小鼠坐骨神经截断/缝合手术，用于研究神经修复和功能恢复

Summary

该方案描述了一种坐骨神经切断与缝合模型，用于小鼠利用成年背根神经节神经元研究周围神经再生。它能够在 体内 分析神经损伤后轴突再生、肌肉再神经和功能恢复。

Abstract

神经修复对于轴突损伤后恢复功能至关重要。然而，中枢神经系统（CNS）成熟神经元由于内在生长能力减弱和恶劣环境，受伤后轴突再生能力有限。相比之下，周围神经系统（PNS）中的神经元表现出强大的再生潜能。其中，成年背根神经节（DRG）神经元以其在周围神经损伤后有效再生的能力而闻名，使其成为研究神经修复背后细胞和分子机制的理想模型。本文介绍了一种改良的微缝技术，称为“环前截断”，用于在小鼠中生成坐骨神经切断和缝合模型，随后分析轴突再生。行为评估和肌肉神经再支配也被证明能评估功能恢复。坐骨神经截断和缝合术后，动物最初表现出行为缺陷，但通常在受伤后30天内能完全康复。在损伤部位使用促进轴突融合的药物，显著加速功能恢复。该模型系统为研究体内哺乳动物 神经修复机制提供了有力工具。

Introduction

轴突损伤是脑和脊髓损伤的常见且严重后果，通常由创伤性损伤、神经毒素或神经系统疾病引起，这些疾病破坏了神经连接并损害了轴^突再生1,2。并非所有神经元具备内在再生能力，而这对修复断裂轴突至关重要。轴突再生速率受多种因素影响，包括神经元的固有生长潜力、蛋白质合成效率、细胞骨架动力学、髓鞘碎片清除率以及^{生长因子的}可用性^3,4。

在成年哺乳动物中枢神经系统（CNS）中，轴突损伤导致再生能力下降，主要原因是缺乏内在促进生长因子且存在抑制性外在信号^1,5。相比之下，周围神经系统（PNS）中的轴突具有强健的再生能力，这得益于周围神经元本身的自我修复机制和促进再生生长程序的快速激活。受伤时，轴突远端段与神经体体脱节，发生瓦勒变性，表现为轴突解体和破碎 ^6,7。胶质细胞高效清除轴突和髓鞘碎片对于成功再生至关重要，因为它能防止疤痕形成，从而阻碍轴突生长 ^3,8。这一过程，加上受伤轴突的细胞骨架重塑，支持近端残端的再生，促进靶细胞神经再支配。这些事件发生在部分重叠的阶段，在此期间，ATF3和c-Jun等转录因子的损伤激活促进促进再生的基因^{表达程序4,9,10}。

再生轴突融合是轴突损伤后恢复神经连接的高效^机制。这一过程最早于1967年在小龙虾Procambarus clarkii中被描述，随后在多个物种^{13、14、15、16}中被记录下来，包括秀丽隐杆线虫¹⁷。尽管关于哺乳动物轴突融合的直接证据有限，但融合诱导策略已被成功应用于增强神经修复¹¹。值得注意的是，化学物质富苏根聚乙二醇（PEG）促进膜重新密封，已被证明有助于哺乳动物模型^{18,19,20,21,22,23,24}中周围神经和脊髓损伤后的功能恢复。最新研究显示，谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的耗竭足以促进秀丽隐杆线虫²⁵的轴突融合。同样，Gpx4条件性敲除小鼠或接受GPX抑制剂ML162治疗的鼠在坐骨神经切断后表现出加速的功能恢复，可能通过增强轴突融合²⁵实现。

