基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26 6号染色体上的位点
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
创建基因敲除小鼠的方法通常包括三个主要步骤：（1）从供体雌性小鼠收集胚胎，（2）将遗传构建体显微注射至受精卵中 离体，以及（3）将它们手术移植到假孕雌性小鼠的输卵管中。该过程需要使用大量的实验动物，因为它不仅涉及供体雌性小鼠，还需要使用结扎输精管的雄性小鼠和假孕雌性小鼠。此外，对小鼠受精卵的细胞质或原核进行显微注射时，常面临针头堵塞、由于细胞膜弹性过高导致通透性困难，以及胚胎潜在死亡等挑战。先进电穿孔仪（如Nepa21）的发展为通过一种称为“改良基因组编辑”（Improved Genome Editing）的方法，在单一步骤中直接获得靶向基因敲除小鼠提供了独特的机会。 通过 输卵管核酸递送技术（I-GONAD）。该技术包括在受孕后0.7天将CRISPR-Cas组分（Cas9蛋白和引导RNA）显微注射至妊娠雌性动物的输卵管内，随后进行 体内 通过电穿孔将这些组分直接递送至受精卵中。按照I-GONAD操作流程，怀孕小鼠将产下携带目标基因敲除的仔鼠。本文提供了一套在小鼠中实施I-GONAD方法的详细分步实验方案，为传统基因敲除小鼠制备技术提供一种更高效且易于操作的替代方案。
引言
了解疾病的遗传基础对于揭示其病因和发病机制的分子过程至关重要。该研究的关键步骤是建立具有靶向基因敲除的动物模型，以模拟人类疾病。由于小鼠在基因组上与人类具有较高的相似性，且体型小、寿命短、繁殖力强，因此在这些研究中尤为有价值。小鼠模型在基础研究和临床前测试中均具有重要意义1。
利用CRISPR-Cas9系统构建基因敲除小鼠时，研究人员通常将向导RNA与Cas9核酸酶的复合物注射到受精卵中，从而在目标DNA序列上造成双链断裂，激活细胞的修复系统，进而在断裂位点引入突变1,2。显微注射至受精卵目前仍是该技术的金标准。然而，该方法包含多个步骤：从供体雌鼠中分离胚胎，对受精卵进行遗传构建体的显微注射，并通过手术将胚胎移植至假孕雌鼠的输卵管中。因此，需要维持大量动物，包括供体雌鼠、结扎雄鼠和假孕雌鼠。此外，受精卵的分离过程需要处死供体雌鼠。因此，遵循3R原则（替代、减少、优化）3，应优先采用可减少动物使用量的实验方案。
电穿孔技术的进步，例如使用Nepa21系统，为通过一种称为“经输卵管核酸递送的改进基因组编辑”（Improved Genome editing via Oviductal Nucleic....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均经圣彼得堡国立大学动物研究伦理委员会批准（批准号：131-03-5，2022年10月11日）。所有实验操作严格遵循《实验动物护理与使用指南》中规定的指导原则。实验所用常见的CD1远交系小鼠购自俄罗斯科学院生理活性化合物研究所集体使用中心（IPAC RAS）。用于交配的雌性CD1小鼠年龄为2-3个月（平均体重27-30 g），与年龄为2.5-4个月的雄性CD1小鼠（平均体重35-37 g）进行配对。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 单导向RNA（sgRNA）的设计及其转染前准备
- 使用 CHOPCHOP、SYNTHEGO Knockout Guide Design 或 CRISPOR 等计算分析工具，识别靶向目标基因的潜在 sgRNA 序列。
注意：该软件可在整个基因范围内识别潜在的 sgRNA 序列，并在输出中提供多个变体选项。这些工具将推荐最优的 sgRNA 选项，并允许用户根据需要在所有已识别的变体中进行选择。在进行选择时，请考虑以下标准：- 外显子邻近性：选择位于尽可能靠近目标突变位点的外显子中的序列。为获得更佳结果，应考虑可变剪接异构体，选择存在于最多异构体中的靶序列。可借助基因组浏览器（如 Ensembl）进行准确的外显子选择。
- 脱靶效应考量：利用工具的评分系统分析潜在的脱靶效应，优先选择预测脱....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
如果电穿孔成功，实验小鼠将：（1）产下少量仔鼠，（2）部分个体基因组中出现不同的插入缺失（indels）。若基因分型引物设计合理且PCR程序优化得当，琼脂糖凝胶上将出现一条清晰、大小符合预期的PCR扩增条带。若核酸酶成功切割靶标DNA，则获得的动物很可能为嵌合体，并在基因组中携带多种类型的插入缺失。可使用计算工具（如EditCo ICE Analysis或TIDE）来确定基因组中确切的插入缺失类型。该分析所需的输入信息包括：sgRNA间隔序列、野生型对照小鼠PCR产物序列的色谱图文件，以及实验组小鼠PCR产物序列的色谱图文件。分析结果将生成一个图示，展示插入缺失变异的分布情况、对照组与实验组探针之间的差异程度，以及（若使用EditCo ICE Analysis）切割位点附近的序列比对结果（图2）。分析结果可能显示单个F0代小鼠体内存在多个突变等位基因。对于每个等位基因，程序将提供以下参数：插入缺失百分比、模型拟合度及基因敲除评分。
总的插入缺失百分比表示编辑效率，而每个单独等位基因的插入缺失百分比则反映该特定编辑结果出现的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
使用I-GONAD方法制备基因敲除小鼠的效率与传统的显微注射技术相当。然而，传统方法需要从供体雌鼠中分离受精卵，进行显微注射，并将胚胎移植到假孕雌鼠的输卵管中。相比之下，I-GONAD方法通过将基因编辑组分直接递送至妊娠雌鼠的输卵管内，简化了该流程，从而无需进行受精卵的分离和胚胎移植。本方案通过利用CRISPR/Cas9技术在小鼠6号染色体上的ROSA26位点成功引入突变，展示了I-GONAD方法的有效性。通过对该技术的优化，I-GONAD操作中最关键的步骤包括：在电穿孔过程中设置合适的电阻和电压参数，以及确保在注射遗传构建物时无空气进入输卵管。
电阻值应约为 350-400 Ω，对应的电压为 100-200 mA，以确保细胞存活率与转染效率之间的最佳平衡。必须避免电阻降低，因为这可能导致电压超过 250 mA，从而引起受精卵死亡。
使用浸湿的滤纸（浸泡于杜氏改良磷酸盐缓冲液（DPBS）中）来夹取输卵管，这一步骤在其他方案中常有描述8,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢圣彼得堡大学研究园分子与细胞技术中心。测序工作在圣彼得堡国立大学科学园分子与细胞技术资源中心使用 ABI 3500 xL 遗传分析仪（Thermo Fisher Scientific，美国）完成。作者感谢 Maria Rubel 在文件编辑和提交过程中提供的帮助。本研究由圣彼得堡国立大学科研项目（项目编号：129658320）资助，Luibov Shkodenko 得到俄罗斯科学基金会（项目编号 25-26-00247）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5–5 µL 移液器 | Thermo Scientific | 4642020 | |
