方法文章

优化和评估重组蜘蛛丝纤维生产的手拉和湿纺

DOI：

10.3791/68714

⸱

2025年7月29日

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1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, 2Department of Chemistry, Dalhousie University, 3School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所提出的方案提供了一套通用的方法来优化用于纺丝的重组丝蛋白的溶解;通过手绘测试可纺性;通过自动湿纺生产长而连续的纤维;并比较评估纤维或纤维内的形态、分子比对、机械行为和蛋白质二级结构含量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蜘蛛丝以其机械性能而闻名，具有标志性的高强度、高延展性或这些组合可带来高韧性。典型的雌性球形编织蜘蛛会产生七种不同类型的丝，每种丝通常由特定类型的蛋白质纺成，并针对独特的生存功能进行机械定制。重组蜘蛛丝生产为获得这些材料提供了一条有前途的途径，规避了获得大量天然丝的挑战，并在允许蛋白质定制方面提供了优势，例如，通过定点诱变或融合蛋白质构建。

在所提出的方案中，我们概述了一种通过手拉和湿纺方法评估蛋白质纺丝适用性的方法。从适当纯化的冻干蛋白粉开始，详细介绍了优化初始溶解蛋白状态以提供高浓度“旋转原液”状态的方法。接下来，比较了手工拉伸和湿纺方法，包括讨论使用旋转后拉伸作为纺纱过程的一部分来调节纤维行为的方法。然后详细介绍表征所得丝纤维并决定哪种纺丝条件最有可能取得成果的典型工作流程，包括光学显微镜评估纤维直径及其均匀性;偏振光显微镜以估计纤维内实现的（超）分子排列程度;拉伸测试以评估强度、延展性、杨氏模量和韧性;和傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱显微镜评估纤维内的蛋白质二级结构。

该协议已被证明适用于基于腺泡状（包裹）丝的重复和非重复结构域的几种不同的重组蜘蛛丝蛋白;梨状丝;融合蛋白包括腺泡状、梨状和/或主要壶腹（拖丝）丝。通过几个突出的步骤提供了更广泛的适用性，在这些步骤中，条件和参数可以改变以适应单个蛋白质的行为并实现功能结果的差异。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蜘蛛生产丝以执行各种特殊任务，包括网构建、捕获猎物和保护卵1。蜘蛛丝表现出优异的机械性能，超过大多数已知的天然和合成材料2，促使人们为生产用于各种工业和生物医学应用的工程和增强蜘蛛丝材料做出了大量努力。Spidroin 是形成蜘蛛丝的蛋白质，由一个相对较大的重复结构域组成，该结构域由非重复的 N 端和 C 端结构域3 包围，某些丝类型的独特机械性能与重复结构域内短基序的重复有关 4,5,6。与商业化栽培的桑蚕（Bombyx mori）不同，桑蚕以一致的茧形式生产大量适合收获的蚕丝，蜘蛛本质上是同类相食和领地生物，生产丝的数量有限，从而对农业生产和采集提出了挑战7.鉴于这些局限性，重组蜘蛛丝生产已被开发为一种更可行和可持续的替代方案，以可控地获得足够数量的蜘蛛丝以供应用。

重组蜘蛛丝的生产需要选择合适的宿主来表达蛋白质。蜘蛛丝已在多种宿主系统中表达，包括细菌 8,9、酵母菌10,11、昆虫细胞12、植物13,14 和哺乳动物细胞15,16，其中大肠杆菌是最常用的宿主系统。蜘蛛蛋白的高分子量可达700 kDa7，对全长构建体的表达提出了重大挑战。为了生产与天然蜘蛛丝具有相当或增强特性的重组蜘蛛丝，采用的主要策略是表达截短变体，例如具有有限数量重复单元（有或没有非重复结构域）的构建体，由不同丝类型组合组成的嵌合体，以及与非丝蛋白融合的杂交丝。例如，重组主要壶腹螺旋蛋白（284.9 kDa）在代谢工程的大肠杆菌中成功表达，所得丝表现出与天然主要壶腹丝相当的机械性能9。此外，由两个重复单元的梨状丝状丝状蛋白和两个重复单元的腺泡状丝状蛋白组成的工程丝纤维表现出优于组成梨状丝或腺泡状丝的优越延展性，与天然鞭毛状丝相当17。

重组蛋白生产还可以将功能性肽或蛋白质片段直接掺入丝蛋白中，从而能够制造具有针对特定应用量身定制的特性的生物材料。例如，RGD细胞结合基序与源自主要壶腹状蜘蛛蛋白的基因工程丝的遗传和化学融合导致了显着增强成纤维细胞粘附和增殖的薄膜18。在另一项研究中，一种由神经生长因子-β（NGF）结合基序融合到嵌合蛋白组成的杂交丝结构体，该嵌合蛋白包含腺泡状spidroin的两个重复单元和主要壶腹状spidroin的C端结构域，被证明支持神经元样细胞的生长和分化19。

鉴于重组丝蛋白的成功表达和纯化，然后可以将其加工成各种形式，例如水凝胶、薄膜、纤维、纳米颗粒、泡沫和海绵，具体取决于预期的应用20,21。为了实现人造丝纤维的生产，已经开发了模仿蜘蛛高度复杂和严格监管的天然纤维纺丝过程的某些方面的纺丝方法。在天然大壶腹丝中，蜘蛛蛋白由大壶腹腺中的上皮细胞产生，并以高浓度（高达50%（w/v））22以可溶状态储存在管腔内，形成水性纺丝原液。当纺丝原液通过纺丝管道时，它会经历管道变窄和纤维拉挤过程导致的pH值、离子浓度、含水量和剪切力的变化，从而诱导液态丝蛋白转化为固体纤维23,24。因此，确定一种合适的溶剂，可以在高浓度下溶解或悬浮重组丝蛋白以形成纺丝原液，是人工纤维纺丝过程中关键的第一步。

丝蛋白纺丝原液的配方已采用多种溶剂，溶剂的选择已被证明会影响纤维形成和机械性能25,26。因此，仔细考虑原液溶剂的选择对于优化所得纤维特性至关重要。纺丝涂料可以使用有机或水溶剂配制，例如1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）27，六氟丙酮（HFA）28，三氟乙酸（TFA）和2,2,2-三氟乙醇（TFE）26的混合物，甲酸29和磷酸钠/Tris缓冲液30。由于蛋白质溶解度通常受 pH 值、离子强度和浓度等因素的影响，因此确定合适的原液溶剂通常涉及对各种溶剂的系统评估、优化 pH 值和蛋白质浓度，以及在某些情况下，使用溶剂-水混合物来确定最佳的纺丝原液条件。此外，纺丝原液的粘度是在纺丝过程之前评估的一个重要参数，因为高粘度的原液溶液可能会阻碍纺丝过程中的流体流动，而粘度不足的原液通常不适合纤维形成31,32。应该注意的是，使用恶劣的自旋兴奋剂条件可能会在长时间暴露时改变蛋白质结构;因此，开发环保原液溶剂仍然是一个活跃的研究领域。

