本文介绍一种通过经皮心内插管连接真空泵进行大量采血的方法，该方法为终末性操作，适用于猪。
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本文内容
摘要
摘要
在许多基础和应用研究中，常规采血是必需的。猪的采血方法已有充分描述，包括使用耳缘静脉采集少量血液，以及通过颈静脉或前腔静脉采集较大量的血液。某些实验需要从单个动物一次性获取大量血液用于分析或原代细胞培养，这最有效的方式是通过放血法实现。用于原代细胞培养的血液必须新鲜并经过仔细处理，以维持细胞完整性。本文介绍一种在手术麻醉深度下无菌采集猪血液的方法：通过经皮将大口径血管导管针芯插入心脏，并连接真空泵进行采血。该方法效率高、采血量大，且可最大限度减少细胞裂解。该技术仅在动物处于手术麻醉状态下作为终末性操作执行一次，从而将疼痛或不适的风险降至最低。
引言
猪已被广泛应用于从心血管研究到伤口愈合及毒理学的各类科学研究，同时也用于农业相关研究、免疫学和疾病研究1。科研中采集的血液可用于疾病、药理学、遗传学、免疫系统研究以及生物标志物的发现。细胞培养是科研中最基本的操作之一，可使研究人员研究细胞的行为与功能，以及疾病模型和疫苗开发2。对致病性 病原体（如非洲猪瘟病毒）的培养通常在特定的培养基中进行，并需在严格的无菌实验室条件下操作。疾病的传播可能通过侵入、扩散或附着等方式发生，这些过程均依赖于健康且稳定的细胞3。所研究的病原体可能具有特定的细胞嗜性，因而只能在特定细胞中增殖，而获取大量血液则可提供更充足的细胞资源用于实验。
为了从单个动物体内获得高产量的细胞用于细胞分化，必须在细胞分离前轻柔地采集大量血液以维持细胞完整性。在猪体内，总血容量可按65 mL/kg计算4,5。根据我们进行大容量采血的经验，通常可回收动物总血容量的大约一半。因此，对于体重高达600磅（273 kg）的成年大型猪，可获得6–8 L的血液。在猪身上，可通过经皮途径从前腔静脉、颈外静脉、通过插管的隐静脉或心脏采集大量血液4,5,6。然而，使用大口径套管进行心内采血能够高效采集最大体积的血液，同时将细胞裂解的风险降至最低。作为一种终末性操作，该过程必须在手术麻醉深度下进行5。本文介绍一种方法：使用真空泵，通过大口径静脉留置针芯经皮穿刺心脏，从而从猪体内采集数升血液7,8。
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方案
本研究已获得 Midwest Veterinary Services Inc. 动物护理与使用委员会的批准。由于经机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的本实验主要安乐死方法为放血，因此部分猪可能因失血而发生心脏骤停。当这种情况发生时，需实施二次安乐死方法，例如双侧开胸术。在采集所需血量后，若仍可触及心跳，则将含有安乐死溶液的注射器连接至套管针，并通过心内注射作为主要安乐死手段，随后辅以一种物理性二次方法。猪的饲养和管理均依照《农业动物在科研与教学中的护理与使用指南》、《实验动物护理与使用指南》以及适用的《动物福利法》进行。
1. 材料与动物的准备（材料表及图1A-C）
- 将导管与不锈钢吸管组装，并将软管末端连接至气泡管。
- 使用带有两根不等长金属吸管的橡胶塞和玻璃瓶，将导管连接至滚瓶。
注意：玻璃可防止真空泵造成的容器塌陷，但任何在压力下不会塌陷的材料均可使用。 - 通过吸液导管和导管钢丝，无菌注入 10 mL 肝素钠（1,000 USP/mL），以防止凝血。向每个滚瓶中无菌加入 50 mL 肝素钠（1,000 USP/mL），使每升血液中终浓度达到 50 IU/mL，以防止采血过程中血液凝固。确保真空泵的抽吸力不超过 7 磅，以避免细胞损伤。
2. 麻醉与动物体位固定
- 在手术前不超过24小时内称量动物体重，以计算麻醉药物组合所需的剂量。
- 使用30英寸延长管和18 G × 1.5"针头，在颈部或 其他大肌群（例如背外侧肌）处，肌肉注射Telazol（3.0–5.0 mg/kg）、氯胺酮（ketamine，8–12 mg/kg）和赛拉嗪（xylazine，4.0–6.0 mg/kg），以诱导深度麻醉。
