非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

摘要

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。

摘要

急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的炎症性疾病，其特征为动脉低氧血症、肺泡水肿、肺泡上皮-内皮毛细血管屏障完整性受损，并伴随炎性细胞浸润肺组织，常进展为更严重的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），最终常导致急性呼吸衰竭。由脂多糖（LPS）诱导的小鼠ALI模型是研究肺部炎症机制及其治疗策略的重要工具。直接与间接啮齿类动物肺损伤模型各有其优势与局限性，尤其体现在存活率、炎症-消退阶段持续时间、手术创伤及感染风险等方面。本研究采用一种无创经气管灌注技术建立大鼠直接ALI模型。该技术可确保将LPS或待测物质精准递送至肺部 通过 借助基础喉镜经气管插管途径进行操作。该操作首先对大鼠实施麻醉，并将其置于半卧位。随后，将连接大鼠气管插管的注射器置于气管开口附近，注入LPS溶液。在实验结束时，采集肺组织或灌洗样本，以评估炎症参数及肺组织结构。该技术在速度、特异性和可靠性方面优于其他模型，可实现精准靶向给药，组织损伤小，死亡率低，且几乎不引起非靶部位的炎症反应。该方法在急性肺损伤（ALI）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及过敏性反应或心脏骤停等相关疾病的临床前研究中具有重要价值。相较于其他方法，该技术更易于与活体显微成像等先进影像技术结合，实现对药物分布和疾病进展的实时监测。

引言

急性肺损伤（ALI）是一种危及生命的炎性病症，其特征为动脉低氧血症、肺水肿、内皮-上皮屏障完整性受损，以及大量免疫细胞浸润肺组织¹。ALI 的病理生理机制复杂，涉及凝血、组织损伤以及肺部和全身性炎症等多种相互重叠和相互作用通路的协同与紊乱。及时抑制这种炎症反应对于恢复组织稳态至关重要。若未及时治疗，这种快速进展的疾病常会恶化为急性呼吸窘迫综合征（ARDS），后者是一种以难治性低氧血症为特征的更严重状态。ALI 的发病机制与肺损伤以及肺泡上皮细胞和微血管内皮细胞的损伤或死亡密切相关^1,2,3,4。

导致急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的病因包括多种感染性和非感染性因素，可源自对肺部的直接或间接损伤⁵。直接原因包括肺炎⁶、近乎溺水⁷、胃内容物误吸⁸、有毒物质吸入（如氯气）⁹、细菌感染^10,以及病毒感染（如SARS-CoV-2）^11,12,13,14。间接原因则来自对肺部产生继发性影响的全身性病理过程，包括脓毒症¹⁵、创伤¹⁶、胰腺炎¹⁷、药物过量以及输血¹⁸。

本方法的主要目标是通过气管内给予内毒素，建立一种可重复且非侵入性的啮齿类动物急性肺损伤（ALI）模型。via 开发该技术的依据源于传统给药方法的局限性。该技术旨在实现向肺泡的精确直接递送，最大限度减少全身暴露，并 使其成为未来靶向肺部治疗的一种有前景的方法。鼻内滴注存在多种挑战，其中一些可能显著影响研究结果，例如对深部肺区的靶向性差以及动物间呼吸差异¹⁹。其他因素，如给药体积有限和潜在的鼻腔刺激，重要性较低，但仍可能影响实验一致性。相比之下，气管内给药可更准确、直接地将药物递送至下呼吸道，确保更好的肺部靶向性和剂量均一性，动物间变异最小，使该途径在肺部暴露研究中更为有效和可靠²⁰。吸入途径由于其非侵入性，在临床上具有相关性，但在临床前研究中也存在某些局限性，例如上呼吸道药物损失以及对远端肺区靶向效率降低。这些局限性在严重疾病模型中更为突出，包括二次打击损伤模型或涉及基因敲入或敲除小鼠的遗传修饰模型。相比之下，气管内给药在复杂临床前模型中也能实现更一致的直接药物递送至下呼吸道，减少药物损失，并实现有效靶向²¹。临床前研究中另一种相关的给药途径是侵入性气管内递送。尽管该方法有效，但存在手术应激、感染风险、检测结果变异以及需要维持体温等局限性²²。相比之下，气管内方法提供了一种可靠的非侵入性替代方案，特别适用于需要在较长观察期内进行多次评估的研究。

