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方法文章

用于细菌、肠道及免疫细胞中毒理学与免疫调节治疗异步系统开发的3D Flipwell工程

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DOI：

10.3791/68701

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2025年10月17日

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

本文内容

摘要

本文提供了一个详细的实验方案，包含关键步骤，用于指导3D Flipwell的构建与使用。我们描述并展示了如何组装共培养插件堆叠，并利用其对肠道细菌、肠道上皮细胞和巨噬细胞进行分层共培养，以模拟肠道黏膜环境。

摘要

为了研究细菌分泌组在免疫细胞极化和肠道黏膜稳态中的作用，我们开发了一种三维共培养模型，该模型采用市售的插入式培养小室并以背对背堆叠的方式组装。我们将此系统命名为3D Flipwells，成功实现了细菌、结肠上皮细胞和免疫细胞在分层结构中的共培养，以模拟肠道黏膜微环境。该共培养系统允许在膜的一侧接种结肠上皮细胞，另一侧接种未分化的非贴壁单核细胞，从而在同一共培养体系中同步实现结肠上皮细胞的极化、黏液层形成以及单核细胞向巨噬细胞的分化与极化，无需预先分化巨噬细胞后再进行分离和重新接种。该系统构建简便，仅需少量易得的材料和工具。我们通过分析共培养体系各组分对生蝶呤（SEP）——即四氢生物蝶呤（BH4）的内源性前体（一氧化氮合酶（NOS）的辅因子）——的响应，验证了该系统的实用性。结果表明，在3D Flipwells中给予SEP处理可诱导肠道细菌形成生物膜、结肠上皮产生黏液，并促进巨噬细胞向促免疫极化方向转变。这表明SEP通过不同细胞组分之间的相互作用，触发了黏膜防御机制的激活。未来还需进一步实验，以探究黏膜间通讯在免疫细胞重编程中的作用，并评估该共培养系统在筛选新型免疫调节疗法中的应用价值。

引言

免疫细胞与肠道微生物组之间的相互作用显著影响多种疾病治疗的效果。这种相互作用会受到多种外部刺激的显著调节，包括但不限于宿主代谢异常、饮食变化、疾病表现以及药物治疗。这些变化可能导致微生物群组成失衡，这种情况被称为菌群失调1,2,3。

为了更好地理解肠道中微生物与宿主免疫细胞之间的相互作用，不同研究团队已开发出复杂的共培养系统，以模拟肠道黏膜环境。从Kim等人开发的“肠道芯片”系统4，到使用特殊吸水性基质的更复杂组装5，这些共培养系统构建难度较高，且由于共培养基质对分泌成分的吸收，无法完整保留所有分泌物质。因此，Noel等人开发了一种相对更易于制备的替代性共培养系统，用于模拟肠道黏膜6。该新系统采用单个培养小室，将结肠上皮细胞接种于膜的一侧，而将预先分化的巨噬细胞接种于另一侧6。然而，接种预先分化的巨噬细胞需要先在其他地方完成其分化过程，再将其解离并重新接种至共培养体系中，这一过程可能影响细胞的完整性和存活率。

通过改进以往的系统，我们开发出一种新型的三维（3D）多层共培养系统，称为3D Flipwell系统7,8。该系统由背对背堆叠的细胞培养小室组成，可在单一共培养体系中同步实现结肠上皮细胞的极化、黏液形成、巨噬细胞的分化及其极化过程。该系统使我们能够研究肠道黏膜环境的变化，以及肠道菌群、上皮细胞与免疫细胞之间的相互作用。此外，该系统还可用于评估外界刺激物（包括细菌代谢产物、毒素、膳食营养素和药物）对肠道黏膜及机体其他部分的影响7,8。

通过利用新型共培养小室系统，我们研究了不同细胞组分对七叶灵（SEP）的反应，SEP 是一氧化氮合酶（NOS）辅因子 BH4（四氢生物蝶呤）的内源性前体。我们先前已证明，SEP 通过将肿瘤相关巨噬细胞重编程为具有促免疫原性的表型，从而在乳腺肿瘤微环境中发挥促免疫原性作用9,10,11,12。我们还证实，在共培养体系中，SEP 可诱导肠道细菌生物膜的形成、结肠上皮产生黏液以及巨噬细胞向促免疫原性方向极化等同步事件，表明激活了黏膜防御机制7。这些发现支持该新型共培养系统在模拟肠道黏膜微环境中的应用价值7。

本实验方案的总体目标是提供逐步操作指南，用于构建一种新型的共培养体系，该体系包含肠道细菌、肠道上皮、黏液和免疫细胞，以模拟肠道黏膜环境。我们还展示了如何在外部刺激（例如SEP处理）的影响下，可视化共培养细胞之间的相互作用。未来需要利用该共培养系统开展进一步研究，以确定介导共培养中不同细胞间相互作用的分泌性细胞成分，并评估该共培养模型在新疗法高通量筛选中的应用价值。此外，为了更接近肠道黏膜环境的生理状态，该共培养系统还需进一步优化。例如，若需将需氧哺乳动物细胞与厌氧细菌共培养，则需在无氧培养基中单独培养这些厌氧菌，或使用液体石蜡覆盖培养体系以阻止氧气进入，正如其他文献所报道的那样。该共培养系统的此类高级应用与功能仍需进一步深入研究。