手拉和湿纺是重组丝纤维纺纱的两种常用方法。使用每种方法生产的纤维的机械性能高度依赖于纺丝条件本身和纺纱后加工。手拉，也称为拉丝，是一种简单的纤维生产方法，通常使用移液器吸头、镊子或镊子从纯化的蛋白质溶液中拉出纤维，然后进行风干和表征 33,34,35,36,37。虽然手绘提供了一种快速筛选各种丝纤维形成条件并通常对由此产生的纤维力学行为进行分类的极好方法，但该技术不容易扩展到长（即数米长度）的连续纤维。作为替代方案，我们采用湿法纺丝，将纺丝原液以恒定速度连续挤出到混凝浴中，混凝浴通常是由水和乙醇或甲醇的混合物组成的水性或有机溶剂 9,15,31,38,39,40 .将纺丝原液浸入凝固浴中会导致蛋白质快速脱溶剂化，从而形成连续纤维24。随后，纤维以恒定的速度从混凝浴中拉出，要么与挤出速率相匹配以提供纺后 （AS） 纤维，要么进行后纺后拉伸以提供通常具有改进机械性能的后纺 （PS） 纤维。纺丝后拉伸通常涉及在空气中、溶剂中或溶剂浸泡后将纤维拉伸至其原始长度的 2-8 倍的比例，每个参数都有助于特定的机械性能 15,17,31,38。

虽然该协议侧重于手绘和湿纺方法，但将这些方法置于上下文中很重要。据报道，来自水性和有机条件下的重组蜘蛛丝的静电纺丝方法能够生产纤维垫、排列纤维和纱线，纤维的直径通常为纳米尺度41。这提供了纳米级纤维的潜在优势，如果需要微米级纤维，则面临相应的挑战，通常需要进行后自旋处理以诱导向β片结构的转变，从而改善力学和水相容性。通过从有机溶剂中干旋，获得了宽度和厚度为微米级的多米重组蜘蛛丝带42，最近证明在旋转掺杂阶段掺入金属离子可改善力学43。基于微流体的纺丝44，包括最近将3D打印技术与微针喷丝头相结合，旨在模仿天然喷丝头45，适用于高度可控的重组丝纤维纺丝。尽管有多种方法被报道适用于丝（或类丝）纤维生产，但本协议详细介绍了通过手拉和湿纺生产重组丝纤维，因为这些方法已被证明可以转化为我们手中的几种不同的重组丝变体，并为生物材料开发和比较评估提供了一个易于处理的起点。

在纤维纺丝和收集之后，通常使用光学、机械和光谱技术的组合来表征纺丝后的特性。每种方法都提供了对纤维形成过程及其与材料性能相关性的关键见解。在这里，我们重点关注这些方法的一个子集，并指出还有许多其他方法提供了有关丝纤维特性和性能的关键信息。光学显微镜用于评估纤维形态，允许比较在相同和不同条件下纺制的纤维的直径17,31,38,46。该技术对于在后续表征之前识别和消除具有缺陷或异常的光纤段也很重要。此外，偏振光学显微镜可用于评估纤维内的分子比对程度，因为较高水平的比对通常与增强的机械性能相关17,26,47。机械表征是通过拉伸测试进行的，其中测量应力-应变曲线并用于量化拉伸强度、延展性、杨氏模量和韧性等参数，为评估纤维在结构或生物医学应用中的适用性提供基本信息 17,33,48.这里介绍的最后一种技术，傅里叶变换红外（FTIR）光谱显微镜，用于研究蛋白质二级结构，特别是β片形成的程度，因为这在纤维稳定性和机械强度中起着至关重要的作用17,46,49。这些技术共同提供了对重组生产的丝纤维的形态、结构和机械行为的全面了解。

方案

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在本协议中，我们假设起点是冻干蚕丝蛋白粉。在我们的工作中，这通常是重组蜘蛛丝蛋白。 图1提供了该方案的概述，下面详细介绍了以下五个步骤中的每一个：（1）旋转原液制备和优化;（2）丝纤维手拉或湿纺;（3）光学显微镜纤维直径和形态学评价;（4）拉伸试验力学评价;（5）通过FTIR光谱显微镜评估二级结构。

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图 1：重组蜘蛛丝蛋白纤维生产、收集和表征方案中关键步骤的示意图概述。请点击此处查看此图的大图。

1. 纺丝原液制备和优化

注意：为了优化纤维纺丝掺杂液，尝试将不同浓度的重组蜘蛛丝蛋白溶解在不同的溶剂中以制备掺杂溶液（表1）。只有溶解蛋白质的溶剂，提供无沉淀和透明的原液溶液，才应用于纤维纺丝的尝试。

  1. 溶剂的制备
    1. 要制备 8：1：1 TFA/TFE/H2O，请在通风橱内的玻璃管中测量 800 μL TFA、100 μL TFE 和 100 μL 1 型超纯水。彻底混合所有成分。盖上玻璃管并用封口膜覆盖，以防止挥发性成分蒸发。
      注意：始终为纤维纺丝准备新鲜的溶液。
      注意：小心处理 TFA 和 TFE，TFA 具有很强的腐蚀性和挥发性，而 TFE 是易燃和有毒的。穿戴适当的个人防护装备，包括手套、实验室外套和安全护目镜，以防止接触皮肤和吸入的机会。
    2. 要制备 3：1：1 TFA/TFE/H2O，请在通风橱内将 300 μL TFA、100 μL TFE 和 100 μL 1 型超纯水转移到玻璃管中并混合组分。盖上玻璃管并用封口膜覆盖，以尽量减少挥发性成分的蒸发。
      注意：始终为纤维纺丝准备新鲜的溶液。
    3. 要制备 7：3 HFIP/H2O，请将 700 μL 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇 （HFIP） 与 300 μL 1 型超纯水混合，制成 1 mL 溶液。需要时新鲜制备溶液。
      注意： 在通风橱内处理 HFIP，避免吸入或皮肤接触。
    4. 要制备 50 mM 磷酸钾缓冲液 （pH 7.5），在烧杯中取 800 mL 去离子水并溶解 1.199 g 磷酸二氢钾 （KH2PO4- MW.136. 09 g/mol）和 7.173 g 磷酸氢二钾 （K2HPO4- MW. 174.18 g/mol）。彻底混合所有组分，并使用 NaOH 或 HCl 调节溶液的 pH 值。用去离子水将体积加满至 1 L，并在室温下储存。
    5. 要制备 10 mM Tris-Cl 缓冲液 （pH 8.0），请将 1.21 g Tris-盐酸盐 （MW. 157.60 g/mol） 溶解在 800 mL 去离子水中。使用NaOH调节pH值，并用去离子水将最终体积加满至1 L。将溶液储存在室温下。
    6. 要制备 20 mM 乙酸钠缓冲液 （pH 5.0），请在 450 mL 去离子水中溶解 0.55 g 乙酸钠 （MW. 82.03 g/mol） 和 0.02 M （6 mL） 乙酸。用去离子水将体积加满至500mL，并在室温下储存。
    7. 要制备 1 M 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液 （pH 7.0），请将 11.69 g 磷酸氢二钠 （Na2HPO4- MW. 141.96 g/mol） 和 1.85 g 柠檬酸 （MW. 192.12 g/mol） 溶解在 400 mL 去离子水中。使用 HCl 或 NaOH 调节溶液的 pH 值，并使用去离子水将最终体积调节至 500 mL。
    8. 要制备 98% 甲酸-CaCl2 溶液，请将 98 mL 甲酸与 2 mL 去离子水混合，总共 100 mL 溶液，将甲酸稀释至 98%。现在，将 4 g CaCl2 加入 100 mL 98% 甲酸溶液中，制备 4% w/v 甲酸-CaCl2 溶液。将溶液储存在室温下。
      注意：参见 表 1。只有溶解蛋白质的溶剂，提供无沉淀和透明的原液溶液，才应用于纤维纺丝的尝试。
  2. 纤维纺丝原液的制备
    1. 根据所需浓度称量冻干蜘蛛丝蛋白（例如，100 μL 溶剂中的 10% （w/v） 溶液为 10 mg），并与适当体积的溶剂（例如，10% （w/v） 浓度为 100 μL）混合）。
    2. 涡旋混合物，直到蛋白粉完全溶解在溶剂中。
    3. 由于蜘蛛丝蛋白的溶解度因溶剂和蛋白质类型而异，因此从低蛋白质浓度 （10% w/v） 开始，然后根据需要逐渐增加浓度 （25-30% w/v）。
    4. 蛋白质完全溶解后，定性评估原液的粘度。如果原液看起来粘度不够，逐渐增加蛋白质浓度，直到获得透明、粘稠的溶液。以水为参考标准。
溶剂蛋白质浓度 （% - w/v）参考
8：1：1 TFA/TFE/H2O10 – 2519
3：1：1 TFA/TFE/H2O10 – 3026
7：3 HFIP/H2O15 – 3031
50 mM 磷酸钾缓冲液 （pH 7.5）10 – 2550
10 mM Tris-Cl 缓冲液 （pH 8.0）10 – 2034
20 mM 乙酸钠缓冲液 （pH 5.0）10 – 2549
1 M 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液 （pH 7.0）10 – 2551
98% 甲酸 – CaCl220 – 2552