该方法可应用于急性肺损伤（ALI）以外的动物模型，包括哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺炎及感染性肺部疾病。它在过敏性反应、心脏骤停和心律失常等临床前研究领域也具有相关性。值得注意的是，经气管给药方法在临床实践中已用于某些药物的给药，具体取决于病情的紧急程度和临床情况^23,24,25。

方案

所有动物的护理和使用均遵循机构和CPCSEA指南。手术后持续监测动物，以确保其健康状况，并符合查谟CSIR-印度整合医学研究所机构动物伦理委员会（IAEC）批准号468/87/8/2025下的动物伦理指南。本方案概述了采用直接可视化递送方法进行脂多糖（LPS）非侵入性气管内滴注的技术，该方法此前已有报道，本研究中引入了一些方法学上的改进^26,27,28。该技术经过优化，可实现对急性肺损伤（ALI）的可控且一致的诱导，确保实验结果的可靠性，同时维持高标准的动物护理。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 麻醉与脂多糖制备

1. 动物体重测量与LPS剂量计算
   1. 使用校准的天平称量每只动物，以计算精确的LPS剂量。选择体重在140–160 g之间的Wistar大鼠用于研究。
   2. 通过稀释冻干的LPS制备LPS溶液 大肠杆菌 在无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中配制LPS，以达到所需浓度。新鲜配制的LPS溶液（5 µg/g 体重）^29,30 被使用。
2. 麻醉诱导与关键时间点
   1. 麻醉动物 通过 使用1 mL注射器腹腔注射新鲜配制的氯胺酮-赛拉嗪混合溶液（氯胺酮：75 mg/kg，赛拉嗪：10 mg/kg）。注射后，静置动物约2–5分钟，待麻醉起效，期间避免干扰动物。
   2. 通过确认动物无自发性运动且足趾夹捏反射呈阴性，以验证麻醉效果充分。给予LPS 通过 在麻醉诱导后5-8分钟进行气管内灌注。在实验结束当天，于麻醉诱导后4-7分钟进行气管切开术和胸腔切开术。
      注意：适当的麻醉深度对于成功进行气管内滴注至关重要。麻醉过深可能抑制咽反射，而麻醉不足则可能导致动物在操作过程中出现不适或移动。应使用新鲜配制的脂多糖（LPS）以确保实验间的一致性。操作期间及操作后需密切监测动物状态，以保障其福利。

2. 气管内滴注LPS

1. 麻醉充分性评估：给予麻醉混合剂后，使用镊子或手指对足趾施加有力的夹捏，以评估麻醉深度。若动物出现反应，则需要加深麻醉。确认动物处于麻醉状态后，开始进行滴注操作。将大鼠 置于半卧位，用门齿悬挂在坚固的支撑平台上。
2. 气管可视化：打开麻醉动物的口腔，用镊子轻轻夹住舌头，小心插入喉镜，并精确对齐，以获得气管开口的最佳视野。确保光源正确指向，照亮喉部区域，以便无障碍操作。
3. 舌头操作：使用弯曲的钝头镊子轻柔夹住舌头，并向上外侧方向轻轻牵拉。
   注意：使用手持放大镜以增强喉部解剖结构的清晰度，并确保滴注装置精确对齐，提高操作准确性。
4. LPS给药：将100 µL LPS溶液吸入注射器，连接至16 G大鼠气管插管；将LPS溶液滴注至气管开口附近。滴注后立即使用钝头镊子轻轻夹闭鼻孔2–4秒，以促进LPS溶液经气管吸入肺部。使用带光源的喉镜持续监测给药过程，确认给药准确且完全。
5. 术后监测：成功给予LPS后，小心将舌头复位至正常解剖位置。将动物转移至笼中，并密切观察至少1分钟，注意是否有呼吸障碍或呛咳等异常表现。
6. 关键注意事项
   1. 视觉清晰度：确保喉镜精确对齐，以实现准确的LPS递送。使用放大工具以提高精确性和操作效果。
   2. 小心夹持舌头，并将其固定于下颌或口腔边缘，以保持稳定。