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方案

1. 3D Flipwell 的构建

  1. 所有操作均应在细胞培养柜内进行。将所有用品放入培养柜中。
  2. 打开培养皿盖并置于一旁。从保护套中取出手术刀片，放置在培养皿底部边缘。确保无菌操作。
    注意：操作手术刀片时需格外小心。必要时请佩戴耐切割、纤维增强手套以保护双手。
  3. 打开12孔商用插入式培养插件的无菌保护包装，确保无菌。取一把无菌镊子，轻轻夹住插件并从包装中取出。
  4. 手持插件使其底部朝上。另一只手取无菌手术刀片，将其移至插件附近。
  5. 以C形动作在膜边缘刺穿膜，并沿插件底部边缘轻轻滑动刀片，始终保持靠近塑料壁。
  6. 将聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜完全切下，并用第二把镊子将其移除。弃去该膜。
  7. 使用手术刀片刮除任何残留的白色膜屑，清洁插件边缘和 rim 部位。小心地将处理好的插件放回其原始无菌包装中。
  8. 取硅胶粘合剂管，用手术刀片切去喷嘴尖端以形成开口，开口宽度应为3 mm。
  9. 通过挤压胶水滴在纸巾上测试胶珠大小。胶珠直径应为2–3 mm。若胶珠小于2 mm且难以挤出，则需调整喷嘴。
    1. 另一种施加并铺展胶珠的方法是使用剪去尖端的200 µL移液器吸头。用剪刀剪去3–4 mm，再用刮刀将胶水均匀涂抹于插件 rim 周围。
  10. 撕下第二个插件的保护盖并放置一旁。取无菌镊子，从包装中夹取第二个插件，确保膜面朝上。
  11. 用镊子小心地在插件底部周围均匀涂抹一层薄薄的硅胶，胶珠宽度为2–3 mm，注意不要触碰膜面。
  12. 取第二把无菌镊子，小心地将第一个无膜插件从其保护包装中取出。
  13. 将两个插件底部相对贴合，使底部边缘对齐。接合处可能会挤出多余胶水。让胶水自然干燥，完全干燥后（24–72 h）可将多余胶体切除。此步骤为可选。
    注：最终的Flipwell共培养插件（FCI）堆叠结构中间应仅含一层PET膜。建议将商用插件的L形手柄置于彼此相对180°的位置（如3点和6点方向）。请遵循硅胶粘合剂制造商推荐的干燥时间，通常为24–72小时，具体取决于品牌。大多数硅基胶水建议干燥72小时。也可在24小时后采用紫外灭菌加速干燥。
  14. FCI堆叠粘合完成后，将其放入原始无菌包装内或置于深型培养皿中干燥。使用指定规格的培养皿盖覆盖堆叠组件。
  15. 为灭菌堆叠组件，打开培养皿盖。使用无菌镊子将FCI堆叠放置于指定深型培养皿的边缘上。
  16. 关闭生物安全柜（BSC）玻璃门，打开紫外灯。为安全起见，请远离柜体，对膜的每一侧进行30分钟至1小时的紫外照射灭菌。每个灭菌周期结束后关闭紫外灯。
  17. 将指定的培养皿盖盖在装有插件堆叠的培养皿上，并置于一旁备用。

2. 胶原蛋白包被前的渗漏测试

  1. 取下培养皿盖。加入 500 µL 无菌 PBS 或无菌去离子水。
    注意：为便于观察，本实验使用 DMEM 以帮助观察 FCI 层的完整性。
  2. 盖上培养皿盖，静置过夜。次日早晨检查 FCI 的完整性。若发现泄漏，则弃用该 FCI，并根据需要制备新的插入层堆叠。
  3. 吸除用于测试的液体（PBS 或水），并将培养皿盖上盖。
  4. 将堆叠结构在生物安全柜（BSC）内干燥（1–2 小时）。将 FCI 储存在生物安全柜中，直至准备使用，或继续进行胶原蛋白包被以接种贴壁细胞。

3. Flipwell 膜的胶原蛋白包被

  1. 通过将提供的浓度为 3 mg/mL 的胶原蛋白溶液稀释至 1:30（终浓度为 100 µg/mL）来制备工作浓度的胶原蛋白溶液。在微量离心管中，将 33 µL 商品化胶原蛋白溶液加入 1 mL 无菌去离子水中，涡旋混匀。
    注意：若需更大体积，可根据待包被膜双面的插入式支架数量，按比例放大并使用 15 mL 圆锥形离心管。每次均需新鲜配制，不得重复使用工作液。
  2. 打开培养皿盖，使 Flipwell 悬挂在培养皿边缘。小心地向插入式支架堆叠的一侧加入 200 µL 胶原蛋白溶液。
  3. 静置 1 小时。吸除胶原蛋白溶液，加入 200 µL 无菌 PBS，随后吸除 PBS。
  4. 盖上培养皿盖，在超净台内让膜干燥 60 分钟。膜干燥后，用无菌镊子将 Flipwell 翻转至另一侧，并使其悬挂在培养皿边缘。
  5. 向未包被（现为上侧）的膜表面加入 200 µL 胶原蛋白溶液，静置 1 小时。
  6. 吸除胶原蛋白溶液，加入 200 µL 无菌 PBS，随后吸除 PBS。盖上培养皿盖，在超净台内让膜干燥 60 分钟。让 FCI 支架堆叠过夜干燥，或在同一天进行细胞接种。
    注意：胶原蛋白包被层在长期储存条件下的完整性尚未经过测试。Flipwell 预先包被后必须在 24 小时内使用。

4. 用于细菌培养的细菌插入片段构建

  1. 在生物安全柜内放置两把无菌镊子和24孔插件。小心打开插件，并将其保留在无菌包装内。
  2. 使用无菌镊子从无菌包装中取出插件。用第二把镊子或镊钳折断插件底部的小塑料脚。
  3. 通过将24孔插件插入无菌FCI堆叠装置或原始的12孔插件中，测试其适配性。
  4. 如果插件无法顺利滑入孔中，则再次使用镊子在插件边缘与底脚连接处折断更多塑料材料。
  5. 重复测试适配情况，直至24孔插件能够顺利滑入12孔插件的孔内。将插件放回其无菌包装中，或置于无菌培养皿内。
  6. 对插件进行紫外线灭菌或乙醇消毒（可选）。重新盖上包装或用培养皿盖覆盖，待使用时再打开。

