷酸盐缓冲液（PBS）	任何
聚维酮碘溶液	任何		用于皮肤准备/消毒
剪刀：超细尖头剪刀	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas；3 mm 切割刃；弯型 （适用于3/4号位点）
剪刀：尖头剪刀	Roboz	RS-5650SC	Surecut Castroviejo 剪刀 （适用于1/2/3号节点）
剪刀：中号剪刀	Roboz	RS-5676	诺伊斯；13毫米切割刃；直型
手术胶	任何		3M Vetbond 组织粘合剂
缝线：6-0 蓝色单丝聚丙烯	任何
缝线：9-0黑色单丝尼龙缝线	任何		（可选）也可使用稍大的8-0规格缝线。
组织固定剂	任何		（用于计划进行组织学检测；例如，10%中性缓冲甲醛或4%多聚甲醛）
温水循环加热垫	任何