表1： 用于制备纤维纺丝原料药的推荐溶剂和蛋白质浓度。

2. 纤维纺纱和收集

注意：有关手绘示意图的示意图，请参阅图 3 了解下面详述的各种湿纺设备配置。

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图 2：蜘蛛丝纤维的手绘。（A） 准备一个C形纸框，用左边的透明胶带和右边的双面胶带贴在载玻片上，以便从左到右拉纤维。 （B） 将一滴旋转的原液滴在透明胶带上，并使用塑料移液器吸头将单根纤维手工绘制到C形框架开口的双面胶带上。 （C） 使用左右两侧的胶带将纤维固定在载玻片上的纸框上。 （D，E） 演示了有效溶解在自旋涂料中的重组蜘蛛丝的代表性 （D） 手绘工艺，以及 （E） 在用胶带固定之前产生的纤维。 请点击此处查看此图的大图。

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图 3：蜘蛛丝纤维的湿纺 。在所有情况下，将旋转的原液放入玻璃气密注射器中，并使用注射泵通过金属钝头针头（即喷丝头）以恒定速率挤出到凝固浴（例如，95%乙醇）中。（A） 纺丝纤维被收集到辊子 1 上，在计算机控制下以与挤出速率相匹配的速度旋转。（B）空气中的纺后拉伸是通过引导纤维穿过滚筒1并将它们收集在滚筒2上来完成的，滚筒2以辊筒1速度的倍数旋转（例如，2倍拉伸比的速度是两倍）。类似地，纤维可以（C）在溶剂浸泡（例如，40%乙醇、水等，适用于给定的丝绸）后，通过将纤维从辊1引导到辊3（浸入溶剂浴中并以与辊1相同的速率旋转），然后将它们引导到辊2上（以辊1和3速度的倍数旋转）;或 （D） 通过将纤维从辊 1 引导到辊 3（浸入溶剂浴中并以与辊 1 相同的速率旋转），然后引导到辊子 4（也浸入溶剂中并以辊子 1 和 3 速度的倍数旋转），然后收集在辊子 2 上（与辊子 4 的速度相匹配）。模块化配置意味着可以轻松测试纤维纺丝条件下的各种排列，当然不限于此处示意图所示的四种排列。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 手绘
    1. 准备一个带有 1 厘米 x 0.5 厘米（长 x 宽）窗口的 C 形纸框，并将其放在载玻片上（图 2）。使用胶带将纸框的上部固定到载玻片上。将透明胶带粘贴在纸框的一只臂上，形成用于原液沉积的疏水表面，并将双面胶带贴在另一臂上以进行纤维固定。
    2. 在室温（22 ± 2 °C）下将 10-20 μL 旋转原液沉积到透明胶带上。
    3. 将 200 μL 塑料移液器吸头浸入原液液滴中，并以一致的速度 （~6 mm/s） 将其垂直从溶液中抽出，从而使纤维从溶液中拉出。
    4. 将手拉的光纤引导过框架窗口并将其贴在双面胶带上。在室温下风干纤维，然后用额外的胶带固定纤维的两端。
    5. 重点关注纤维横跨纸框的部分，以便进行后续表征。
  2. 湿纺
    1. 构建一个湿纺设备，此处详述的设备相对于早期迭代31,38具有增强的电机控制能力。
      1. 制造一个垂直固定的刚性金属安装板，并以适当的配置进行加工以连接一组步进电机（见 图 3）。每个电机安装都需要钻孔，以便在安装板后部牢固地螺栓连接步进电机（即四个适当间隔和尺寸的孔），并需要钻第五个孔以允许电机轴通过。
      2. 选择步长为 1.8°、保持扭矩为 45 N∙cm、长 24 mm、直径为 5 mm 的轴、15 mm 长“D”形切口、39 mm 主体、1.50 A 额定电流、2.3 相阻的双极步进电机。
      3. 开发一个系统来控制每个电机的速度和旋转方向，例如以前用于各种丝纤维类型17,53,54的系统，该系统采用用Python编码的图形用户界面（GUI），用于连接到多个步进电机控制器的Raspberry Pi，详见 https://github.com/raineylab/MotorController.git。
      4. 对于纺丝，将每个用于给定纺纱配置的电机连接到机加工的金属圆柱体上（直径 6 厘米，长度 8 厘米， 对于图 3 中位置 1 和 2 的位置的电机，两端直径为 9 厘米的凹槽辊在辊中心逐渐变细至直径为 6 厘米， 图 3 中位置 3 和 4 的长度为 7 厘米;例如，有关示例配置，请参阅 图 4 ）。
      5. 对于喷丝头（图3），使用一个0.25 mL玻璃注射器，该注射器带有一个永久连接的金属针头，该金属针头具有钝端（内径0.127 mm），安装在注射泵中，以受控的速率将旋转涂料挤出到凝固浴中。
    2. 将原液在室温下以20,000-21,000 g 离心30分钟×收集上清液进行纤维纺丝。
      注意： 去除残留的颗粒，以防止在湿纺过程中挤出针堵塞。
    3. 将 50-80 μL 旋转的原液加载到用作喷丝头的注射器中。
    4. 将注射器固定在注射泵中，并将挤出速度设置为 600 μL/h 的速率。
      注意：调整和优化挤出速率，以便在给定的蛋白质纺丝掺杂条件下形成纤维。
    5. 准备凝固浴（95%乙醇/5%去离子水，v / v）。
    6. 定位注射泵，使装有原液的注射器的针头浸入凝固浴中。
    7. 将滚筒连接到纺纱设备上，使用电机控制软件调整滚筒速度，并打开给定纺纱配置所需的电机。
      注意： 将滚筒 1 的旋转速率与挤出速率相匹配。400 μL/h 或 600 μL/h 的挤出速率对应于辊 1 的 6 rpm 或 9 rpm。如果要进行旋转后抽吸，则必须将一个或多个滚轮 2-4 设置为相应地旋转得更快。
    8. 启动注射泵并使用镊子以以下方式之一引导在凝固浴中形成的纤维。
      1. 要收集 AS 纤维，请将凝固浴中形成的纤维引导到第一个辊子上（速度等于挤出速率）进行收集。
      2. 要在空气中进行旋转后拉伸，请将滚轮 2 的旋转速率设置为滚轮 1 的旋转速率的倍数。将纤维从凝固中引导到滚筒 1 上，不要绕在滚筒 1 上，并将其收集在滚筒 2 上。
        注意：2 倍的旋转后拉伸比要求滚轮 2 的旋转速率是滚轮 1 的两倍;3倍，三倍;等等。
      3. 为了在溶剂中浸泡后进行后纺丝拉伸，用所需的溶剂（例如，去离子水;2：3 v / v乙醇/H2O等）填充溶剂浴，并将纤维从凝固浴中引导到滚筒1周围（旋转速率与挤出速率相匹配），在溶剂浴中围绕辊3（旋转速率等于滚筒1）， 并将纤维收集在空气中的辊 2 上（旋转速度比辊 1 和 3 快）。
        注意：滚轮 2 相对于滚轮 1 和 3 的旋转速率将决定旋转后拉伸比，如步骤 2.2.8.2 所示。
      4. 要在溶剂中进行后纺丝拉伸，请用所需的溶剂（例如，去离子水;2：3 v / v乙醇/H2O等）填充溶剂浴，并将纤维从凝固浴中引导到辊1（旋转速率与挤出速率相匹配）周围，在溶剂浴中的辊3（旋转速率等于辊1）周围，在溶剂浴中的辊4周围（旋转速率是辊1和3的旋转速率的倍数）并收集并收集空气中辊子 2 上的纤维（旋转速率与辊子 2 匹配）。
        注意：滚子 2 和 4 相对于滚子 1 和 3 的旋转速率将决定旋转后拉伸比，如步骤 2.2.8.2 所示。
        在受控环境条件下收集纤维，以避免湿度和温度对纤维行为的影响。我们的目标是相对湿度 ~ 28.2 ± 2.4%，温度 ~ 28.0 ± 2.2 °C。