5. 针头构建

  1. 将工具和所有用品放入生物安全柜内。用尖头镊子小心夹住针头。
  2. 使用直尺测量针头上每一处弯曲的位置。用另一把尖头镊子在选定位置夹住针头并进行弯曲。
  3. 制作第二个弯曲。为实现扭转，用镊子分别夹住针头基部和U形弯曲处，向相反方向扭转，形成4-5 mm的扭转段。此步骤至关重要，有助于将针头轻松插入Flipwell中以去除气泡。
  4. 将针头连接至无菌的3 mm或5 mm注射器上。将针头和注射器基部置于50 mL锥形管内的20 mL 70%-95%乙醇中进行消毒。
  5. 通过针头和注射器抽吸乙醇，确保针头和注射器基部得到充分消毒。
  6. 从含乙醇的锥形管中取出注射器和针头，将其放置在培养皿上自然晾干。用空气吹洗针头以加速干燥，并静置数分钟使其完全干燥。

6. 接种结肠上皮 Caco-2:HT29-MTX-E12 细胞系

  1. 在实验前2-3周，分别于100 mm的组织培养包被培养皿中，使用各自相应的生长培养基开始培养Caco-2和HT29-MTX细胞系。
    1. HT-29-MTX培养基配制：取440 mL高糖DMEM（4.5 g/L）并添加1% (v:v) Glutamax，加入50 mL 10% (v:v) 热灭活胎牛血清（FBS）、5 mL 1% (v:v) 青霉素-链霉素（Pen Strep）以及5 mL HEPES，终浓度为10 mM。
    2. Caco-2培养基配制：取440 mL高糖DMEM（4.5 g/L）并添加1% (v:v) Glutamax，加入50 mL 10% (v:v) 热灭活胎牛血清（FBS）、5 mL 1% (v:v) 青霉素-链霉素（Pen Strep）以及5 mL非必需氨基酸。
      注意：使用组织培养包被的12孔板确定Caco-2细胞系的接种密度。根据起始接种密度计算达到100%汇合所需天数。此处提供的接种密度仅供参考，实际数值可能因培养基配方、供应商及所用FBS的不同而有所变化。此步骤至关重要，以确保在THP-1细胞接种并进行细菌/SEP处理后，Flipwell装置的肠道上皮侧能形成完整的单层细胞。
  2. 传代Caco-2和HT-29细胞时，吸除培养基，并用10 mL PBS洗涤一次。
  3. 加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化，在37 °C、5% CO2条件下孵育5-10分钟。
  4. 向培养皿中加入7 mL对应细胞类型的完全生长培养基，将细胞悬液转移至分别标记的无菌15 mL离心管中。
  5. 在室温下以500 × g离心5分钟使细胞沉淀，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。
  6. 用1 mL预热的基于DMEM的HT-29培养基重悬细胞沉淀，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
  7. 根据所需Flipwell数量，取适量细胞，在新的15 mL或50 mL离心管中按Caco-2:HT-29 = 9:1的比例混合两种细胞。
  8. 以下步骤使用胶原预包被的Flipwell。将胶原预包被的FCI堆栈悬挂于深型培养皿边缘。
  9. 在每个Flipwell的顶侧（apical side）接种500 µL细胞悬液，接种密度为7.5 × 104 个细胞/cm2（即每12孔插入式小室接种2.6 × 105 个细胞）。根据所用堆栈数量计算起始细胞总数，该总数应包含按9:1比例混合的两种细胞。
  10. 用培养皿盖覆盖整个装置，在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育，直至细胞贴壁。细胞通常在培养7-10天后开始分泌黏液。每隔一天更换一次培养基以维持细胞培养。
    注意：需提前计算含处理阶段在内的总培养天数。翻转操作及初始接种密度均取决于该培养周期。

7. 翻转3D Flipwell以准备接种THP-1细胞

  1. 当 Caco-2:HT-29 细胞贴壁并开始增殖（具体汇合度需根据所用培养基/胎牛血清及培养时间估算），但尚未达到 100% 汇合度时，翻转 Flipwell，以在膜的另一侧接种 THP-1 细胞。
    注意：此时 THP-1 细胞应已在单独的培养体系中扩增，所需确切细胞数量需根据所用 FCI 堆叠装置的数量进行估算。
  2. 打开培养皿盖，吸除 FCI 堆叠装置顶端（肠上皮侧）的 DMEM 培养基。
  3. 使用无菌镊子，通过钩子小心夹起 Flipwell，并旋转 180°。用另一组无菌镊子夹住此时朝上的另一个钩子，固定 FCI 堆叠装置。
  4. 将组件放回培养皿中，将钩子悬挂在培养皿边缘。若暂不接种 THP-1 细胞，需向深型培养皿中加入足量培养基，使液面上升至膜的顶部。
    注意：Flipwell 在此位置应保持稳定，应立即进行 THP-1 细胞接种和培养基添加操作。这些步骤需快速完成。THP-1 细胞应已完成计数并准备接种。首先接种 THP-1 细胞以增加 FCI 堆叠装置的重量，提高其稳定性；随后向深型培养皿中加入 DMEM 培养基，使液面上升至膜的底侧。然后使用自制针头去除气泡，进一步稳定 FCI 堆叠装置，并进行最终体积调整。
  5. 使用针头按下一步所述方法去除气泡。

8. 去除气泡

  1. 使用前将针头和注射器在乙醇中预灭菌，并晾干（参见步骤5）。压下注射器活塞。
  2. 用无菌镊子夹住FCI装置的臂部。小心地将针头插入并置于插件组件下方，轻轻将灌胃针的软头向上抵住气泡。
  3. 缓慢而轻柔地向上拉动注射器活塞，观察气泡逐渐消失。当气泡直径约为2 mm时停止操作，此时足以维持DMEM对结肠上皮细胞的良好覆盖。
  4. 小心地将针头和注射器从Flipwell中取出。继续对培养皿中另一个插件组件进行相同操作。

