Method Article

用于开发用于细菌、肠道和免疫细胞毒理学和免疫调节疗法的异步系统的 3D Flipwell 工程

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了一个详细的协议，其中包含指导 3D Flipwell 工程和利用的关键步骤。我们描述并展示了如何组装共培养插入物堆栈，并利用它们共培养肠道细菌、肠道上皮细胞和巨噬细胞的分层层，以模拟肠道粘膜环境。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了研究细菌分泌组在免疫细胞极化和肠粘膜稳态中的作用，我们使用背对背堆叠形式的市售插入物开发了一种 3 维共培养模型。我们将该系统称为 3D Flipwells，并成功地在分层层中共培养细菌、结肠上皮细胞和免疫细胞，以概括肠粘膜微环境。该共培养系统能够在膜的一侧接种结肠上皮细胞，在另一侧接种未分化的非贴壁单核细胞，从而允许结肠上皮极化、粘液形成以及单核细胞-巨噬细胞分化和极化在单个共培养物中同步进展，而无需分离和重新铺板预分化的巨噬细胞。该系统易于构建，只需要一些现成的材料和工具。我们通过分析共培养成分对 sepiapterin （SEP） 的反应来测试其效用，SEP 是 BH4 （四氢生物蝶呤）的内源性前体——一氧化氮合酶 （NOS） 的辅助因子。我们证明，3D Flipwell 的 SEP 处理诱导肠道细菌形成生物膜、结肠上皮产生粘液以及巨噬细胞的促免疫原性极化。这表明SEP通过不同细胞成分之间的串扰触发了粘膜防御机制的激活。需要进一步的实验来研究导致免疫细胞重编程的粘膜通讯的作用，并评估该共培养系统筛选新型免疫调节疗法的效用。

Introduction

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免疫细胞-肠道微生物组串扰极大地影响了不同疾病治疗的疗效。这种串扰会受到外部刺激的显着改变，包括但不限于宿主代谢异常、饮食变化、疾病表现和药物治疗。这些变化可能导致微生物群落组成失衡，这种情况称为生态失调 1,2,3。

为了更好地了解肠道中微生物和宿主免疫细胞之间的相互作用，不同小组开发了复杂的共培养系统，试图概括肠道粘膜环境。从Kim等人开发的肠上芯片系统4 到使用专用吸收底物5的更复杂的组装，这些共培养系统构建起来并不简单，并且由于它们被共培养底物吸收而无法保留全谱分泌成分。因此，Noel等人开发了一种替代的共培养系统来模拟相对更容易制造的肠粘膜6。这种新系统利用单个培养插入物，结肠上皮细胞接种在膜的一侧，预分化巨噬细胞接种在膜的一侧6。然而，接种预分化巨噬细胞需要它们在其他地方进行预分化，并解离并重新接种到共培养物中，这可能会影响它们的细胞完整性和活力。

通过对这些先前系统的....

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Protocol

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1. 3D Flipwell 工程

  1. 所有工作都应在细胞培养柜内完成。将所有用品放入柜内。
  2. 打开培养皿盖，放在一边。从保护壳中打开手术刀刀片，将其放在培养皿底部的边缘。确保无菌。
    注意： 需要小心处理手术刀刀片。如果需要，请使用防割纤维增强手套来保护双手。
  3. 打开 12 孔商业插入物的无菌保护包装。确保无菌。拿一套无菌镊子。轻轻抓住插入物并将其从包装中取出。
  4. 握住插入物，使其底部朝上。用另一只手拿起无菌手术刀刀片并将其带到插入物上。
  5. 使用 C 形运动，刺穿边缘的膜，然后轻轻地将手术刀刀片绕着插入物底部滑动，靠近塑料壁。
  6. 切出PET膜，用第二组镊子取出膜。丢弃膜。
  7. 使用手术刀刀片刮掉任何白色膜屑，以清洁插入物的边缘和边缘。小心地将新准备好的插入物放回原来的无菌包装中。
  8. 接下来，取硅胶胶管，用手术刀刀片切掉喷嘴尖端，开一个口。这个开口应该有 3 毫米宽。
  9. 通过将纸巾上的胶水挤出来测试珠子大小。珠子的厚度应为 2-3 毫米。如果珠子小于 2 毫米且难以从管中挤出，请调整喷嘴。
    1. 应用和铺开胶珠的另一种方法是使用 200 μL 移液器吸头，其吸头被切断。用剪刀剪掉 3-4 毫米，然后用抹刀将胶水涂抹在插入物的边缘周围。

