用于研究神经修复与功能恢复的小鼠坐骨神经横断/再缝合手术操作

摘要

本方案描述了一种在小鼠中进行坐骨神经横断与再缝合的模型，用于利用成年背根神经节神经元研究周围神经再生。该模型可实现 体内 轴突再生、肌肉再支配及神经损伤后功能恢复的分析

摘要

神经修复对于轴突损伤后功能的恢复至关重要。然而，由于内在生长能力减弱以及所处环境不利，中枢神经系统（CNS）中的成熟神经元在损伤后其轴突再生能力十分有限。相比之下，外周神经系统（PNS）中的神经元表现出较强的再生潜力。其中，成年背根神经节（DRG）神经元因其在外周神经损伤后能够有效再生而尤为知名，是研究神经修复背后细胞与分子机制的理想模型。本文介绍了一种改良的显微缝合技术，称为“切断前打结法”（loop-before-transection），用于在小鼠中建立坐骨神经切断后再缝合的模型，并随后分析轴突再生情况。同时展示了行为学评估和肌肉再支配实验，以评价功能恢复状况。在坐骨神经切断并重新缝合后，动物最初表现出行为功能缺陷，但通常在损伤后30天即可观察到完全恢复。在损伤部位应用促进轴突融合的药物可显著加快功能恢复进程。该模型系统为在活体（in vivo）条件下研究哺乳动物神经修复的调控机制提供了有力工具。

引言

轴突损伤是脑和脊髓损伤中常见且严重的后果，通常由创伤性损伤、神经毒素或神经系统疾病引起，这些因素会破坏神经连接并阻碍轴突再生^1,4。 并非所有神经元都具备再生的内在能力，而这种能力对于断裂轴突的修复至关重要。轴突再生速率受多种因素影响，包括神经元的内在生长潜力、蛋白质合成效率、细胞骨架动态、髓鞘碎片的清除以及生长因子的可获得性^3,4。

在成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）中，轴突损伤导致再生能力下降，主要原因是缺乏内在的促生长因子以及存在抑制性的外在信号^1,5。相比之下，外周神经系统（PNS）中的轴突在损伤后具有较强的再生能力，这归因于外周神经元内在的自我修复机制以及促再生生长程序的快速重新激活。损伤发生后，轴突的远端部分与神经元胞体分离，并经历瓦勒变性（Wallerian degeneration），其特征是轴突的解体和断裂^6,7。胶质细胞高效清除轴突和髓鞘碎片对于成功再生至关重要，因为这可以防止形成....

方案

所有动物实验均按照圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行（方案编号：20200082AR）。本 JoVE 实验方案中使用了成年雄性和雌性 FVB 小鼠（8–10 周龄，20–25 g）。C57BL/6 小鼠（8–10 周龄，20–25 g）仅用于正式实验前的初步练习手术，以优化操作技巧和缝合精度。这些练习实验确认，"切断前打结"操作在两种品系中均产生可比的结果；因此，本文报告的所有正式数据均来自 FVB 小鼠。最初共有十只 FVB 小鼠（五只雄性、五只雌性）被纳入坐骨神经切断后接受 ML162 + PEG 治疗的实验。其中一只动物存在先天解剖变异，其坐骨神经在切断部位之前已分为两个主要分支，导致手术不完全，因而被排除在分析之外。因此，行为学和组织学分析基于九只动物（n = 9）进行。两性在再生能力和行为恢复方面表现相当，未观察到性别特异性差异。另有一只小鼠接受了双针缝合穿透但未进行神经切断（假手术对照），以评估缝合操作本身对行为学结果的潜在影响。在再生反应方面，两性之间未观察到明显差异。动物饲养于标准条件下，光照/黑暗周期为 12 小时，温度 75 °F，相对湿度 40%–60%，食物和饮水自由获取。实验中同时使用了雄性和雌性小鼠，且未观察到两性动物之间的明显差异。手术操作在 SomnoSuite 低流量麻醉系统的异氟烷麻醉下进行。行为学测试从术后第 2 天开始，并在第 4、7、10、14、18、22 和 27 天重复进行，具体时间点见相应图示。所用试剂和设备列于

结果

先前的PEG融合方案¹⁸ 经过改进以保持手术效果的一致性，并尽量减少缝合引起的神经损伤²⁵通过在横断神经前将缝线穿过神经，可最大限度减少横断后使用镊子夹持或针刺造成的损伤。为检验缝线穿过神经并打结对其功能的影响，将缝线在完整神经上穿过两次并打结。图2A，不进行SNT的缝合）。术后30天检查发现，穿过神经的缝线并未在神经上形成瘢痕图2A，仅缝合未进行SNT）。仅接受缝合而未进行SNT的小鼠在所有行为学测试中均表现正常，表明缝合所致的神经穿刺并未影响神经功能（图3B, 图4B，以及 图5B).

在之前的一项研究中，通过四个实验组.......

讨论

利用神经横断模型进行神经再生研究在小鼠坐骨神经上被广泛开展^31,39。然而，由于小鼠坐骨神经体积小且质地柔软，使用手术器械轻柔操作较为困难，组织在缝合过程中容易发生撕裂。显微缝合过程常伴随过度操作，可能导致神经变形和创伤。即使尽量减少不必要的器械刺激，缝合后神经的过度移动仍可能导致对位不良，进而影响早期功能恢复。这些因素降低了横断模型中实验结果的一致性和可靠性，凸显了建立一种可重复且能最大限度减少神经损伤的手术方法的必要性。

该手术方案旨在控制变量的同时尽量减少外科医生的干预。在设计该手术方案时，考虑了以下因素：（1）尽量减少手术器械的使用，以降低对神经的刺激；尽可能避免使用镊子夹持神经；（2）尽量减少缝合打结的次数，因为打结操作也可能对神经造成足够程度的损伤；（3）尽量减少对手术医生操作技术的依赖。经过广泛评估后得出结论：神经损伤或变形最常见的原因是缝合过程中使用器械牵拉切断后的神经。因此，采用了一种在切断神经前先穿入并定位缝线的方法，从而避免在操作中使用手术器械.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#55 镊子	Dumostar-Biology	11295-51	每手各持一把。用于夹持10-0尼龙缝线时需使用两把。
10-0 尼龙缝线	DemeTECH	NL761000,4F0P
4-0 尼龙缝线	Matrix Wizard	0197
抗 β-tubulin 抗体	R&D Systems	MAB1195
抗 NF-200 抗体	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz 000 号			用于针刺试验
CF488 标记的 α-银环蛇毒素	Biotium	00005
解剖剪刀	Kent Scientific
精细缝合剪刀	Kent Scientific
虹膜镊	Kent Scientific
K&H 小动物加热垫	K&H pet products
ML162	Millipore Sigma	SML2561
小鼠手术器械包	Kent Scientific
持针器	Kent Scientific
聚乙二醇（PEG）	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific		用于异氟烷麻醉
分路镊			用于暴露坐骨神经。