| 1.5 mL 离心管 | Aptaca | 1003/G | |
| 100-1000 µL 移液器 | Thermo Scientific | 4642090 | |
| 200 µL 管 | Axygen | PCR-02-C | |
| 20-200 µL 移液器 | Thermo Scientific | 4642080 | |
| 2-20 µL 移液器 | Thermo Scientific | 4642060 | |
| 4× 凝胶上样染料 | Biolabmix | D-3002 | |
| 琼脂糖 | AppliChem | A8963,0500 | |
| DNase I，无 RNase（1 U/μL） | Thermo Fisher | EN0521 | |
| dNTP 混合物，100 mM 溶液 | Thermo Scientific | R0181 | |
| DreamTaq Green DNA 聚合酶（5 U/μL） | Thermo Scientific | EP0713 | |
| Dulbecco’s 改良磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | D8537 | |
| EditCo ICE 分析 | https://ice.editco.bio/#/ | 2025年6月4日访问 | |
| EDTA 0.5 M 溶液，pH = 8 | AppliChem | A4892,0500 | |
| Ensembl | https://www.ensembl.org/index.html | 2025年6月9日访问 | |
| 溴化乙锭 | Biolabmix | EtBr-10 | |
| 眼用凝胶滴剂 “Oftagel” | URSAPHARM | 204604 | |
| 凝胶成像系统 ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| 计算机模拟 PCR V39x1 | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr | 2025年6月9日访问 | |
| Integrated DNA Technologies | https://eu.idtdna.com | 2025年6月9日访问 | |
| 显微外科剪刀 | Medin URAL | M124 | |
| NEPA21 电穿孔仪 | Nepa Gene | NEPA21 | 配备 CUY652P2.5X4 电极 |
| NTP 混合物，100 mM 溶液 | Thermo Scientific | R0481 | |
| 寡核苷酸 | Evrogen | 直接订购，标准脱盐纯化 | |
| Opti-MEM I 低血清培养基 | Thermo Fisher | 31985070 | |
| PerlPrimer | https://perlprimer.sourceforge.net | 版本 1.1.21。 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶（2 U/μL） | Thermo Scientific | F530L | |
| 10 µL 移液器吸头 | Ulplast | HT-10-960 | |
| 1000 µL 移液器吸头 | Ulplast | HT-1000-576 | |
| 200 µL 移液器吸头 | Ulplast | HT-200-960 | |
| 电源 “Elf-4” | DNA-technology | PS-400 NEW | |
| 无 RNase/DNase 水 | Invitrogen | 10977049 | |
| 生理盐水溶液 | PanEco | P011n | |
| SE-1 水平电泳系统 | Helicon | SE-1 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881-500G | |
| Step100 DNA Marker | Biolabmix | S-8100 | |
| 体视显微镜 SMZ1000 | Nikon | 5-363376 | |
| 移液器吸头剥离器 | CooperSurgical | MXL3-STR | |
| 剥离吸头 | ORIGIO | MXL3-125 | |
| 手术针 | KMIZ | 4A1- 0.6×20 | |
| 持针钳 | Medin URAL | M302.2 | |
| 持针钳 | Medin URAL | M303 | |
缝合线 POLYCON N 0 | Tonzos 95 | 234 | |
| SYNTHEGO 基因敲除向导设计 | https://design.synthego.com/#/ | 2025年6月9日访问 | |
| T100 扩增仪 | BioRad | 10014822 | |
| T7 RNA 聚合酶 | Thermo Scientific | EP0111 | |
| TBE 10× 缓冲液 | Biolabmix | TBE-500 | |
| Tide | https://tide.nki.nl/ | 2025年6月4日访问 | |
| Tris 盐酸盐 | Suzhou Yacoo Science | SYS-S0005-0.5 | |
| Trizma 盐酸盐溶液 | Sigma Aldrich | T2663 | |
| TRIzol 试剂 | Invitrogen | 15596026 | |
| TrueCut Cas9 蛋白 | Invitrogen | A36499 | |
| 通用剪刀 | Medin URAL | M147 | |
| 赛拉嗪 | Interchemie Werken de Adelaar | IX2 | |
| Zoletil | Virbac Lab | 2000443714739.00 |
参考文献
- Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
- Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRI....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