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图 4：蜘蛛丝纤维湿纺的关键步骤。 （A）将原液挤出到混凝浴中，然后收集纤维（左边的红色矩形突出显示用于原液挤出的针头，右边的红色矩形是湿纺丝纤维的路径。（B） 纤维在空气中进行纺纱后拉伸的插图（红色矩形引导眼睛）。（C）纤维浸入水中后纺丝后拉伸的图解（红色矩形引导眼睛）。（D）收集在滚筒上的连续重组丝纤维（例如，红色箭头处的线轴纤维）。 请点击此处查看此图的大图。

3. 光纤的光学显微镜评估

  1. 光纤贴装
    1. 通过从 3 x 2 厘米的矩形纸上剪下 1 x 1 厘米的正方形纸来创建一个 C 形纸架（图 5）。
    2. 使用胶带将 C 形支架连接到玻璃显微镜载玻片上。
    3. 在C形纸架1厘米间隙的两侧贴上两条双面胶带。
    4. 从收集它的滚筒上取下一根纤维，然后切出一段大约 2 厘米长的片段。
      注意：处理纤维时避免用力过大，以防止材料变形或其他性能改变。
    5. 将光纤段放在双面胶带的顶部，确保光纤长轴平行于支架的底部边缘对齐（图 5）。
    6. 在两面的双面胶带上用遮蔽胶带固定光纤。
    7. 贴上另一条遮蔽胶带，将纸架底部牢固地固定在载玻片上，以防止纤维在使用前移动。
    8. 将安装的光纤存放在载玻片存储盒中，直到用于成像和拉伸测试。
  2. 直径测定和缺陷评估
    1. 使用光学显微镜检查安装的光纤。首先，筛选整个纤维长度是否有可见的缺陷，例如缩颈、扭曲、凸起或双纤维。如果观察到任何缺陷，请将这些光纤排除在机械测试之外。
    2. 对于看起来没有缺陷的光纤，沿光纤长轴以 10 倍放大倍率拍摄三张显微照片，一张位于光纤的中间，另一张靠近光纤的两端。
    3. 使用 ImageJ55 软件测量光纤直径：
      1. 在 ImageJ 中，转到 “分析” 菜单并选择 “设置比例 ”（补充文件 1 - 补充图 S1）。根据显微镜的校准设置调整刻度，并将测量单位设置为微米（μm）（补充文件1-补充图S2）。
      2. 使用 线条工具，绘制一条垂直于光纤长轴的直线，从光纤的一个边缘跨越到另一个边缘。
      3. 对于每张显微照片，测量沿纤维六个不同区域的纤维直径。
      4. 绘制每条线后，单击“分析”菜单中的“测量”以显示纤维直径（补充文件 1 - 补充图 S3）。
  3. 通过偏振光显微镜对分子比对进行定性评估
    1. 使用偏振光显微镜评估直径后的纤维内分子排列和光学显微镜缺陷评估。
      1. 使用配备可旋转载物台、固定分析仪滑块和 90° 可旋转偏振器的倒置光学显微镜检查光纤。
      2. 将光纤相对于入射平面偏振光放置在约 45° 的位置，以最大限度地提高双折射带来的亮度，从而增强分子结构的可见度。
      3. 在这些条件下拍摄光纤的图像以评估其双折射。
        注意：高双折射表明分子结构排列良好，而低或无双折射表明结构更加无定形或随机取向。

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图 5：将蜘蛛丝纤维安装到载玻片上，以便使用 C 形纸架和一系列胶带层进行下游分析。请点击此处查看此图的大图。

4. 拉伸试验

注意：适用于准确评估丝纤维的拉伸试验装置可以很容易地以相对较低的成本生产25,56。简而言之，制造一对不锈钢夹，以便在正在测试的 C 形框架中牢固地夹住每根光纤的每一端（例如，图 6）。将其中一个夹子连接到放置在分析天平上的重物上，将另一个连接到注射泵上。注射泵必须配置为允许以设定的应变率持续拉动。分析天平必须与计算机连接，以便收集记录的重量/质量数据作为时间的函数。

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图6：显示拉伸测试准备步骤的示意图。 （A）带有纤维的纸架（配置见 图5 ）从载玻片上拆下，并使用连接到重物的夹子垂直安装。（B）将该加重夹放在分析天平上，纸架的顶部固定在连接到杆上的夹具上，该杆牢固地固定在注射泵中。在开始拉伸测试之前，将纸架在中间水平切割。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 应力-应变曲线数据采集
    1. 测量纤维直径后，使用自制设备对同一根纤维进行拉伸测试（图6）。
      1. 从载玻片上拆下固定纤维的 C 形纸框，并固定到连接到重物上的夹子上（图 6A）。
      2. 将分析天平连接到数据记录/控制软件，然后导航到 工作台 （补充文件 1 - 补充图 S4）。
      3. 单击“ 开始” 按钮在天平控制软件中设置实验。出现提示时输入实验名称（补充文件 1 - 补充图 S5）。
      4. 确保分析天平为空，并将装有光纤的加重夹放在上面。
      5. 将纸框的顶部连接到连接到注射泵的夹子上，并切割纸架的一侧，以使光纤自由移动（图 6B）。
        注意：确保两个夹子彼此平行，并且光纤在夹子内居中，标距长度为 10 毫米。
      6. 将天平去皮以将砝码和夹具的质量归零，然后按下注射泵上的 运行 按钮，然后单击天平控制 软件中的确定 （补充文件 1 - 补充图 S6）。
      7. 当纤维断裂时，按注射泵上的 停止和 平衡控制软件中的 是 按钮（补充文件 1 - 补充图 S7）以时间的变化记录测量重量。
      8. 将数据传输到电子表格或其他合适的数据处理软件包进行处理。将重量与时间的数据日志复制到剪贴板并粘贴到提供的机械测试电子表格（补充文件 2）中，或将数据导出为文本文件并通过适当的解析进行导入。
  2. 应力-应变曲线数据处理
    注意：以下协议基于格式化为在 Microsoft Excel 中使用的机械测试电子表格（补充文件 2）。
    1. 确保实验参数正确（C列）。
    2. 将质量记录作为时间的函数添加到电子表格中（ F 列中的“净质量”）。如果在拉伸开始之前记录了质量值，则通过删除相应的单元格来删除这些值，并将数据向上移动。如果在光纤断裂后记录了质量值，请删除这些数据单元。
    3. 通过添加 1 的增量来自动填充 E 列 中的索引值，使索引总数与 F 列中测量质量值的总数相匹配。
    4. 重新缩放净质量，使净质量从 0 g 开始，并在拉伸实验期间增加，方法是从每个净质量值中减去初始净质量并将该差值乘以 -1（G 列）。
    5. 通过将测量指数乘以注射泵的拉率和记录的质量测量之间的时间滞后（H列），计算每次测量时纤维长度的变化。
    6. 通过将纤维长度的变化除以原始长度来计算工程应变（列 I）。
      注意：此计算给出了以 mm/mm 为单位的工程应变。要将工程应变值转换为 %，请将 第 I 列 中的值乘以 100%。
    7. 将延展性记录为最大工程应变值（单元T3）。
    8. 通过将质量从 g 转换为 kg 并乘以标准重力（9.81 m/s2; J 列）。
    9. 通过将给定拉伸度下确定的力除以纤维横截面积并乘以 10-6 转换为 MPa（K 列）来计算工程应力（以 Pa 为单位）。
    10. 将观测到的最大应力记录为极限应力（单元格 U3），将断裂应力记录为纤维断裂前记录的最终应力值（单元格 V3）。
    11. 计算应力-应变曲线下面积，以获得韧性，使用梯形规则计算每次测量后的曲线下面积（L列）。将这些区域相加以找到韧性（单元格 W3）。
    12. 通过使用 LINEST 函数确定应力-应变曲线初始线性区域的斜率来计算杨氏模量（以 MPa 为单位）。乘以 103 （单元格 X3）转换为 GPa。