9. THP-1 细胞接种与 PMA 处理

  1. 配制THP1培养基：取420 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640培养基，加入50 mL 10% (v:v) 热灭活胎牛血清（FBS）、5 mL 1% (v:v) Glutamax、5 mL HEPES（终浓度10 mM）、11 mL 葡萄糖（终浓度4.5 g/L）和5 mL 青霉素-链霉素溶液（1% v:v）。
    注意：THP-1细胞在接种至插件前，需在基于RPMI的培养基中培养数天。接种前应提前进行细胞计数计算，并根据拟使用的FCI堆叠数量相应放大培养规模。
  2. 将细胞悬液按500 µL体积、每500 µL THP-1培养基含0.5 × 106个细胞的密度进行制备。若需使用PMA诱导分化与极化，则在RPMI培养基中加入PMA至终浓度100 ng/µL。
    1. 配制PMA：将5 mg佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）溶于1 mL DMSO中，配制成5 mg/mL的储存液，涡旋混匀。分装至微量离心管中，每管20 µL，-20 °C保存。
    2. 使用PMA时，取1 µL 5 mg/mL储存液加入99 µL完全培养基中（1:100稀释），配制成50 µg/mL的工作液。每500 µL培养基中加入1 µL工作液，或每10 mL培养基中加入20 µL工作液。
  3. 将THP-1细胞在室温下以94 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。用5–10 mL RPMI培养基重悬细胞，采用任意常用方法进行细胞计数。
  4. 再次在室温下以94 × g离心5分钟，弃上清，用THP-1培养基重悬细胞至每500 µL含0.5 × 106个细胞的密度。
  5. 将500 µL THP-1细胞悬液加入共培养插件堆叠的顶室侧。通过向深孔培养皿中补充培养基，调节HT-29细胞的培养环境。
  6. 如需要，参照步骤8使用灌胃针去除气泡。将两种细胞置于细胞培养孵箱中，于37°C、5% CO2、100%湿度条件下培养，直至THP-1细胞贴壁（过夜）并增殖1–2天。
  7. 准备进行SEP或其他药物处理，或准备细菌插件实验（见步骤4）。在下一次FCI堆叠翻转前1天开始培养细菌。

10. SEP 和细菌培养插件的第二次翻转培养板翻转及气泡去除

  1. 打开培养皿盖。用移液器从顶侧吸除RPMI培养基。用无菌镊子夹住Flipwell的臂部，提起支架组件。
  2. 将支架组件翻转倒置。用另一把镊子夹住支架组件上可用的臂部。
  3. 将支架组件放入一个新的无菌深孔培养皿中，并悬挂在边缘上。向现在朝上的顶侧/肠道上皮侧加入500 µL DMEM培养基。
  4. 向深孔培养皿中加入足够的RPMI培养基，直至液面刚好达到膜的顶部。RPMI培养基的体积估计约为40–55 mL，但具体体积会根据每个深孔培养皿中使用的FCI支架组件数量而变化。
  5. 按照步骤8操作以去除气泡，保留2–3 mm气泡。如有需要，调整RPMI培养基体积。盖上培养皿盖。
  6. 继续培养，直至结肠上皮细胞开始分泌黏液。每隔一天部分更换一次培养基。
    注意：如果结肠上皮细胞已培养足够长时间并已产生黏液，则可直接进行细菌插入或处理操作。切勿使下室中的培养基液面低于插入膜的底面。添加更多DMEM培养基以维持液面与膜齐平。最佳换液方法是从基底外侧室中移除一半培养基，同时在顶侧室中保留少量培养基，以防止空气进入。
  7. 对于SEP处理，若未使用细菌培养，则在此时向孔中加入SEP，使其终浓度为100 µM。若使用细菌培养和插入装置，则将SEP加入细菌培养物中。有关细菌培养，请参见步骤11。
    1. 配制SEP：将100 mg L-Sepiapterin溶于84.3 mL DMSO中，通过涡旋混合。分装至微量离心管中，每管100 µL。于-20 °C保存。每插入装置在500 µL培养基中使用1 µL SEP分装液（终浓度为100 µM）。

11. 启动细菌培养（可选）

  1. 为了研究细菌代谢物对免疫细胞、黏液和结肠上皮的影响，将细菌小室添加到小室组件的顶端侧。细菌小室的构建请参见步骤4。我们在使用细菌小室的前一天培养了Bacillus subtilis。
  2. 在使用细菌小室前2天配制并高压灭菌Miller LB培养基。配制LB培养基时，将6.25 g Miller LB与250 mL去离子水混合于500 mL玻璃烧瓶中，用铝箔覆盖，高压灭菌后冷却至室温。灭菌后的LB培养基可保存在4 °C或室温下。
  3. 在使用细菌小室的前一天，从甘油菌种中开始培养Bacillus subtilis细菌。
  4. 开始细菌培养时，在无菌50 mL锥形管中，用冷冻甘油菌种接种10 mL Miller LB培养基中的Bacillus subtilis。注意不要让甘油菌种完全解冻。
  5. 使用无菌200 µL枪头，从甘油菌种中挑取少量细菌，将枪头排入装有10 mL LB培养基的无菌50 mL锥形管中。
  6. 若使用SEP，开始处理时向10 mL细菌培养物中直接加入20 µL SEP储备液（终浓度应为100 µM），加入无菌50 mL锥形管的起始培养物中。
  7. 将Bacillus subtilis在37 °C、220 rpm振荡培养箱中培养8小时。在当天结束时进行第二次SEP处理——向含细菌的10 mL LB培养基中加入20 µL SEP，使终浓度达到100 µM。
  8. 继续在220 rpm、37 °C条件下过夜培养。次日早晨进行第三次处理，向含Bacillus subtilis的10 mL LB培养基中加入20 µL SEP，继续振荡培养，直至准备进行细菌小室实验。