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Results

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为了确定肠道细菌、结肠上皮和巨噬细胞的Flipwell共培养物的生物学相关性，我们用精氨酸代谢调节剂塞皮亚普蝶呤（SEP）处理共培养物，以促进一氧化氮9,10,11的产生与对照DMSO相比。我们使用免疫荧光 （IF） 显微镜和扫描电子显微镜 （SEM） 确定了 SEP 处理对共培养物每个组分的影响。染色显示SEP处理后肠道上皮区室中的粘液分泌显着增加，如上皮标志蛋白CK20和粘膜蛋白MUC2的增加所示（图1）。我们还看到，SEP处理增加了M1巨噬细胞标志物CD80的水平，同时下调了M2巨噬细胞标志物CD163，表明M1极化（图2）。此外，SEM分析显示SEP处理后三种成分的表型发生了明显的变化（图3）。与IF.......

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Discussion

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为了 在体外重建肠道粘膜结构，我们设计了一种简单的共培养系统，该系统由肠道细菌、产生粘液的结肠上皮细胞和巨噬细胞组成的分层层组成。这种多共培养系统使我们能够研究细菌分泌组、肠道上皮细胞和巨噬细胞之间的串扰对诱导免疫原性重编程和粘膜防御机制的影响。

创建 3D 翻转孔的重要注意事项之一是，组装必须在无菌环境中进行，然后在接种细胞之前进行紫外线灭菌数天。我们使用配备功能性紫外线的 BSL2 柜子来完成灭菌过程。在最初的灭菌步骤中，如图所示，使用灭菌工具和 70% 乙醇。在施工阶段，经过多次试验后，将实现一致的有机硅胶珠，从而提高可重复性。练习此技术并准备额外的插入堆栈可能会有所帮助。为了在翻转插入组件后去除气泡，我们发现 15G 灌胃针是最有效的工具，并为此确定了它的最佳形状。在第二次细胞接种过程之前，必须准备和消毒针头。

