本文提供了一个详细的实验方案，包含关键步骤，用于指导3D Flipwell的构建与使用。我们描述并展示了如何组装共培养插件堆叠，并利用其对肠道细菌、肠道上皮细胞和巨噬细胞进行分层共培养，以模拟肠道黏膜环境。
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本文内容
摘要
摘要
为了研究细菌分泌组在免疫细胞极化和肠道黏膜稳态中的作用，我们开发了一种三维共培养模型，该模型采用市售的插入式培养小室并以背对背堆叠的方式组装。我们将此系统命名为3D Flipwells，成功实现了细菌、结肠上皮细胞和免疫细胞在分层结构中的共培养，以模拟肠道黏膜微环境。该共培养系统允许在膜的一侧接种结肠上皮细胞，另一侧接种未分化的非贴壁单核细胞，从而在同一共培养体系中同步实现结肠上皮细胞的极化、黏液层形成以及单核细胞向巨噬细胞的分化与极化，无需预先分化巨噬细胞后再进行分离和重新接种。该系统构建简便，仅需少量易得的材料和工具。我们通过分析共培养体系各组分对生蝶呤（SEP）——即四氢生物蝶呤（BH4）的内源性前体（一氧化氮合酶（NOS）的辅因子）——的响应，验证了该系统的实用性。结果表明，在3D Flipwells中给予SEP处理可诱导肠道细菌形成生物膜、结肠上皮产生黏液，并促进巨噬细胞向促免疫极化方向转变。这表明SEP通过不同细胞组分之间的相互作用，触发了黏膜防御机制的激活。未来还需进一步实验，以探究黏膜间通讯在免疫细胞重编程中的作用，并评估该共培养系统在筛选新型免疫调节疗法中的应用价值。
引言
免疫细胞与肠道微生物组之间的相互作用显著影响多种疾病治疗的效果。这种相互作用会受到多种外部刺激的显著调节，包括但不限于宿主代谢异常、饮食变化、疾病表现以及药物治疗。这些变化可能导致微生物群组成失衡，这种情况被称为菌群失调1,2,3。
为了更好地理解肠道中微生物与宿主免疫细胞之间的相互作用，不同研究团队已开发出复杂的共培养系统，以模拟肠道黏膜环境。从Kim等人开发的“肠道芯片”系统4，到使用特殊吸水性基质的更复杂组装5，这些共培养系统构建难度较高，且由于共培养基质对分泌成分的吸收，无法完整保留所有分泌物质。因此，Noel等人开发了一种相对更易于制备的替代性共培养系统，用于模拟肠道黏膜6。该新系统采用单个培养小室，将结肠上皮细胞接种于膜的一侧，而将预先分化的巨噬细胞接种于另一侧6。然而，接种预先分化的巨噬细胞需要先在其他地方完成其分化过程，再将其解离并重新接种至共培养体系中，这一过程可能影响细胞的完整性和存活率。
通过改进以往的系统，我们开发出一种新型....
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方案
1. 3D Flipwell 的构建
- 所有操作均应在细胞培养柜内进行。将所有用品放入培养柜中。
- 打开培养皿盖并置于一旁。从保护套中取出手术刀片，放置在培养皿底部边缘。确保无菌操作。
注意：操作手术刀片时需格外小心。必要时请佩戴耐切割、纤维增强手套以保护双手。 - 打开12孔商用插入式培养插件的无菌保护包装，确保无菌。取一把无菌镊子，轻轻夹住插件并从包装中取出。
- 手持插件使其底部朝上。另一只手取无菌手术刀片，将其移至插件附近。
- 以C形动作在膜边缘刺穿膜，并沿插件底部边缘轻轻滑动刀片，始终保持靠近塑料壁。
- 将聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜完全切下，并用第二把镊子将其移除。弃去该膜。
- 使用手术刀片刮除任何残留的白色膜屑，清洁插件边缘和 rim 部位。小心地将处理好的插件放回其原始无菌包装中。
- 取硅胶粘合剂管，用手术刀片切去喷嘴尖端以形成开口，开口宽度应为3 mm。
- 通过挤压胶水滴在纸巾上测试胶珠大小。胶珠直径应为2–3 mm。若胶珠小于2 mm且难以挤出，则需调整喷嘴。
- 另一种施加并铺展胶珠的方法是使用剪去尖端的200 µL移液器吸头。用剪刀剪去3–4 mm，再用刮刀将胶水均匀涂抹于插件 rim 周围。
- 撕下第二个插件的保护盖并放置一旁。取....