12. 向Flipwell中添加细菌插入片段（可选）

  1. 按照第4步所述进行细菌插入片段的构建。按照第11步所述进行细菌培养。
    注意：如果有独立的细胞培养操作台，应优先使用。否则，将细胞培养操作台内的工作区域分为两半，分别用于细菌和细胞培养，保持两者分离。细胞培养物不应放回细胞培养孵育箱。在完成本方法后，生物安全柜（BSC）需进行灭菌处理，并暴露于紫外线下24小时或更长时间。
  2. 在以下步骤中使用两对无菌镊子。所有以下步骤均须在生物安全柜（BSC）内进行。
  3. 用镊子将预先制备好的无菌24孔插入装置从包装中取出，放入无菌培养皿中，并盖上皿盖。
  4. 根据所需细菌插入装置的数量重复上述操作。将装有Flipwell的培养皿从孵育箱中转移至生物安全柜（BSC）内，并放置在与细菌插入装置相对的一侧。
  5. 用移液器从Flipwell的顶端（上腔）吸出300 µL DMEM培养基，为插入细菌插入装置留出空间。在FCI堆叠的上腔保留约200 µL培养基。将培养皿盖盖在插入装置组件上。
  6. 向24孔细菌插入装置中加入50–100 µL 的 B.subtilis 菌液。注意避免将菌液溅出或污染插入装置的外壁和边缘。可通过测定OD600来监测菌液的生长阶段。
  7. 用无菌镊子夹起含有菌液的细菌插入装置，小心地将其插入Flipwell的上腔中。旋转其臂部，并将其悬挂在FCI堆叠的边缘上。用第二对无菌镊子固定堆叠结构。
  8. 对剩余的FCI堆叠重复上述操作。盖上培养皿，置于生物安全柜（BSC）内静置3小时。切勿将其放入孵育箱中。
  9. 3小时后，使用无菌镊子将细菌插入装置从Flipwell中取出。对剩余的插入装置组件重复此操作。将细菌插入装置丢弃。
    注意：细菌及细菌插入装置应按照所在机构的生物危害废弃物处理政策以及安全与健康指南进行处置。本实验未对细菌组分或细菌本身进行检测。
  10. 为分析黏膜、上皮及免疫细胞区室的变化，继续进行膜的清洗并准备成像。
  11. 吸除Flipwell上腔的DMEM培养基，用500 µL无菌PBS洗涤。用镊子将FCI堆叠从培养皿中取出，并转移至新的培养皿中。
  12. 将Flipwell翻转，使其悬挂在培养皿边缘，用500 µL无菌PBS冲洗膜面。
  13. 如需短期保存，可将FCI堆叠置于50 mL锥形管内的无菌PBS中保存（30分钟至过夜）。
    注意：必须提前确定下一步所采用的成像方法，并判断是否需要将膜切成两半以同时进行电子显微镜观察和荧光抗体标记。

13. 拆卸Flipwell以进行扫描电子显微镜（SEM）观察

注意：为了在SEP/细菌处理后观察结肠上皮细胞和巨噬细胞的形态学变化，我们使用固定缓冲液固定膜，随后拆卸Flipwell装置用于扫描电子显微镜（SEM）观察。固定剂采用PFA，但也可使用戊二醛。重要的是需咨询显微成像中心，了解其推荐的固定缓冲液、具体的脱水步骤以及初始固定缓冲液的浓度。若需储存，膜可保存在固定缓冲液中。该操作可在生物安全柜外进行。若成像中心需将膜粘附固定，可将其切成两半，以便分别对两侧进行成像。

  1. 使用耐溶剂标记笔，在FCI叠层的塑料侧面用符号标记所使用的细胞类型。或者，直接在膜上标记一个点、打勾或叉号，以标识所使用的细胞类型。
  2. 将Flipwell放入50 mL锥形管中，无需拆解。加入足量4% PFA，使其完全浸没叠层。在4% PFA中固定过夜。
    1. 配制4% PFA（无甲醇）：将40 g多聚甲醛溶解于800 mL 1× PBS中。配制0.4% PFA：将4 g多聚甲醛溶解于800 mL 1× PBS中，或按1:10比例用1× PBS稀释4% PFA（将100 mL 4% PFA加入900 mL 1× PBS中）。
  3. 如需长期保存，可将PFA更换为0.4% PFA。具体保存时长和缓冲液选择请咨询显微成像中心。
  4. 拆解Flipwell时，用双手握住装置，扭转并分离叠层中粘合的部分。叠层将分为两部分：一部分带有膜，另一部分为无膜的插入件。丢弃无膜的插入件。
  5. 旋转带有膜的插入件，将其膜面朝上放置。可在膜边缘用一个小点或叉号进行标记，以识别膜的哪一侧对应何种细胞类型。
  6. 用镊子夹住插入件的侧壁，用手术刀片小心切下膜，并将其放入含有500 µL–1 mL 0.4%–4% PFA溶液的1.7 mL离心管或小型玻璃瓶中。
  7. 提交至显微成像中心进行脱水处理和成像。脱水步骤详见Beamer等人的文献7。
  8. 根据机构规定的危险废物处理政策和健康安全指南，妥善处置PFA或其他固定剂。

14. 用于共聚焦显微镜观察的Flipwell拆卸大液滴法

注意：已创建一种新方法用于染色和成像膜结构。共培养插件堆叠在初始固定、通透和封闭步骤中保持完整，这些步骤均在50 mL圆锥管内完成。采用免疫荧光标记和共聚焦显微镜对膜的两侧进行成像。过夜孵育步骤采用新命名的12孔板方法，而拆卸后的插件底部染色则使用大液滴法。通过共聚焦Z轴扫描对膜的两侧进行成像。染色后的膜被夹在两片圆形玻璃盖玻片之间，该夹心结构被置于商用圆形成像室的两个金属环中间进行观察。使用多光子激光扫描共聚焦显微镜结合商用成像软件进行成像。