在将它们组合到共培养系统中之前，每种细胞类型都必须维持在单独的培养物中。为了维持结肠上皮细胞的单层，必须考虑每种细胞类型特有.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提交人声明没有利益冲突。在法律允许的最大范围内，作者特此否认所有明示或暗示的保证。在任何情况下，作者均不对因在建造 Flipwell 时使用工具、使用 BSL 试剂、细胞系、细菌培养物、在厌氧室中使用厌氧环境下使用 Flipwell 系统而引起或与之相关的任何特殊、偶然、间接、惩罚性、多重或后果性损害承担责任，无论是根据任何法规、合同、侵权行为还是任何其他法律理论。此责任限制包括但不限于此处未明确描述的任何未指定的 Flipwell 使用方式。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主要作者对古田沙织博士的精湛指导技巧、长距离的持续指导和支持以及熟练而持续的项目设计表示诚挚的感谢，这些设计创造了绝佳的学习机会。作者还感谢 Vandana Sharma 博士提供的微生物学专业知识和指导，以及 Veani R. Fernando 博士制备 THP-1 巨噬细胞。 此外，作者还感谢电子显微镜设施的 Andrew Kleinhenz 博士和 William T. Gunning 博士，以及托莱多大学仪器中心的 Cassandra Zamora 和 Kristin Kirschbaum 对电镜成像的建设性建议。这项工作得到了托莱多大学健康科学校区、医学与生命科学学院、癌症生物学系到旧金山的启动基金的支持;俄亥俄州癌症重新搜索补助金（项目 #：5017）给 SF;医学研究协会（托莱多基金会，#206298）向 SF 颁发的奖;美国癌症协会研究学者资助 （RSG-18-238-01-CSM） 给顺丰;以及向旧金山提供的国家癌症研究所研究补助金 （R01CA248304）。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% PFA（详见试剂与溶液中的配方）文本中描述
10毫升血清学移液管康宁4488
12孔TC板，及nbsp;配角康宁3513
15毫升锥形管，SpectraTube碱科学C2715
200 和微型;l 提示 美国科学1111-1700
24孔插入物- 24孔板培养插入物，PET 0.4和微型;m BrandTech 科学782710
3D Flipwells预制，紫外线消毒 实验室制作
4% PFA（详见试剂与溶液中的配方）文本中描述
50 mM 的 Sepiapterin 原料（SEP，详见试剂与溶液中的配方）职业生涯 河南化工公司CAS#： 17094-01-8
50毫升锥形管格赖纳生物一号227261
5毫升血清学移液器康宁4487
70-95%乙醇（乙醇）Decon实验室04-355-151
铝箔费舍尔科学01-213-100
动物饲食针，20号1.5英寸长度，单次使用&注;费舍尔科学01-208-87
抗体稀释缓冲液（详见试剂与溶液中的配方）文本中描述
阿托氟细胞室及nbsp;热飞世科学A7816
高压灭菌带费舍尔科学15-901-111
甘油库存中的枯草芽孢杆菌（3A1T）菌株（）芽孢杆菌遗传资源中心（https:// bgsc. org/
BioGrip 粉色丁腈无粉无乳胶手套顶级制造P2810
阻断缓冲液（参见试剂与溶液中的配方——PBS中10%普通山羊血清）文本中描述
阻断缓冲液（详见试剂与溶液中的配方）文本中描述
明场显微镜（尼康或同类设备）Eclipse Ts2尼康TS2
Caco-2 细胞空军交通管制委员会HTB-37
细胞培养箱，37°C，5% CO2（Eppendorf CellXpert）埃彭多夫6734010015
离心机（Eppendorf，离心机5804/5804 R或同类型号）埃彭多夫22622501
离心管 50 ml SpectraTube碱科学C2750
12孔板、PET、0.4和微量培养插入件;M，无菌BrandTech Scientific，BRAND Insert 2in1，BIO-CERT782730
DAPI VectaShield 安装介质向量实验室H-1000
深培养皿底部，100 x 25毫米深聚苯乙烯可堆叠培养皿，均为无菌及;美国科学8609-0625
德拉蒙德移液器辅助XPDrummond  4-000-101
Eppendorf 5804 带摆斗转子的离心机，适用于50毫升锥形管埃彭多夫22622501
镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2套VWR82027-438
镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2套，标本镊子VWR82027-438
玻璃瓶 500毫升康宁 4980-500
血细胞计（带盖套的Neubauer）赛莫飞世尔科学50-312-90
HT-29-MTX-E12细胞米利波尔西格玛12040401
免疫笔（可选）费舍尔科学4021761EA
凯夫拉基或其他防割手套（可选）五金店或亚马逊
实验室胶带还是运输胶带费舍尔科学公司;159015R
层流罩 1300系列 A2 BSC II类热飞世科学1375
带紫外线灯的层流罩 SterilGARD贝克公司SG403A-HE
马克尔的溶剂防性VWR52877-310 或 95042-566
用于Caco-2细胞的培养基（DMEM高葡萄糖基，详见试剂与溶液中的配方）描述于 发短信
