使用免费计算工具分析基于质谱的蛋白质组学数据

摘要

基于质谱的蛋白质组学数据可从开放数据库中获取，并可通过免费工具进行访问。鉴于数据库搜索和描述的复杂性，许多生物学家缺乏利用这些数据集的知识。本文提供了一份使用免费工具进行基本蛋白质组学数据搜索的指南。

摘要

基于质谱（MS）的蛋白质组学数据，包括依赖数据采集（DDA）和非依赖数据采集（DIA），在生物研究中被广泛应用。然而，由于缺乏关于如何有效搜索和分析蛋白质组学数据的清晰示范，这些数据集在验证研究中的应用仍然有限。为填补这一空白，我们从PRoteomics IDEntifications数据库（PRIDE）数据存储库中选取了一个DDA和一个DIA数据集，以更清晰地展示蛋白质组学数据分析流程以及蛋白质搜索结果的下游后处理过程。为演示目的，我们使用了两款免费的计算工具：FragPipe（v22.0）用于DDA数据集，DIA-NN（2.1.0）用于DIA数据集。使用R代码演示了后续处理步骤，例如生成火山图和差异表达蛋白质列表。本研究提供了搜索和分析蛋白质组学数据的基本操作流程，可作为有效处理蛋白质组数据集的入门必备指南。通过本工作，我们旨在为研究人员提供必要的知识，使其能够在生物学研究中充分利用蛋白质组学数据。

引言

蛋白质组学领域因开放获取数据存储库和免费软件工具的广泛应用而发生了革命性变化¹，这些资源在提升研究能力以及推动数据共享文化方面发挥了关键作用。诸如PRIDE²等集中式资源的建立，以及人类蛋白质组组织（HUPO）蛋白质组学标准倡议（PSI）制定的标准化数据格式³，为数据的重用与整合创造了前所未有的机遇。然而，蛋白质组学数据的分析与解读仍存在显著的技术障碍，尤其对于希望对其自身实验结果进行正交验证的生物学家和临床科研人员而言尤为如此⁴。本文通过提出一种不依赖仪器厂商的计算工作流程，直接应对这一挑战，为研究人员提供一个可及的框架，使其能够独立查询、分析并整合公共蛋白质组学数据与自身研究成果，从而在无需额外湿实验的情况下实现可靠的正交验证。本方法特别适用于希望对其自身实验中鉴定出的特定蛋白质差异表达进行正交验证，并通过探索其关注蛋白质在大量已发表研究中的表达模式来提出新假说的研究人员。通过提供逐步操作指南，我们旨在使更广泛的研究人员能够充分挖掘公共蛋白质组学数据的潜力，最终增强其研究的稳健性与影响力。

在基于质谱（MS）的蛋白质组学中，MS1和MS2扫描是数据采集的基础。MS1扫描（又称全扫描）用于检测和测量样品中所有离子的质荷比（m/z），从而提供离子群体的全面概览

方案

注意：工作流程概览见图1，所用软件的详细说明见材料表。

图1：研究设计概览。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 示例文件和软件设置

注意：所有应用程序均可免费用于个人研究用途，并可在个人计算机上运行（支持 Windows 和 Linux 系统）。

1. 为项目创建一个新目录。
2. 从....

结果

为了更好地说明蛋白质组学数据集的检索过程，我们为本次分析选取了两种类型的数据集。为展示临床背景下差异表达的蛋白质，我们使用“clinic”等关键词在PRIDE数据库中进行检索。具体而言，我们从临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC）²¹中选择了一个适用于DIA分析的数据集，以及从中国人类蛋白质组计划（Chinese Human Proteome Project, CNHPP）²²中选择了一个适用于DDA分析的数据集。这些数据集的选取有助于全面评估和展示该软件在分析健康与疾病相关蛋白质组数据方面的功能。

图中所示的火山图对正常个体与胰腺导管腺癌（PDAC）患者血清蛋白的差异表达，以及肝细胞癌（HCC）肿瘤样本与其配对组织之间的差异表达进行了全面分析（

讨论

本方案通过整合DIA-NN和FragPipe等免费工具，展示了蛋白质组学数据分析的方法。成功的关键在于若干重要步骤，例如在DIA-NN中生成谱图库时，需精确选择前体离子并设置质量精度（步骤2.3）²⁷，这些参数依赖于仪器类型，对实现完整的肽段鉴定至关重要。同样，在FragPipe中细致地设置数据库（步骤3.4），包括诱饵库的生成和污染物过滤，对于控制错误发现率（FDR）也极为关键。

修改和故障排除通常涉及验证软件依赖项（例如，MSFileReader 所需的 .NET，FragPipe 所需的 Java）以及管理计算资源，尤其是对于大型数据集，可能需要为 MSFragger 增加内存，或对 DIA-NN 使用高性能计算（HPC）。社区论坛（例如 GitHub）可提供有价值的、持续更新的故障排除支持。

主要局限性包括该方案仅适用于无标记的DIA和DDA工作流程，无法进行全面的翻译后修饰（PTM）分析²⁸或基于标记的定量分析，尽管MSF.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
.NET SDK v. 9.0.203	微软		https://dotnet.microsoft.com/zh-cn/download
DIA-NN v. 2.1.0			https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0
FragPipe v. 22.0			https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader 版本 3.1	赛默飞世尔科技		https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
R 4.5.0			https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563			https://posit.co/download/rstudio-desktop/