5. 傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱显微镜

  1. 通过将第二张载玻片粘在为光学显微镜准备的载玻片底部来制备用于 FTIR 的样品。
  2. 光学图像和 FTIR 光谱采集
    1. 用液氮填充检测器杜瓦瓶以冷却检测器。
    2. 打开 FTIR 仪器控制软件。
    3. 在“ 查看和收集 ”窗口（补充文件 1 - 补充图 S8）中，打开 “收集” 选项卡，将 “收集模式” 设置为“ATR”，将 “检测器 ”设置为“冷却”（补充文件 1 - 补充图 S9）。
    4. 将载玻片放入载玻片支架中，然后将支架放在载物台上。
    5. 将上部照明设置为 100，将光圈和下部照明设置为 0。
    6. 使用软件中的物理纵杆或数字纵杆将样品光学显微镜图像的视场中心聚焦到光纤上，以控制视场中心和焦平面的位置。
    7. 将 采集模式 设置为映射（补充文件 1 - 补充图 S8）。
    8. 使用 地图视图 - 面积工具选择要成像和测量的区域。单击并拖动光标以指定要在显微照片预览中获取光谱的区域（补充文件 1 - 补充图 S8）。图像上的每个圆圈代表该位置的一个采集光谱。如果需要，通过将光标悬停在给定的框边缘上方，然后单击并拖动到所需位置来更改此框的边缘。通过在矩形内单击并拖动来平移整个框。修改 Stage、Aperture 和 Display 下的框的面积和数据点的数量（补充文件 1 - 补充图 S10）。
    9. 右键单击显微照片预览并选择 捕获马赛克 以保存图像（补充文件 1 - 补充图 S8）。
    10. 通过单击 当前 压力配置文件（Current pressure profile ） 下拉菜单来设置 ATR 压力。对于蛋白质纤维，使用 2% 的压力（即尽可能低的 ATR 压力）以尽量减少对纤维的损害（补充文件 1 - 补充图 S8）。
    11. 插入 ATR FTIR 尖端。
    12. 单击 “收集” 按钮（补充文件 1 - 补充图 S8）以获取背景光谱，然后获取每个选定点的光谱。收集完成后，数据将显示在新窗口中。
  3. 下游分析的数据准备
    1. 左键单击 热图或显微照片以查看在相应位置获取的光谱（补充文件 1 - 补充图 S11）。
    2. 右键单击 要分析的光谱，然后选择 复制 （补充文件 1 - 补充图 S11）。
    3. 右键单击屏幕顶部的 Windows 栏，然后选择新窗口（补充文件 1 - 补充图 S11）。
    4. 当新窗口打开时，单击屏幕顶部的 粘贴 按钮（补充文件 1 - 补充图 S11）。
    5. 使用相同的 方法将分析 所需的任何其他光谱复制并 粘贴 到此窗口中。
    6. 通过 按住 Ctrl 键并单击 每个所需光谱或在下拉菜单中突出显示所需光谱来突出显示光谱或光谱。
    7. 单击 另存为... 并将文件另存为 .spa 文件以分析光谱仪控制软件中的数据，或另存为 .csv 以分析另一个软件包中的数据（补充文件 1 - 补充图 S12）。
  4. 使用仪器专用软件进行二阶导数分析
    1. 在仪器特定的光谱处理和分析软件包中打开要分析的光谱。
    2. 要在 % 透射率和吸光度模式之间进行转换，请使用 Ctrl+A （% 透射率到吸光度）或 Ctrl+T （吸光度到 % 透射率）。
    3. 通过单击“ 查看”|选择感兴趣区域显示限制 （或， Ctrl+D）（补充文件1-补充图S13A）。要查看酰胺 I （1,700-1,600 cm-1） 和酰胺 II （1,600-1,500 cm-1） 波段，具体而言，请将 开始 和 结束 X 轴限制 设置为适当的波数。如果分析多个光谱，请选择 “应用于所有光谱”。单击 确定 （补充文件 1 - 补充图 S13B）。
    4. 要绘制二阶导数，请单击 “过程”|导数。。。 ，然后从下拉菜单中选择 第二 （补充文件1 - 补充图S14A）。选择段长为 5、段间隙为 5 的 Norris 导数（补充文件 1 - 补充图 S14B）。二阶导数光谱的最小值与原始吸光度光谱内的组分峰重合。
      1. 如果频谱太嘈杂而无法评估最小值，请通过单击 “处理”>“自动平滑 ”（补充文件 1 - 补充图 S15）来平滑频谱。然后，计算二阶导数并找到最小值。
    5. 使用参考表（例如表 2）将二阶导数最小值处的波数与二级结构的特征能带位置相关联，以深入了解蛋白质二级结构。
  5. 使用仪器专用分析软件进行峰反卷积
    1. 将显示区域设置为要反卷积的区域，如步骤 5.4.3 所示。只有这个区域才会被反卷积。
    2. 基线使用以下方法之一校正选定的光谱区域：
      1. 单击 流程 |自动基线校正 （补充文件 1 - 补充图 S16）;或
      2. 单击 流程 |基线校正 （补充文件1 - 补充图S17A），然后从下拉菜单中选择 线性 ，并通过单击并拖动指定要校正的区域的下限和上限的两个点来指定要在位置光谱上进行基线校正的光谱区域，以进行反卷积目的。接下来，在第二个下拉菜单中选择 添加到窗口 ，然后单击 添加 按钮（补充文件 1 - 补充图 S17B）。
    3. 选择基线校正光谱后，单击 分析 |峰值分辨率... 打开“峰分辨率”窗口（补充文件1 - 补充图S18）。
    4. 使用屏幕左侧的选择栏选择要分析的光谱和曲线。
    5. 在“查找峰”选项卡中选择“高斯/洛伦兹”，灵敏度设置为“低”，FWHH设置为2，然后单击“查找峰”按钮（补充文件1 - 补充图S19）。
    6. 单击 “峰” 按钮以打开描述峰的表格。
      1. 如果拾取的峰多于物理上合理的峰，请单击 删除峰 ，直到获得正确的峰数进行分析（补充文件1 - 补充图S20）。例如，对于酰胺I区，文献中通常报告了5-11个峰（表2）。
      2. 要确保拟合后所有峰均为正，请单击 “编辑峰” 并将高度最小值设置为 0。然后，单击 “下一步 ”并对每个峰重复此作，然后重复“ 确定” 以关闭编辑窗口（补充文件1 - 补充图S21）。
      3. 如果最终反卷积中需要存在特定的波数，请单击“编辑峰值”，然后通过选择“固定”将峰值中心固定为“值”框中指定的波数，或者使用“下限”和“上限”框提供范围。单击“确定”将这些设置应用于给定的峰。
        注意：在此步骤中，最好使用二阶导数分析期间发现的峰位置或FTIR二级结构参考表中的峰，最好针对类似的丝样品类型进行注释（例如， 表2）。