HT-29细胞培养基（DMEM高葡萄糖，详见试剂与溶液中的配方）文本中描述
THP-1细胞培养基（RPMI，详见试剂与溶液中的配方）文本中描述
微型离心管，1.7毫升，无菌且不具备;碱科学C3017-ST
微离心管赛莫飞舍尔3451
米勒LB培养基（详见试剂与溶液中的配方）西格玛-奥尔德里奇 L3522
尖嘴钳，2套五金店或亚马逊
无丁腈无乳胶手套 Aurelia Amazing中科92885
培养皿盖，无菌猎鹰培养皿无菌100x15毫米风格康宁公司351029
福博尔肉醦醋酸酯（PMA）（100 ng/μl，详见《试剂与溶液》中的配方） InvivoGenTLRL-pma
移液头（10和微型;L、200及微量;l、1000和微型;l） PurePoint 或同等机构碱科学 ST1010-CS、ST1200-CS、ST1000-CS
保鲜膜杂货店
纯正胶原酶溶液（100 & micro;g/mL）高级生物矩阵5005-100毫升
圆形盖套#1 1盎司（康宁浮球玻璃或渔夫品牌）康宁或费舍尔布兰德50143822或12-546-2 25CIR-2
手术刀，无菌的，一次性的，nbsp;莫佩克还是羽毛 #10AJ136 或 2975#10
Sepiapterin（SEP，100 & micro;M，详见试剂与溶液中的配方）职业生涯 河南化工公司CAS#： 17094-01-8
摇晃孵化器设定为220转/分钟，37度;C埃彭多夫新不伦瑞克科学M12990080
硅胶胶 Loctite透明硅胶IDH或3M海洋级硅胶密封剂带鼻尖透明剂乐泰特还是3M1745658或PN08019
单通道移液器 Eppendorf Research Plus，200 及微型;l埃彭多夫
单通道移液器（10 和微型;L、200及微量;l、1000和微型;l)埃彭多夫2231001122
分光光度计纳米滴光C赛莫飞世尔科学13-400-519
无菌去离子水  
无钙和镁的无菌磷缓冲丝氨酸（PBS）费舍尔科学 BSS-PBS-1X6
注射器3毫升或5毫升，带Luer-Lok尖端屋宇 署309585或309603
THP-1细胞空军交通管制委员会TIB-202
转移移液器，无菌的费舍尔布兰德13-711-20
特里顿 X-100米利波尔西格玛X100
特鲁潘蓝溶液VWR97063-702
胰蛋白酶-EDTA 0.25%赛莫飞世尔科学25200-056
用LintGuard反Stat Polyshield擦拭Kimwipes Professional。金伯利-克拉克34120
<强>原一抗： 
反人类CD163阿布卡姆156769
反人类CD68Novus生物制品NB100-683-0.1毫克
反人类CD80，E3Q9V细胞信号传导技术15416
反人类CK20 生命科技PA5-82875
反人类MUC2（996/1）热扑鱼MA5-12345
<强>二级抗体：
Alexa Fluor 488 山羊抗兔子IgG（适用于CD80和CK20）热扑鱼A11008
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠IgG（针对MUC2和CD68或CD163）热扑鱼A11005
<强>试剂与溶液：  
<强>Caco-2 中等：
DMEM中血糖高（4.5g/L）和1%（v：v）GlutaMax 赛莫飞世尔科学35050061
FBS 10%（v：v）热失活状态西格马F2242-500ML
非必需氨基酸1%用于Caco-2培养基赛莫飞世尔科学11140076
笔性链球菌 1%（对比）西格马F2242-500ML
<强>HT-29-MTX中等
DMEM中血糖高（4.5g/L）和1%（v：v）GlutaMax 赛莫飞世尔科学35050061
FBS 10%（v：v）热失活状态西格马F2242-500ML
HEPES（10 mM最终浓度）赛莫飞世尔科学15630080
笔性链球菌 1%（对比）西格马F2242-500ML
<强>THP-1 中等：
FBS（10% v：v）热灭活胎牛血清Sigma F2242-500ML
葡萄糖（最终浓度4.5 g/L）赛莫飞世尔科学A249001
谷胱甘肽 1% （v：v） 2 mM 最终浓度赛莫飞世尔科学35050061
HEPES（10 mM最终浓度）赛莫飞世尔科学15630080
笔性链球菌 1%（对比）西格马F2242-500ML
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）-1640中号赛莫飞世尔科学11875119
丙酮酸钠（最终浓度1 mM）赛莫飞世尔科学11360070
<强>纯正胶原酶溶液（稀释至1：30 100 & micro;g/ml）：
Purecol 3 mg/ml 1：30 至 100 微量;g/ml 高级生物矩阵5005-100毫升
无菌去离子水
<强>L-乙透肽液（50 mM）：强
L-二黄素（SEP）职业生涯 河南化工公司CAS#： 17094-01-8
<强>福博尔醋酸酯液（PMA，5 mg/mL）<强>InvivoGenTLRL-pma
BSA 1% 牛血清白蛋白 西格玛-奥尔德里奇5470
DMSO Sigma D2650
米勒线卫西格玛-奥尔德里奇 L3522
与二级抗体同种的正常血清Sigma NS02L-1ML
对甲醛西格玛-奥尔德里奇441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

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