  1. 洗涤膜时，将共培养插件堆叠直接放入一个 50 mL 的锥形管中，并加入 15 mL 无菌 PBS，或分别清洗每一侧（如下所述）。
  2. 吸除 DMEM，向顶侧加入 300 µL 无菌 PBS。吸除 PBS 后，小心地将插件堆叠从培养皿中取出。
  3. 翻转 Flipwell，向现在朝上的 FCI 堆叠 RPMI 侧加入 300 µL PBS，随后吸除 PBS。
  4. 使用耐溶剂标记笔在堆叠的顶部和底部做标记，以区分哪一侧含有哪种细胞类型。
  5. 将 Flipwell 放入一个 50 mL 无菌锥形管中，加入 15 mL 无菌 4% 多聚甲醛（PFA）作为初始固定液，固定 10 分钟。如需过夜孵育，则更换为 15 mL 含 0.4% PFA 的 PBS 溶液，盖好后于 4 °C 过夜孵育。
  6. 若继续进行免疫染色，请准备用于大液滴法的操作台面。
    裁下 10 × 14 英寸的塑料薄膜，用胶带固定其四角，形成平整的操作表面。
  7. 使用 200 µL 移液器吸取 200 µL PBS，形成一个大液滴。旋开插件组件，将其分离为单个插件。
  8. 使用耐溶剂标记笔，在膜的一侧边缘附近点一个小点，以标记用于染色和成像的细胞类型所在侧。
  9. 若插件底部仍残留有硅胶垫圈或胶水，请将其清除，以确保插件在后续步骤中能保持直立。
  10. 小心地将 FCI 堆叠（含 THP-1 细胞）放置在 200 µL PBS 大液滴上。向顶侧（含结肠上皮细胞）加入 200 µL 通透缓冲液，孵育 10 分钟。
    1. 配制通透缓冲液：将 0.1% v/v Triton-X100 溶于 PBS 中。
  11. 吸除液体，加入 200 µL PBS。重复此洗涤步骤 2 次。另取 250 µL 封闭缓冲液，形成新的液滴。
    1. 配制封闭缓冲液：将 250 µL 正常山羊血清加入 5 mL 1× PBS 中（终浓度为 5% 血清），再加入 15 µL Triton-X100（终浓度为 0.3% v:v），充分混匀后于 4 °C 保存 1–2 天。
  12. 将插件放置在封闭缓冲液液滴上，室温封闭 30 分钟。从顶侧吸除 PBS，向插件顶部加入 200 µL 封闭缓冲液。此时膜的两侧均已准备好进行过夜抗体染色。

15. 免疫荧光（IF）染色

注意：染色采用12孔板法过夜进行，或在台面上采用大液滴法进行。

  1. 准备用于在4 °C过夜或室温下对膜两侧进行染色所需的抗体。将所有抗体用含1% BSA的PBS按1:100稀释。或者，遵循制造商的建议，并通过优化染色实验确定理想的抗体浓度和稀释缓冲液。
  2. 大液滴法
    1. 在实验台面上铺上塑料膜并用胶带固定四角，形成一个大矩形。将200 µL稀释后的抗体溶液滴加到塑料膜上，形成一个大液滴。将插入膜的底部朝下放置于大液滴之上。
    2. 向插入膜的顶部加入200 µL一抗，室温孵育2小时。
  3. 12孔板法
    1. 若采用12孔板法进行过夜染色，向插入膜的顶部加入300 µL一抗。
    2. 向12孔板的孔中加入300 µL一抗，将插入膜放入12孔板的孔中，使其位于液滴上方。盖上孔板盖子，并于4 °C过夜孵育。
  4. 染色完成后，用PBS清洗膜的两侧。使用移液器和200 µL吸头，用200 µL PBS小心冲洗插入膜底部3次。对于插入膜顶部，通过加入200 µL PBS，吸去液体，重复洗涤3次。
  5. 根据制造商的说明或使用含1% BSA的PBS按1:1000稀释（或其他推荐条件）配制所有二抗（具体使用的抗体请参见材料表）。二抗染色需在避光条件下进行；可使用纸板箱或柜子抽屉创建无光环境。
  6. 采用大液滴法或12孔板法，准备新的无菌板，在避光环境中室温孵育2小时。洗涤步骤同15.4所述。

16：共聚焦成像的准备工作

  1. 如果尚未按照步骤14所述对膜进行标记，请进行标记以明确细胞类型的定位。使用耐溶剂标记笔在任意位置（建议边缘）做一小记号（如点、×、勾等）。
  2. 小心地从储存容器中取出圆形盖玻片，并轻轻放置在实验台表面。
  3. 用PBS将DAPI稀释至1:100。若使用液滴分配器添加DAPI，则向盖玻片中央加入1–3滴；否则，用移液器将1–3滴DAPI滴加至盖玻片中央。
  4. 用镊子夹住插入物，用手术刀沿边缘/底部周围以环形方式小心切割，将膜完整切下。注意防止膜掉落到实验台上。将塑料插入物放回实验台，继续用镊子夹住膜，同时用手术刀切断最后残留的纤维组织。
  5. 将插入物置于含DAPI的盖玻片上方，在膜的顶部再加入1–3滴DAPI（1:100稀释液），使膜的两面均接触DAPI。
  6. 用手指（佩戴个人防护装备）轻轻提起第二张盖玻片。请勿使用镊子，因盖玻片极为脆弱。
  7. 将第二张盖玻片对准第一张盖玻片上方，小心地将其缓慢覆盖在膜上。
  8. 如有需要，使用耐溶剂标记笔在盖玻片一侧进行标记，以编码细胞类型或方向（可选）。若膜已标记，则跳过此步骤。
  9. 根据待成像盖玻片的数量及可用金属环的数量，可选择将盖玻片夹在商用金属环之间以固定圆形盖玻片用于成像，或将其避光保存至成像前。
  10. 成像时，将带有膜的盖玻片安装在细胞腔室的金属环之间，并放入共聚焦显微镜的样品 holder 中。成像前请提前联系共聚焦显微镜核心平台，确认所需使用的 holder 类型。
  11. 准备成像时，用铝箔将每一片“三明治”结构包裹好，并送至成像设施。
  12. 利用Z轴层扫功能，根据所用荧光染料的激发波长，分别对膜的两侧进行独立扫描。翻转后对第二侧进行成像。如需保存盖玻片，请避光并于4 °C条件下储存。

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结果

为了确定肠道细菌、结肠上皮细胞和巨噬细胞Flipwell共培养体系的生物学意义，我们使用了亚叶酸（sepiapterin, SEP）处理共培养体系。SEP是一种精氨酸代谢调节剂，可促进一氧化氮的生成9,10,11，并与对照组DMSO处理进行比较。我们采用免疫荧光（IF）显微镜和扫描电子显微镜（SEM）分析SEP处理对共培养体系中各组分的影响。染色结果显示，SEP处理后肠道上皮区黏液分泌显著增加，表现为上皮标志蛋白CK20和黏膜蛋白MUC2表达水平升高（图1）。此外，我们发现SEP处理提高了M1型巨噬细胞标志物CD80的表达，同时下调了M2型巨噬细胞标志物CD163，提示巨噬细胞向M1型极化（图2）。另外，SEM分析显示，SEP处理后三种组分均出现明显的表型变化（图3）。与免疫...