    7. 单击“ 拟合峰 ”按钮（补充文件 1 - 补充图 S22）。
      1. 如果峰拟合算法未成功收敛，请再次单击 “拟合峰 ”以迭代方式继续拟合峰。
    8. 单击 “峰... ”按钮可获取有关位置、高度、FWHH 和所有拟合峰的面积的信息。
      1. 可以通过单击 剪贴板 将这些峰复制到剪贴板，以允许将它们粘贴到另一个窗口或文件中（补充文件 1 - 补充图 S23）。
      2. 通过在 “添加 ”按钮旁边的窗口选择下拉菜单中选择目标，将峰和谱图复制到另一个窗口（补充文件1 - 补充图S24）。
      3. 单击 全选 按钮并使用 文件 |另存为 将峰和谱图另存为 .spa 和/或 .csv 文件（补充文件 1 - 补充图 S25）。
    9. 使用参考表将每个组分峰与二级结构相关联。与给定二级结构相对应的峰的相对面积相对于所有指定峰的总面积提供了具有该二级结构的蛋白质的比例。
  6. 使用第三方软件为下游分析准备数据
    1. 打开工作簿，通过选择 “数据 |连接到文件 |文本/CSV 菜单项（补充文件 1 - 补充图 S26）。在 文件资源管理器 中选择所需的文件，然后单击 “打开”。
    2. 通过突出显示要绘制的列并选择“ 绘图 |基本 2D |行 菜单项（补充文件 1 - 补充图 S27）。
    3. 双击 x 轴 并使用 “刻度” 选项卡调整范围以适合酰胺 I 峰（补充文件 1 - 补充图 S28）。
    4. 如果数据非常嘈杂，请通过选择 “分析”|信号处理>平滑>打开对话框... 菜单项（补充文件 1 - 补充图 S29A）。
      1. 将 “重新计算 ”选项设置为“自动”，将 “方法 ”设置为“Savitzky-Golay”，将 “窗口点 ”设置为“5”，将 “边界条件” 设置为“无”，将 “多项式阶数” 设置为2（补充文件1 - 补充图S29B）。
      2. 单击 “确定 ”进行处理。
  7. 使用第三方软件进行二阶导数分析
    1. 选择 分析 |数学 |差异化 |打开对话框... 菜单项（补充文件 1 - 补充图 S30）。
    2. 将 “重新计算 ”选项设置为“自动”，将“ 导数顺序 ”设置为 2，选择“ 绘制导数曲线 ”选项，然后单击“ 确定 ”（补充文件 1 - 补充图 S31）。
    3. 如果生成的二阶导数曲线非常嘈杂，请按照步骤 5.7.1 进行作。5.7.2，在“微分”对话框的“平滑”选项卡中选择“Savitzky-Golay 平滑”。
    4. 与 5.4.5 一样，将二阶导数最小值处的波数与二级结构相关联。
  8. 使用第三方软件进行峰值反卷积
    1. 单击酰胺 I 吸光度光谱图后，选择 分析 |峰值和基线 |峰值分析仪 |打开对话框... 菜单项（补充文件 1 - 补充图 S32）。
    2. 在 “目标 - 拟合峰 （Pro）” 对话框中，将 “重新计算 ”选项设置为“自动”，选择 “拟合峰”，然后单击 “下一步”。（补充文件 1 - 补充图 S33A）。
    3. 在“ 基线模式 ”对话框中，将“ 基线模式” 参数设置为“直线”，然后单击 “下一步 ”（补充文件 1 - 补充图 S33B）。
    4. 在“ 基线处理 ”对话框中，选择“ 自动减去基线”，单击“ 立即减去 ”按钮，然后单击 “下一步 ”（补充文件 1 - 补充图 S33C）。
    5. 在 “查找峰 ”对话框中，禁用 “启用自动查找 ”，然后单击 “添加”。
      1. 双击包含具有要拟合的峰的光谱图的窗口。
      2. 根据二阶导数（步骤5.7.4）或参考表（例如表 2）中观察到的最小值选择峰。
      3. 单击 “完成” ，然后单击 “下一步 ”（补充文件 1 - 补充图 S33D）。
    6. 在 “拟合峰 （Pro）” 对话框中，选择 “从当前拟合结果生成报告 ”，然后单击 “拟合”。然后是 完成 （补充文件 1 - 补充图 S33E）。
    7. 评估工作簿的 PeakProperties1 选项卡以查看每个峰的中心、积分面积和 FWHM（补充文件 1 - 补充图 S34）。如步骤5.5.9所示，将每个组分峰与二级结构类型相关联，并评估蛋白质结构与该二级结构的百分比。
波数范围 （cm-1）分配
1605−1615年Tyr 侧链/聚合β链
1616−1621年聚集的β链/分子内β片 [弱]
1622−1627年分子间β片 [强]
1628−1637年分子内β片 [强]
1638−1646年随机线圈/加长链
1647−1655年无规线圈
1656−1662年α-螺旋
1663−1696年转弯
1697-1703分子间β片 [弱]

表2： 基于对胡等人多项研究的比较评估，对 Bombyx mori 丝的酰胺 I 区振动带分配 57.

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

理想的可旋转原液是透明、无沉淀且粘稠的溶液，表明蛋白质完全溶解（图7A）。相反，不完全溶解会导致乳状悬浮液或可见沉淀物（图7B，C）。蛋白质完全溶解所需的时间随溶剂的函数而变化，一些溶剂（如TFA/TFE/H2O混合物）通常在30分钟的时间间隔内完全溶解蛋白质，而其他溶剂（如HFIP）可能需要在偶尔涡旋的同时搅拌过夜。

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图 7：纺丝原液溶液优化。 （A）能够完全溶解蛋白质的溶剂产生透明且粘稠的可纺旋原液溶液。蛋白质通过非最佳溶剂选择部分溶解或悬浮可能会导致 （B） 过于粘稠的状态，通常带有可见的沉淀物或 （C） 乳状悬浮液。 请点击此处查看此图的大图。

图2E 显示了具有代表性的手绘纤维，而 图4D 显示了线轴湿纺纤维。在进行任何下游分析之前，光学显微镜对于评估光纤质量至关重要。适用于下游分析并使用两种不同条件纺丝的湿纺重组丝纤维的代表性光学显微照片（样品湿纺配置见 图3 ）如 图8所示。通过光学显微镜（图8A），很明显，这些纤维表现出均匀的直径，在应用后自旋拉拔时直径明显减小（即，在40%乙醇（4x-EtOH）中以4倍的比例拉伸的纺丝（AS）与后纺后拉伸）。在偏振光显微镜中导致更大程度的双折射导致更大的对比度（图8B）与自旋后拉伸过程导致纤维中分子排列的改善一致。最后，应该注意的是，很可能在评估的某些部分光纤中观察到缺陷，从而使给定的光纤段不适合下游分析。 图 9 显示了两个这样的示例。