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结果
为了确定肠道细菌、结肠上皮细胞和巨噬细胞Flipwell共培养体系的生物学意义，我们使用了亚叶酸（sepiapterin, SEP）处理共培养体系。SEP是一种精氨酸代谢调节剂，可促进一氧化氮的生成9,10,11，并与对照组DMSO处理进行比较。我们采用免疫荧光（IF）显微镜和扫描电子显微镜（SEM）分析SEP处理对共培养体系中各组分的影响。染色结果显示，SEP处理后肠道上皮区黏液分泌显著增加，表现为上皮标志蛋白CK20和黏膜蛋白MUC2表达水平升高（图1）。此外，我们发现SEP处理提高了M1型巨噬细胞标志物CD80的表达，同时下调了M2型巨噬细胞标志物CD163，提示巨噬细胞向M1型极化（图2）。另外，SEM分析显示，SEP处理后三种组分均出现明显的表型变化（图3）。与免疫.......
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讨论
重建肠道黏膜结构 体外我们设计了一种简单的共培养系统，该系统包含分层排列的肠道细菌、分泌黏液的结肠上皮细胞以及巨噬细胞。这种多层共培养系统使我们能够研究细菌分泌组、肠道上皮细胞与巨噬细胞之间相互作用对免疫原性重编程及黏膜防御机制的诱导作用。
制备3D Flipwell时一个重要的注意事项是，组装必须在无菌环境中进行，并在接种细胞前用紫外光灭菌数天。我们使用配备有正常功能紫外灯的BSL2级生物安全柜完成灭菌过程。在初始灭菌步骤中，按照说明使用了已灭菌的工具和70%乙醇。在构建阶段，经过多次尝试后可形成均匀一致的硅胶粘合珠，从而提高实验的可重复性。练习该技术并额外准备一些插入式组件堆叠可能有助于操作。在翻转插入组件后去除气泡时，我们发现15G灌胃针是最有效的工具，并已确定其用于此目的的最佳形状。在第二次接种细胞前，必须提前准备并灭菌该针具。
每种细胞类型在合并到共培养系统之前，都必须在独立的培养环境中进行培养 。为了维持单层结肠上皮细胞的生长，必须考虑每种细胞类型的初始接种密度、总体培养时间，以及对细菌.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。作者在此声明，在法律允许的最大范围内，对所有明示或暗示的保证概不负责。在任何情况下，作者均不承担因使用Flipwell构建工具、BSL试剂、细胞系、细菌培养物，或在厌氧箱的厌氧环境中使用Flipwell系统所引起或相关的特殊、偶然、间接、惩罚性、多重或继发性损害责任，无论该责任基于任何成文法、合同、侵权或其他法律理论。该责任限制包括但不限于本文未明确描述的任何Flipwell使用方式。
致谢
第一作者衷心感谢富田纱织博士在远距离情况下仍提供的卓越指导能力、持续的指导与支持，以及娴熟且持续的项目设计，这些为出色的学习机会创造了条件。作者们还感谢Sharma博士在微生物学方面的专业知识与指导，感谢Veani R. Fernando博士在THP-1巨噬细胞制备方面的贡献，同时感谢Gebremichal Gebretsadik Weidengus和Islam博士在拍摄前协助准备所需的培养基、细胞及细菌培养物。
作者还感谢大都会医疗中心/癌症生物学部在拍摄过程中提供的热情接待和支持。主要作者感谢密歇根大学的Erin Janssen博士、Eliza Tsou博士以及Caroline Foster为本项目提供的支持，包括备用物资和拍摄期间使用的XL号实验服。
此外，作者感谢托莱多大学电子显微镜中心的 Andrew Kleinhenz 博士和 William T. Gunning 博士，以及仪器中心的 Cassandra Zamora 和 Kristin Kirschbaum 在电镜成像方面的建设性建议。本研究得到了托莱多大学健康科学校区医学院与生命科学学院癌症生物学系为 S.F. 提供的启动资金；俄亥俄州癌症研究资助（项目编号：5017）支持 S.F.；医学研究学会（托莱多基金会，编号：206298）奖项支持 S.F.；美国癌症学会研究学者资助（RSG-18-238-01-CSM）支持 S.F.；以及美国国家癌症研究所研究....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.4% PFA（参见试剂与溶液部分的配方） | 文中已描述 | ||
| 10 ml 血清移液管 | Corning | 4488 | |
| 12 孔组织培养板， Costar | Corning | 3513 | |
| 15 ml 锥形管，SpectraTube | Alkali Scientific | C2715 | |
| 200 µl 吸头 | USA Scientific | 1111-1700 | |
| 24 孔插件 — 24 孔板用培养插件，PET 0.4 µm | BrandTech Scientific | 782710 | |
| 3D Flipwells 预制，UV 灭菌 | 实验室自制 | ||
| 4% PFA（参见试剂与溶液部分的配方） | 文中已描述 | ||
| 50 mM Sepiapterin 储存液（SEP，参见试剂与溶液部分的配方） | Career Henan Chemical Co | CAS#: 17094-01-8 | |
| 50 ml 锥形管 | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5 ml 血清移液管 | Corning | 4487 | |
| 70–95% 乙醇（乙基酒精） | Decon Labs | 04-355-151 | |
| 铝箔 | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| 动物饲喂针头，20 号，1.5” 长度，一次性使用 | Fisher Scientific | 01-208-87 | |
| 抗体稀释缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方） | 文中已描述 | ||
| Attofluor 细胞培养腔室 | ThermoFisher Scientific | A7816 | |
| 高压灭菌指示胶带 | Fisher Scientific | 15-901-111 | |