注意：在大型猪中，推荐的最大肌肉注射体积为10 mL，因此每注射10 mL后可能需要更换注射部位9。尽管我们选择了此麻醉混合方案，但本操作可在任何经IACUC批准并能实现外科麻醉深度的麻醉方案下进行。 - 确认动物已进入外科麻醉阶段（约5–8分钟），表现为无眨眼反射、下颌松弛且对疼痛刺激无反应后，将猪置于升降台、地面或其他平坦表面上，采取右侧卧位。
- 如有需要，剪除心脏区域胸壁的毛发，位置通常在肘突后方附近的第四和第五肋间隙处。
- 如有条件，可使用超声（图2A）识别左心室。若无超声设备，左心室通常位于心尖搏动最明显点内侧的第四或第五肋间隙附近8。
- 使用浸有2%氯己定清洗液的4英寸×4英寸纱布垫和浸有70%异丙醇的4英寸×4英寸纱布垫，对该区域进行无菌擦洗。从注射点开始，以画圈方式向外旋转擦拭，至少重复3次，并交替使用两种消毒剂，完成皮肤准备。
3. 心脏内采血
- 通过检查眼睑反射、下颌张力和足底反射，确认动物仍处于外科麻醉平面。
注意：在整个操作过程中，需持续监测麻醉深度以及心率和呼吸频率，以确保动物维持在外科麻醉平面。 - 从静脉导管中取出导丝。将导丝置于左心室上方，并垂直于皮肤推进，以将导丝插入左心室（图2B）。当血液开始从导丝中搏动流出时，将其连接至连接滚瓶的气泡管路末端接头，然后启动真空泵（图1A 和 图2C）。
- 确认血液呈稳定流动状态。当血液被吸入滚瓶时，轻轻旋转滚瓶，使血液与抗凝剂充分混合，以防止凝血形成。
- 当收集到1 L血液后，使用止血钳夹闭靠近滚瓶端的气泡管路。取下橡胶塞并将其安装至下一个滚瓶上。移除止血钳，使血液自由流入新滚瓶，同时轻轻旋转滚瓶。
- 重复此过程，直至完成所需血液采集。操作完成后，夹闭管路以防止血液溢出，并关闭泵。
- 将管路接头从导管导丝上取下，将戊巴比妥钠注射器连接至导丝。回抽注射器，确认有血液回流后，注入安乐死溶液。通过确认心跳、呼吸、肌肉张力及反射消失来判定动物死亡。确认死亡后，将针头从心脏中拔出，并放入锐器容器中。
- 将气泡管路丢弃至生物危害废物容器中。使用试管刷清除其余不锈钢物品（如不锈钢吸管、管路末端接头）上的明显血迹，然后进行高压灭菌，以备后续使用。
- 将清洁后的橡胶塞、吸管、管路末端接头和止血钳放入新的高压灭菌袋中，在下次使用前进行灭菌处理。
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结果
在采血前，对母猪进行了Mycoplasma hyopneumoniae、猪腺病毒、猪细小病毒、猪冠状病毒（传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒）、猪血凝性脑脊髓炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、A组流感病毒、圆环病毒1型和2型以及塞内卡病毒A的预先筛查。该操作已在体重为300-600磅的雌性约克夏杂交母猪中多次重复实施。采血量从较小的猪只获得约3升，到较大的母猪可获得高达8升。在两例疑似发生凝血的情况下，需移除并更换初始穿刺针芯以恢复良好的血流。手术麻醉平面得以维持。在采血过程中，应轻柔地旋转滚动瓶以充分混匀血液，防止血液凝固。细胞分化后的质量评估主要依据巨噬细胞在细胞培养瓶上的贴附能力。除贴附性外，还评估了细胞形态和活力。健康的巨噬细胞大小中等至较大，形态光滑，呈圆形或伸展状。细胞群体的整体健康状况通过台盼蓝染色法计算细胞活力来确定10。
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讨论
本方案描述了一种采用导管-探针-真空泵组件从母猪心脏一次性采集大量血液的方法。由于该操作可能引起疼痛和应激反应，因此只能在处于外科麻醉深度的动物上实施。麻醉导致的动物不动状态使得初学者能够快速学习并掌握该技术。采集动物血液可选择多条静脉途径。最常用且易于接近的途径包括颈静脉、前腔静脉和耳缘静脉，尾静脉、股静脉或头静脉也可作为备选方案5,6。