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图8：湿纺重组蜘蛛丝纤维的代表性光学显微照片。 通过光学显微镜（左列）和偏振光显微镜（右列）观察到的嵌合梨状-腺泡状丝结构（Py2W2）说明了处于AS状态和在乙醇（EtOH）中旋转后拉伸4倍后的纤维。图像经 Ghimire 等人许可转载17。比例尺 = 30 μm。缩写：AS = as-spun;EtOH = 乙醇。 请点击此处查看此图的大图。

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图 9：使用光学显微镜可观察到的潜在光纤缺陷示例。 （A） “凸出”缺陷的示例。（B） “缩颈”缺陷的一个例子。比例尺 = 20 μm请 点击此处查看此图的大图。

在确保给定的纤维段中不存在缺陷并在直径确定之后（协议部分3.2），可以进行拉伸测试（例如， 图6）。使用不同条件纺制的嵌合重组蜘蛛丝获得的代表性应力-应变曲线如 图10所示。根据纺丝条件，所得纤维的范围从脆性（AS 态）到高度可伸展且强度与 AS 态相似（2x-空气态），再到更坚固且延展性更差的纤维（4x-EtOH 态）。应该注意的是，必须评估多个纤维段和纺丝纤维批次，以明确和严格地评估机械行为。

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图 10：从各种条件下纺出的纤维的代表性应力-应变曲线。 在纺丝状态 （AS） 或使用自动纺纱后拉伸（显示拉伸比和拉伸条件（空气与溶剂）指示）进行生产分析纤维。图经 Ghimire 等人许可 改编（ 2024）17。缩写：AS = as-spun。 请点击此处查看此图的大图。

最后，可以使用ATR-FTIR光谱显微镜评估纤维态二级结构。通过该方法获得的典型丝纤维光谱（图11A，B）将具有特征性蛋白质条带，包括宽酰胺A峰（以~3,300 cm-1为中心）、酰胺I峰（~1,600-1,700 cm-1）和酰胺II峰（~1,500-1,600 cm-1）。在这里，我们重点评估酰胺I区域（例如，图11C，D）。二阶导数分析可作为鉴定酰胺I峰关键组分的一种手段（图11E，F），为定量峰反卷积（图11G-J）提供可信度，从而可以评估和比较在给定条件下纺丝纤维中观察到的二级结构类型的比例。

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图 11：FTIR 光谱和二级结构分析。（甲、乙）在 （A） 纺丝 （AS） 状态下通过湿纺产生的 Py2W2 纤维的 FTIR 光谱和 （B） 在乙醇中掺入 4 旋后拉伸。（C，D）FTIR 光谱的酰胺 I 区域分别显示在 A 和 B 中。（E-F）分别在C和D中显示的酰胺I区域的二阶导数，使用指定的软件包计算。（G-J）使用（G和I）OMNIC或（H和J）OriginPro软件包执行Amide I峰反卷积，面板G和I是对应于C和H以及J到D的反卷积。缩写：FTIR = 傅里叶变换红外;AS = 纺丝时。请点击此处查看此图的大图。

除了个别技术之外，二级结构、机械性能和（超）分子取向数据的相关性通常对于了解不同纺丝参数对所得材料的影响以及合理优化纺丝工艺至关重要。例如，在图11所示的FTIR反卷积中，将嵌合丝的AS与4×-EtOH条件进行比较，对于这两种条件，对酰胺I带的大量β片贡献是显而易见的，但相对于AS状态，无论反卷积方法如何（例如， 图11G，H与图11I，J）。这与在 4×-EtOH 条件下观察到的强度明显高于 AS 状态（图 10）以及 4×-EtOH 条件下相对于 AS 状态的分子比对的改善（图 9）一致。详细的表征和分析涵盖图10所示的条件范围，之前已经报道过17。因此，我们没有在这里概括整个分析，而是使用这种成对比较来演示这三类数据如何相互补充，并且能够比任何一种单独的技术更全面地了解纤维行为。

补充文件 1：包含补充图 S1-S34 的文件，描述了光纤直径测量、机械数据处理以及 FTIR 数据采集和处理。请点击此处下载此文件。

补充文件 2：一个电子表格，能够从质量与时间数据中确定关键的机械性能（即应力、应变、杨氏模量和韧性）。请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

重组蛋白生产使制造各种形式的材料具有令人兴奋的潜力，最近的进展意味着这些基于蛋白质的材料正在接近更广泛的工业用途58。在这里，我们重点关注重组丝的纤维生产，因为这是与天然纤维蜘蛛丝直接相关的重组丝的形式。由于天然蜘蛛丝著名的机械性能以及可持续生产高性能纤维的潜力，蚕丝纤维被吹捧为具有许多潜在的应用32。拟议的应用范围从高性能纺织品到吸能材料，从个人护理产品到医疗保健用途58,59。可穿戴格式或其他电导率增强的环境中的蜘蛛丝设备和材料也在积极探索中，用于生物医学和更广泛的应用60。因此，人们对开发、优化和定制蜘蛛丝材料产生了广泛的兴趣。在本协议中，我们概述了一系列程序，这些程序旨在在制备新的重组丝蛋白后快速生产纤维，或调节已经确定为可纺丝的重组丝的材料特性。

无论采用哪种纺丝方法，通过筛选溶剂/缓冲液条件和蛋白质浓度来确定能够生产离心原液的条件至关重要，详见本文。最终目标是将蛋白质溶解在足够高的浓度下，以便能够快速转化为纤维，而不会偏离途径自组装成聚集体或其他不溶性物质，从而阻止“生产性”纺丝。这通常是一种透明的、相对粘稠的溶液，很可能包含自组装物质，例如胶束/纳米颗粒26,61和/或液-液相分离62。该协议没有详细说明全面评估自旋掺杂状态的方法，因为可以通过对各种自旋掺杂剂和纺丝配置的迭代评估来实现成功的纤维纺丝。通过粘度测定、光散射、远紫外圆二色性光谱、核磁共振波谱和/或电子显微镜等技术，可以实现对自旋掺杂态的详细分子和超分子洞察26。还应该注意的是，重组蛋白本身可以被修饰以增强其旋转行为，包括球状非重复的N端和C端结构域是增加蜘蛛蛋白溶解度的方法的一个例子32。简而言之，如果没有合适的自旋原液鉴定，就无法进行纺丝条件的比较测试。

一旦确定了一种或多种纺纱掺杂条件，手绘就提供了一种评估丝纤维性能的快速途径。由于生产性手工拉伸所需的原液体积要少得多，因此需要的纯蛋白质质量要低得多，这使其成为自动湿纺方法的极好前体。这也提供了一种非常易于处理和直接的方法来直接比较不同蜘蛛蛋白33的纤维特性，同样具有纤维生产相对简单且蛋白质含量较低的好处。这意味着蛋白质表达和纯化方案的优化可以集中在最有前途的蜘蛛蛋白上，以获得湿纺所需的更高产量。当然，缺点是手绘不适合生产长连续纤维或以流线型方式生产大量纤维。