| 枯草芽孢杆菌野生型（3A1T）菌株，甘油保存菌种（） | Bacillus Genetic Stock Center（https:// bgsc. org/ | ||
| 粉红色无粉腈类手套，不含乳胶，BioGrip | Top Quality Manufacturing | P2810 | |
| 封闭缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方 — 含 10% 正常山羊血清的 PBS） | 文中已描述 | ||
| 封闭缓冲液（参见试剂与溶液部分的配方） | 文中已描述 | ||
| 明场显微镜（Nikon 或同等型号）Eclipse Ts2 | Nikon | TS2 | |
| Caco-2 细胞 | ATCC | HTB-37 | |
| 细胞培养箱，37°C，5% CO2（Eppendorf CellXpert） | Eppendorf | 6734010015 | |
| 离心机（Eppendorf，Centrifuge 5804/5804 R 或同等型号） | Eppendorf | 22622501 | |
| 50 ml 离心管，SpectraTube | Alkali Scientific | C2750 | |
| 12 孔板用培养插件，PET，0.4 µm，无菌 | BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT | 782730 | |
| DAPI VectaShield 封片剂 | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 深型培养皿底部，100 × 25 mm，深型可堆叠聚苯乙烯培养皿，无菌 | USA Scientific | 8609-0625 | |
| Drummond Pipet Aid XP | Drummond | 4-000-101 | |
| Eppendorf 5804 离心机，配备适用于 50 ml 锥形管的摆动转子 | Eppendorf | 22622501 | |
| 镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2 套 | VWR | 82027-438 | |
| 镊子，不锈钢，无菌高压灭菌，2 套，标本镊 | VWR | 82027-438 | |
| 500 ml 玻璃烧瓶 | Corning | 4980-500 | |
| 血细胞计数板（带盖玻片的 Neubauer 型） | Thermo Fisher Scientific | 50-312-90 | |
| HT-29-MTX-E12 细胞 | Millipore Sigma | 12040401 | |
| ImmunoPen（可选） | Fisher Scientific | 4021761EA | |
| 凯夫拉材质或其他抗切割手套（可选） | 五金店或 Amazon | ||
| 实验室胶带或封箱胶带 | Fisher Scientific | 159015R | |
| 层流罩 1300 系列 A2 BSC II 级 | ThermoFisher Scientific | 1375 | |
| 带紫外灭菌功能的层流罩 SterilGARD | The Baker Company | SG403A-HE | |
| 耐溶剂记号笔 | VWR | 52877-310 或 95042-566 | |
| Caco-2 细胞培养基（基于高糖 DMEM，参见试剂与溶液部分的配方） | 参见 文中描述 | ||
| HT-29 细胞培养基（高糖 DMEM，参见试剂与溶液部分的配方） | 文中已描述 | ||
| THP-1 细胞培养基（RPMI，参见试剂与溶液部分的配方） | 文中已描述 | ||
| 微量离心管，1.7 ml，无菌 | Alkali Scientific | C3017-ST | |
| 微量离心管 | Thermo Fisher | 3451 | |
| Miller LB 培养基（参见试剂与溶液部分的配方） | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| 尖嘴钳，2 套 | 五金店或 Amazon | ||
| 无粉无乳胶腈类手套 Aurelia Amazing | MidSci | 92885 | |
| 培养皿盖，无菌 Falcon 培养皿，100×15 mm 型 | Corning Inc | 351029 | |
| 佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）（100 ng/μl，参见试剂与溶液部分的配方） | InvivoGen | Tlrl-pma | |
| 移液吸头（10 µl、200 µl、1000 µl），PurePoint 或同等产品 | Alkali Scientific | ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS | |
| 塑料保鲜膜 | 超市 | ||
| Purecol 工作用胶原酶溶液（100 µg/mL） | Advanced BioMatrix | 5005-100ML | |
| 圆形盖玻片 #1 1 oz（Corning 浮法玻璃或 Fisherbrand） | Corning 或 Fisherbrand | 50143822 或 12-546-2 25CIR-2 | |
| 手术刀片，无菌，一次性 | Mopec 或 Feather #10 | AJ136 或 2975#10 | |
| Sepiapterin（SEP，100 µM，参见试剂与溶液部分的配方） | Career Henan Chemical Co | CAS#: 17094-01-8 | |
| 摇床培养箱，设定为 220 rpm，37°C | Eppendorf New Brunswick Scientific | M12990080 | |
| 硅酮粘合剂 Loctite Clear Silicone IDH 或 3M 船用级透明硅酮密封胶，带尖嘴 | Loctite 或 3M | 1745658 或 PN08019 | |
| 单通道移液器 Eppendorf Research Plus，200 µl | Eppendorf | ||