在猪体内，颈静脉和前腔静脉可用于采集大量血液；然而，使用真空泵从心脏采集的血量远超从这些血管所能获得的量。从这些血管采血需要操作者手部稳定，并使用大容量注射器或真空采血管。更换真空采血管或注射器可能导致血管撕裂，进而因组织内出血而减少血流。仅使用注射器或仅使用真空采血管进行多次启动/停止操作，可能造成血细胞的剪切损伤。此外，采血过程可能对操作人员造成较大的人体工学负担，导致手部疲劳和乏力。使用真空泵可保持持续负压，同时减轻人体工学压力，因此是猪大容量终末期采血的理想方法，具有高效、结果稳定且质量可靠的优势
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们特别感谢普拉姆岛动物疾病中心动物资源部门的动物健康技术人员和动物护理人员提供的出色技术支持。合同研究组织的项目资金由美国农业部农业研究局国家生物和农业防御设施动物资源部门提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/8 马力实验室隔膜泵 – 115 伏交流电，最大 60 psi | Base Supply Center | 80058845 | |
| 10 号 G × 6 英寸套管针 | Covetrus 北美兽用物资 | 024616 | |
| 50 mL 注射器，鲁尔锁扣 | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 蓝色超声耦合剂 | Midwest Veterinary Supply | 001.02109.2 | |
| Argyl 气泡管，非导电（¼"） | Fisher Scientific | NC2282605（供应商目录号 8888280412） | |
| 洗必泰 Q 洗液 2% | Midwest Veterinary Supply | 562.30804.3 | |
| Corning 一次性滚瓶 | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Corning PYREX 窄口重型玻璃锥形瓶或类似用于产生负压的装置 | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Eisco 尼龙试管刷 | Fisher Scientific | S13962 | |
| Fisherbrand 双孔橡胶塞 | Fisher Scientific | 取决于尺寸 | |
| 氯胺酮（10 mg/mL） | Midwest Veterinary Supply | 275.22100.3 | |
| MLL 转 6 mm 软管接头（不锈钢） | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL 转 8 mm 软管接头（不锈钢） | Cadence Science | 6549IND | |
| MVet 非织造纱布海绵 4 × 4 英寸，4 层 | Midwest Veterinary Supply | 000.30156.2 | |
| MVet 70% 异丙醇 | Midwest Veterinary Supply | 000.50054.3 | |
| MVet Kelly 止血钳，直型，5.5 英寸” | Midwest Veterinary Supply | 000.36800.2 | |
| 肝素钠（1000 U/mL） | Midwest Veterinary Supply | 191.46701.3 | |
| 戊巴比妥钠（390 mg/mL） | Midwest Veterinary Supply | 749.20000.3 | |
| 不锈钢吸管 | Hobby Lobby | 1893635 | |
| Telazol（100 mg/mL） | Midwest Veterinary Supply | 275.40000.3 | |
| 赛拉嗪（100 mg/mL） | Midwest Veterinary Supply | 310.01150.3 |
参考文献
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