如果蛋白质充足，湿纺则为长而连续的纤维的简化生产提供了优势32。不仅如此，纤维特性还可以通过纺丝过程轻松调节。例如，选择纺丝原液条件为改善纤维力学提供了一条明确的途径。例如，在~60 kDa重组腺泡状丝蛋白的情况下，从一种自旋涂料变化到另一种自旋掺杂物，而所有其他纺丝参数保持不变，导致纤维延展性的显着变化26。反过来，这又与腺泡状螺纹蛋白在纺丝前在自旋原液中组装的方式有关，自旋原液中自组装纳米颗粒的均匀性的改善与纤维力学的改进相关。结合后自旋拉伸，注意到必须针对给定的纤维类型优化拉伸比，通常也通过改进的分子排列和增强转化为例如增强纤维的β片微晶的某种组合来改善丝纤维力学32。最后，在自旋后拉伸阶段使用不同的条件提供了一种调节纤维特性的方法。在抽取之前或期间暴露溶剂可能会显着改变纤维的机械和结构性能17,38，并指出不同的梭状纤维将具有不同的溶剂偏好和耐受性（例如，重组腺泡状纤维具有高度水相容性26,31 与重组梨状纤维在水中收缩38与嵌合梨状-腺泡状 spidroin 的纤维相比，表现出腺泡状 spidroin 的水相容性，尽管按质量计不到蛋白质的一半17）。

所描述的协议提供了一种高度可定制和通用的方法来评估和优化重组蜘蛛丝的可纺性和纤维特性。在所有情况下，必须对所得纤维特性进行一致且稳健的分析和比较。在这里，我们建议使用光学显微镜，包括偏振光显微镜、拉伸测试和 FTIR 光谱显微镜作为用于此目的的技术的“标准工具包”。可以应用其他生物物理和材料表征技术来扩展对所得纤维的理解，但这套技术出色地涵盖了形态学、纤维内排列/各向异性、机械性能和蛋白质二级结构的关键特性。特别是，尽管FTIR光谱显微镜提供了一种相对简单的方法来评估丝纤维的二次结构，而偏振光显微镜可以推断已经实现的增强分子比对程度，但其他方法，如固态核磁共振波谱63,64，X射线衍射64，偏振拉曼光谱显微镜65和/或非线性光学显微镜54为了更全面地评估丝纤维内的结晶度、排列和结构，以阐明完整的结构力学关系。鉴于湿纺对其他类型蛋白质的适用性66，我们预计该协议将普遍适用于重组丝之外。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan K. Rainey 报告了与 3DBioFibR Inc. 的关系，其中包括股权或股票和资金赠款。其他作者没有利益冲突需要声明。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作的资金由加拿大自然科学与工程研究委员会 （NSERC） 发现补助金（RGPIN-2020-06083 至 X-QL 和 RGPIN-2023-05912 至 JKR）、国防部/NSERC 补充（DGDND-2023-05912 至 JKR）、NSERC 联盟补助金（ALLRP-578541-22 至 JKR）与 3DBioFibR Inc 合作，以及 NSERC 研究工具和仪器补助金提供。AG 是新斯科舍省博士级研究生奖学金 （NSGS-D） 和达尔豪斯医学院 2024 年研究生奖学金的获得者，该奖学金由 Molly Appeal 捐助者资助;HB 是 NSERC 资助的 Vanier Canada 研究生奖学金、Killam 博士前奖学金（2 级）和 NSGS-D 的获得者;并且，SE 是 NSERC 博士研究生奖学金 （PGS-D）、NSERC/国防部补充资助奖和 Walter C. Sumner 纪念奖学金的获得者。作者感谢 Sophie Haverstock 和 Emily Smith 的技术支持。

材料

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1,1,1,3,3,3-六氟丙醇（HFIP）赛默飞世尔科技445820500原液制备
1725LTSN注射器，带鲁尔尖端胶结针 汉密尔顿81100用于湿法纺丝
2,2,2-三氟乙醇 （TFE）Sigma-AldrichT63002-500G用于原液制备
无水乙醇Fisher ScientificBP28184用于混凝浴 
乙酸Fisher ScientificA38-212用于原液制备
分析天平梅特勒-托利多 XS105 双量程拉伸试验装置
氯化钙 （CaCl2）Sigma-AldrichC-3881用于原液制备
檬酸 Millipore Sigma77-92-9用于原液制备
计算机Raspberry PiRaspberry Pi 4 型号 B 湿纺设备 - 提供使用图形用户界面控制步进电机的能力
磷酸氢二钠（Na2HPO4）Millipore Sigma7558-79-4用于原液制备
甲酸 Fisher ScientificA118-500用于原液制备
载玻片 Millipore SigmaS8902-1PAK用于光纤封片
盐酸 （HCl）EM ScienceHX0603-53用于原液制备
MCT-A 冷却检测器 Thermo Fisher Scientific840-199300纤维二级结构的 FTIR 评估
安装板内部湿纺设备
NEMA 17 生物极性步进电机STEPPERONLINE17HS15-1504S-X1湿纺丝设备 - 注意：需要多个电机才能进行后纺丝
Nicolet iN10 FTIR 光谱显微镜Thermo Fisher Scientific912A0604纤维二级结构
Nicolet iN10测绘台Thermo Fisher Scientific840-198800的FTIR评价
 Thermo Fisher Scientific840-199800纤维二级结构的 FTIR 评估
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350Thermo Fisher Scientific840-194800 纤维二级结构的FTIR评价
OMNIC Picta 版本 1.7.224赛默飞世尔科技INQSOF018FTIR 仪器控制软件
OMNIC 版本 9.11.745赛默飞世尔科技INQSOF018FTIR 仪器专用数据处理和分析软件
光学/偏振光  显微镜蔡司加拿大Axio Observer A1倒置光学显微镜
OriginPro 2025 10.2 SR1OriginLab CorporationOriginPro 10.200196第三方FTIR数据处理与分析软件
磷酸二氢钾（KH2PO4）Fisher ScientificP285-10用于原液制备
磷酸氢二钾（K2HPO4）Fisher ScientificBP363-500用于原液制备
电源ALITOVEALT-1205湿纺设备 - 12V 5A 电源适配器转换器交流 100-240V 输入，带 5.5x2.5mm 直流输出插孔 - 注意：为了获得最佳性能，可能需要为每个电机提供单独的电源
酸钠 Sigma-AldrichS2889-1KG用于原液制备
氢氧化钠 （NaOH）Millipore Sigma1310-73-2用于原液制备
纺纱辊 内部用于湿纺
进电机电缆XMSJSIYB0BD5FV3R2湿纺设备 - 提供从步进电机控制器到步进电机的连接
进电机控制器 （Pi HAT）AdafruitDC &用于 Raspberry Pi 的步进电机 HAT纺设备电机控制器排列 1 - 注意 ~46 rpm 的有限电机转速
进电机控制器 （USB）PoluluTic T249湿纺机电机控制器排列 2 - 当可能需要转速超过 46 rpm 时使用
注射泵KD ScientificModel 100试验装置和湿纺丝装置
三氟乙酸 （TFA）Millipore SigmaTX1276-7用于原液制备
Tris-hydrochloride EMD Millipore9310-500GM用于原液制备
USB 集线器AcasisB07Q3TYF15 湿纺设备 - 48W 供电 USB 集线器 - ACASIS 10 端口 USB 3.0 数据集线器 - 带单独的开/关开关和 12V/4A 电源适配器 USB 分配器 - Raspberry Pi 和 Tic T249 步进电机控制器之间的接口
用于柠制造 的FTIR评价 纤维二级结构Nicolet iN10电动载物台纵杆醋制造 步 步 湿 步 拉伸

参考文献

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
Posted by JoVE Editors on 9/08/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68714

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