| 单通道移液器（10 µl、200 µl、1000 µl） | Eppendorf | 2231001122 | |
| 分光光度计 NanoDropOneC | Thermo Fisher Scientific | 13-400-519 | |
| 无菌去离子水 | |||
| 无钙镁磷酸盐缓冲液（PBS），无菌 | Fisher Scientific | BSS-PBS-1X6 | |
| 3 ml 或 5 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器 | BD | 309585 或 309603 | |
| THP-1 细胞 | ATCC | TIB-202 | |
| 移液管，无菌 | Fisherbrand | 13-711-20 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | X100 | |
| 台盼蓝溶液 | VWR | 97063-702 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| 擦拭纸 Kimwipes Professional，带防静电 LintGuard Polyshield | Kimberly-Clark | 34120 | |
| 一抗： | |||
| 抗人 CD163 | Abcam | 156769 | |
| 抗人 CD68 | Novus Biologicals | NB100-683-0.1 mg | |
| 抗人 CD80，E3Q9V | Cell Signaling Technologies | 15416 | |
| 抗人 CK20 | Life Technologies | PA5-82875 | |
| 抗人 MUC2（996/1） | ThermoFisher | MA5-12345 | |
| 二抗： | |||
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（用于 CD80 和 CK20） | ThermoFisher | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG（用于 MUC2、CD68 或 CD163） | ThermoFisher | A11005 | |
| 试剂与溶液： | |||
| Caco-2 培养基： | |||
| 含高糖（4.5 g/L）和 1%（v:v）GlutaMax 的 DMEM | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10%（v:v）热灭活胎牛血清（FBS） | Sigma | F2242-500ML | |
| 非必需氨基酸（1%），用于 Caco-2 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11140076 | |
| 青霉素-链霉素（1% v:v） | Sigma | F2242-500ML | |
| HT-29-MTX 培养基 | |||
| 含高糖（4.5 g/L）和 1%（v:v）GlutaMax 的 DMEM | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10%（v:v）热灭活胎牛血清（FBS） | Sigma | F2242-500ML | |
| HEPES（终浓度 10 mM） | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 青霉素-链霉素（1% v:v） | Sigma | F2242-500ML | |
| THP-1 培养基： | |||
| 热灭活胎牛血清（FBS）（10% v:v） | Sigma | F2242-500ML | |
| 葡萄糖（终浓度 4.5 g/L） | Thermo Fisher Scientific | A249001 | |
| GlutaMax 1%（v:v） （终浓度 2 mM） | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES（终浓度 10 mM） | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 青霉素-链霉素（1% v:v） | Sigma | F2242-500ML | |
| Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| 丙酮酸钠（终浓度 1 mM） | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Purecol 工作用胶原酶溶液（稀释至 1:30，100 µg/ml）： | |||
| Purecol 3 mg/ml 稀释至 1:30，得 100 µg/ml | Advanced BioMatrix | 5005-100ML | |
| 无菌去离子水 | |||
| L-Sepiapterin 储存液（50 mM）： | |||
| L-Sepiapterin（SEP） | Career Henan Chemical Co | CAS#: 17094-01-8 | |
| 佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯储存液（PMA，5 mg/mL） | InvivoGen | Tlrl-pma | |
| 1% BSA（牛血清白蛋白） | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Miller LB | Sigma-Aldrich | L3522 | |
| 与二抗同源的正常血清 | Sigma | NS02L-1ML | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 441244 |
参考文献
- Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
- Xuan, C., et al.
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