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讨论

重建肠道黏膜结构 体外我们设计了一种简单的共培养系统，该系统包含分层排列的肠道细菌、分泌黏液的结肠上皮细胞以及巨噬细胞。这种多层共培养系统使我们能够研究细菌分泌组、肠道上皮细胞与巨噬细胞之间相互作用对免疫原性重编程及黏膜防御机制的诱导作用。

制备3D Flipwell时一个重要的注意事项是，组装必须在无菌环境中进行，并在接种细胞前用紫外光灭菌数天。我们使用配备有正常功能紫外灯的BSL2级生物安全柜完成灭菌过程。在初始灭菌步骤中，按照说明使用了已灭菌的工具和70%乙醇。在构建阶段，经过多次尝试后可形成均匀一致的硅胶粘合珠，从而提高实验的可重复性。练习该技术并额外准备一些插入式组件堆叠可能有助于操作。在翻转插入组件后去除气泡时，我们发现15G灌胃针是最有效的工具，并已确定其用于此目的的最佳形状。在第二次接种细胞前，必须提前准备并灭菌该针具。

每种细胞类型在合并到共培养系统之前，都必须在独立的培养环境中进行培养 。为了维持单层结肠上皮细胞的生长，必须考虑每种细胞类型的初始接种密度、总体培养时间，以及对细菌...

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披露

作者声明不存在利益冲突。作者在此声明，在法律允许的最大范围内，对所有明示或暗示的保证概不负责。在任何情况下，作者均不承担因使用Flipwell构建工具、BSL试剂、细胞系、细菌培养物，或在厌氧箱的厌氧环境中使用Flipwell系统所引起或相关的特殊、偶然、间接、惩罚性、多重或继发性损害责任，无论该责任基于任何成文法、合同、侵权或其他法律理论。该责任限制包括但不限于本文未明确描述的任何Flipwell使用方式。

致谢

第一作者衷心感谢富田纱织博士在远距离情况下仍提供的卓越指导能力、持续的指导与支持，以及娴熟且持续的项目设计，这些为出色的学习机会创造了条件。作者们还感谢Sharma博士在微生物学方面的专业知识与指导，感谢Veani R. Fernando博士在THP-1巨噬细胞制备方面的贡献，同时感谢Gebremichal Gebretsadik Weidengus和Islam博士在拍摄前协助准备所需的培养基、细胞及细菌培养物。

作者还感谢大都会医疗中心/癌症生物学部在拍摄过程中提供的热情接待和支持。主要作者感谢密歇根大学的Erin Janssen博士、Eliza Tsou博士以及Caroline Foster为本项目提供的支持，包括备用物资和拍摄期间使用的XL号实验服。