3. 样本采集

1. 按照先前研究中所述方法进行支气管肺泡灌洗（BAL），并稍作修改^31,32,33。气管切开后，将 2 mL 冷 PBS 轻柔注入肺部，随后回收灌洗液。
2. 将收集的灌洗液在 4 °C 条件下以 5000 x g 离心 5 分钟，取上清液用于炎症标志物检测。收集肺组织用于组织病理学检查，或进行匀浆以检测髓过氧化物酶（MPO）活性。在样品收集过程中始终将样品置于冰上，以保持样品完整性。

结果

通过检测LPS滴注后24小时和120小时的炎症标志物（包括IL-1β水平、MPO活性、总蛋白含量以及组织病理学）对模型进行了验证。研究包含三个实验组：对照组 （未处理）和两组接受LPS滴注的实验组，其中一组在滴注后24小时实施安乐死，另一组在120小时实施安乐死（遵循机构批准的实验方案）。

与对照组相比，LPS暴露组在24小时处死时，IL-1β水平显著升高，同时伴有MPO活性和总蛋白含量的上升（图1A-C）。肺组织病理学显示肺泡结构破坏、肺泡壁肿胀、出血及严重的中性粒细胞浸润（图2），证实LPS滴注后24小时已成功诱导急性肺损伤（ALI）。然而，在LPS滴注后120小时，炎症已基本消退，表现为IL-1β、MPO和总蛋白水平恢复至接近基线水平（图1A-C），肺组织结构也得到修复（

讨论

经气管滴注法提供了一种非侵入性、可重复且靶向性强的肺部给药途径，可有效避免外科手术干预的需要。该方法显著降低了与手术创伤相关的风险，例如组织损伤，同时还能减少术后感染以及侵入性操作可能引起的非预期器官损伤。通过将药物直接递送至肺部，经气管途径可实现精确的局部治疗，在维持良好安全性的同时增强治疗效果。因此，在实验模型中，该方法相较于侵入性的气管内滴注等技术更具优势且更为可靠。

在本研究中，通过气管插管以无创方式将脂多糖（LPS，5 µg/g 体重）递送至肺部，从而在肺叶中引发显著的炎症反应，建立了一种可靠的急性肺损伤（ALI）模型。大鼠使用氯胺酮-赛拉嗪混合物进行麻醉。借助带有光源的喉镜，通过大鼠气管插管经气管将LPS递送至肺部。via 支气管肺泡灌洗（BAL）在LPS给药后24小时和120小时对这些动物进行。收集的BAL液体被用于分析白细胞介素-1β（IL-1β）——一种参与炎症级联反应的关键促炎性细胞因子；髓过氧化物酶（MPO）——中性粒细胞浸润的标志物，以及总蛋白水平，以评估ALI的严重程度。在LPS给药后24小时，IL-1β水平、MPO活性及总蛋白水平均显著...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Prism 8	Graphpad	https://www.graphpad.com/features
Bradford 试剂	印度Himedia公司	ML106-500 ML
DL-二硫苏糖醇	印度Himedia公司	RM525-25G
伊红	印度 Loba Chemie	3660
乙二胺四乙酸（EDTA）	Loba Chemie，印度	6381926
镊子		-
10% 甲醛	Sigma Aldrich，美国	HT501320
苏木精	SDFCL	74108G05
HEPES	印度Himedia	MB016
过氧化氢	阿夫拉，印度	7722841
氯胺酮	印度 Neon Laboratories Ltd	-
喉镜	中国医疗资源有限公司	MS-LA500FV
大肠杆菌O55:B5脂多糖	Sigma Aldrich，美国	L2880
邻联二茴香胺二盐酸盐	Sigma Aldrich，美国	D3252-5G
磷酸盐缓冲液（PBS）	Invitrogen，美国	3002
磷酸二氢钾	印度Himedia	IN26185530500
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	P8340
大鼠IL-1β ELISA试剂盒	赛默飞世尔科技，美国	BMS630
氯化钠	印度Himedia公司	TC046M
氟化钠	印度 Himedia	GRM7502
原钒酸钠	Sigma Aldrich，美国	S6508
焦磷酸钠	默克，美国	MA3M722243
硫酸	Sigma Aldrich，美国	339741
Triton X-100	Thermofisher，美国	T8787
赛拉嗪	印度免疫学有限公司，印度	-