此外，作者感谢托莱多大学电子显微镜中心的 Andrew Kleinhenz 博士和 William T. Gunning 博士，以及仪器中心的 Cassandra Zamora 和 Kristin Kirschbaum 在电镜成像方面的建设性建议。本研究得到了托莱多大学健康科学校区医学院与生命科学学院癌症生物学系为 S.F. 提供的启动资金；俄亥俄州癌症研究资助（项目编号：5017）支持 S.F.；医学研究学会（托莱多基金会，编号：206298）奖项支持 S.F.；美国癌症学会研究学者资助（RSG-18-238-01-CSM）支持 S.F.；以及美国国家癌症研究所研究资助（R01CA248304）支持 S.F.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.4% PFA（参见试剂与溶液部分的配方）文中已描述
10 ml 血清移液管Corning4488
12 孔组织培养板，  CostarCorning3513
15 ml 锥形管，SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 µl 吸头 USA Scientific1111-1700
24 孔插件 — 24 孔板用培养插件，PET 0.4 µm BrandTech Scientific782710
3D Flipwells 预制，UV 灭菌 实验室自制
4% PFA（参见试剂与溶液部分的配方）文中已描述
50 mM Sepiapterin 储存液（SEP，参见试剂与溶液部分的配方）Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
50 ml 锥形管Greiner Bio-One227261
5 ml 血清移液管Corning4487
70–95% 乙醇（乙基酒精）Decon Labs04-355-151
铝箔Fisher Scientific01-213-100
动物饲喂针头，20 号，1.5” 长度，一次性使用 Fisher Scientific01-208-87
抗体稀释缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方）文中已描述
Attofluor 细胞培养腔室 ThermoFisher ScientificA7816
高压灭菌指示胶带Fisher Scientific15-901-111
枯草芽孢杆菌野生型（3A1T）菌株，甘油保存菌种（）Bacillus Genetic Stock Center（https:// bgsc. org/
粉红色无粉腈类手套，不含乳胶，BioGripTop Quality ManufacturingP2810
封闭缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方 — 含 10% 正常山羊血清的 PBS）文中已描述
封闭缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方）文中已描述
明场显微镜（Nikon 或同等型号）Eclipse Ts2NikonTS2
Caco-2 细胞ATCCHTB-37
细胞培养箱，37°C，5% CO2（Eppendorf CellXpert）Eppendorf6734010015
离心机（Eppendorf，Centrifuge 5804/5804 R 或同等型号）Eppendorf22622501
50 ml 离心管，SpectraTubeAlkali ScientificC2750
12 孔板用培养插件，PET，0.4 µm，无菌BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
DAPI VectaShield 封片剂Vector LaboratoriesH-1000
深型培养皿底部，100 × 25 mm，深型可堆叠聚苯乙烯培养皿，无菌 USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Eppendorf 5804 离心机，配备适用于 50 ml 锥形管的摆动转子Eppendorf22622501
镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2 套VWR82027-438
镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2 套，标本镊VWR82027-438
500 ml 玻璃烧瓶Corning 4980-500
血细胞计数板（带盖玻片的 Neubauer 型）Thermo Fisher Scientific50-312-90
HT-29-MTX-E12 细胞Millipore Sigma12040401
ImmunoPen（可选）Fisher Scientific4021761EA
凯夫拉材质或其他抗切割手套（可选）五金店或 Amazon
实验室胶带或封箱胶带Fisher Scientific 159015R
层流罩 1300 系列 A2 BSC II 级ThermoFisher Scientific1375
带紫外灭菌功能的层流罩 SterilGARDThe Baker CompanySG403A-HE
耐溶剂记号笔VWR52877-310 或 95042-566
Caco-2 细胞培养基（基于高糖 DMEM，参见试剂与溶液部分的配方）参见  文中描述
HT-29 细胞培养基（高糖 DMEM，参见试剂与溶液部分的配方）文中已描述
THP-1 细胞培养基（RPMI，参见试剂与溶液部分的配方）文中已描述
微量离心管，1.7 ml，无菌 Alkali ScientificC3017-ST
微量离心管Thermo Fisher3451
Miller LB 培养基（参见试剂与溶液部分的配方）Sigma-Aldrich L3522
尖嘴钳，2 套五金店或 Amazon
无粉无乳胶腈类手套 Aurelia AmazingMidSci92885
培养皿盖，无菌 Falcon 培养皿，100×15 mm 型Corning Inc351029
佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）（100 ng/μl，参见试剂与溶液部分的配方） InvivoGenTlrl-pma
移液吸头（10 µl、200 µl、1000 µl），PurePoint 或同等产品Alkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
塑料保鲜膜超市
Purecol 工作用胶原酶溶液（100 µg/mL）Advanced BioMatrix5005-100ML
圆形盖玻片 #1 1 oz（Corning 浮法玻璃或 Fisherbrand）Corning 或 Fisherbrand50143822 或 12-546-2 25CIR-2
手术刀片，无菌，一次性 Mopec 或 Feather #10AJ136 或 2975#10
Sepiapterin（SEP，100 µM，参见试剂与溶液部分的配方）Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
摇床培养箱，设定为 220 rpm，37°CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
硅酮粘合剂 Loctite Clear Silicone IDH 或 3M 船用级透明硅酮密封胶，带尖嘴Loctite 或 3M1745658 或 PN08019
单通道移液器 Eppendorf Research Plus，200 µlEppendorf
单通道移液器（10 µl、200 µl、1000 µl）Eppendorf2231001122
分光光度计 NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
无菌去离子水  
无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS），无菌Fisher Scientific BSS-PBS-1X6
3 ml 或 5 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器BD309585 或 309603
THP-1 细胞ATCCTIB-202
移液管，无菌Fisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
台盼蓝溶液VWR97063-702
0.25% 胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25200-056
擦拭纸 Kimwipes Professional，带防静电 LintGuard PolyshieldKimberly-Clark34120
一抗： 
抗人 CD163Abcam156769
抗人 CD68Novus BiologicalsNB100-683-0.1 mg
抗人 CD80，E3Q9VCell Signaling Technologies15416
抗人 CK20 Life TechnologiesPA5-82875
抗人 MUC2（996/1）ThermoFisherMA5-12345
二抗：
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（用于 CD80 和 CK20）ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG（用于 MUC2、CD68 或 CD163）ThermoFisherA11005
试剂与溶液：  
Caco-2 培养基：
含高糖（4.5 g/L）和 1%（v:v）GlutaMax 的 DMEM Thermo Fisher Scientific35050061
10%（v:v）热灭活胎牛血清（FBS）SigmaF2242-500ML
非必需氨基酸（1%），用于 Caco-2 培养基Thermo Fisher Scientific11140076
青霉素-链霉素（1% v:v）SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX 培养基
含高糖（4.5 g/L）和 1%（v:v）GlutaMax 的 DMEM Thermo Fisher Scientific35050061
10%（v:v）热灭活胎牛血清（FBS）SigmaF2242-500ML
HEPES（终浓度 10 mM）Thermo Fisher Scientific15630080
青霉素-链霉素（1% v:v）SigmaF2242-500ML
THP-1 培养基：
热灭活胎牛血清（FBS）（10% v:v）Sigma F2242-500ML
葡萄糖（终浓度 4.5 g/L）Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1%（v:v） （终浓度 2 mM）Thermo Fisher Scientific35050061
HEPES（终浓度 10 mM）Thermo Fisher Scientific15630080
青霉素-链霉素（1% v:v）SigmaF2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 培养基Thermo Fisher Scientific11875119
丙酮酸钠（终浓度 1 mM）Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol 工作用胶原酶溶液（稀释至 1:30，100 µg/ml）：
Purecol 3 mg/ml 稀释至 1:30，得 100 µg/ml Advanced BioMatrix5005-100ML
无菌去离子水
L-Sepiapterin 储存液（50 mM）：
L-Sepiapterin（SEP）Career Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯储存液（PMA，5 mg/mL）InvivoGenTlrl-pma
1% BSA（牛血清白蛋白） Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich L3522
与二抗同源的正常血清Sigma NS02L-1ML
多聚甲醛Sigma-Aldrich441244

参考文献

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

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三维共培养肠道黏膜模型细菌分泌组免疫细胞极化结肠上皮细胞巨噬细胞极化生物膜形成四氢新蝶呤处理免疫荧光染色
用于细菌、肠道及免疫细胞中毒理学与免疫调节治疗异步系统开发的3D Flipwell工程
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