坐骨神经是一种混合神经，由感觉神经、躯体运动轴突和自主神经运动轴突^组成。它起源于大鼠的L4和L5脊节²⁷，以及小鼠的L3和L4节段²⁸。由于其易接近性和解剖结构的一致性，坐骨神经损伤已成为研究周围神经再生最广泛使用的模型之一^29,30。这些模型使得研究影响轴突生长和功能恢复的内在神经机制和外在环境因素成为可能 ^3,4,9。坐骨神经压碎作为神经科学实验范式的应用可以追溯到19世纪末²⁹。除了神经压碎模型外，神经切断还广泛用于研究轴突再生和功能恢复。然而，由于小鼠神经体积小且结构脆弱，经典的坐骨神经切断后缝合通常不如大鼠的重复性和可靠性³¹。

通过一种改良的坐骨神经切断和缝合模型，称为“环前断裂”，成功生成了可重复的坐骨神经截断和缝合模型²⁵。这种方法通过预先插入缝线，消除了截断后神经处理的需求，从而减少机械应力并最大限度减少手术技术带来的变异性。研究发现，中等水平的GPX调节有助于小鼠坐骨神经完全截断后的功能恢复²⁵。低浓度ML162（0.25 μM）^32，GPX抑制剂和聚乙二醇（PEG，500 mM）18,19,20,21,22,23,24在坐骨神经切断（SNT）/缝合病灶上，成功提升了通过针刺、足部断裂不对称和脚趾扩张测试评估的行为评分 ^25,33，34. 截肢的哺乳动物背根神经节（DRG）远端轴突片段在3天内退化，导致神经肌肉连接（NMJ^）6,35受损，再生的DRG神经元将重新支配肌肉以恢复其功能。SNT/resuture-ML162/PEG联合治疗组在早期时间点（术后3天）显示神经支配NMJs和行为评分提升，表明神经肌肉功能恢复较早²⁵。

本文介绍了实现上述小鼠观察的“环前切断”显微缝合方法及药物给药方法。此前建立的PEG融合方案，能够快速修复断裂的大鼠神经，已被修改¹⁸。聚乙二醇（PEG）最初被报道能促进体外小龙虾内侧巨轴突（MGA）的外源性重^联。PEG融合方案在涉及大鼠坐骨神经压碎-切断损伤的试验中改善了25%-30%的行为结局，尽管在³⁴早期时间点未观察到功能恢复。后续改进引入了内源性膜封闭的^概念。神经损伤后，快速等离子体修复具有神经保护作用，防止神经退行性疾病。^Ca-2+诱导的膜包合囊泡积累促进了这一密封过程³⁸。完全神经切断会破坏腋窝以及病变部位的内膜、会尿和神经外鞘。肾外鞘的微缝线对齐近端和远端神经残端。缝合过程中，使用^Ca-2+游离低渗盐水减少膜包囊的形成，保持内膜和会周鞘开放，并使肾外膜缝线能紧密贴合。随后，含^Ca2+盐水的施用诱导囊泡积累，封闭剩余的等离子体破坏。

本方案使用了成年FVB小鼠（8-10周龄）和C57BL/6小鼠，未观察到株别特异性差异。小鼠的坐骨神经位于臀肌下方约1-2毫米、大腿中部，明显比大鼠更细且更脆弱，因此在解剖和缝合时需要更高的手术精度。必须注意避免神经过度拉伸或过度作，以免影响功能恢复。该方法涉及完全切断神经，从而在近端和远端残端之间形成物理间隙。由于该间隙抑制了直接的轴突再生，成功康复通常需要显微外科手术或神经移植。

由于小鼠坐骨神经比大鼠更细且更脆弱，因此需要更高的手术精度。虽然显微缝线常用，但由于过度作或反^复针头穿刺，可能会无意中造成额外创伤。这些局限性可能带来变异性，并可能干扰新治疗策略的评估。因此，在最小化缝线诱发神经损伤的同时，实现一致的手术结果对于可靠评估神经切断模型的功能恢复至关重要。采用“环前截断”方法，生成了可重复的坐骨神经截断和缝合模型，并评估了PEG和ML162双重治疗对功能恢复的影响。总体而言，尽管小鼠坐骨神经截断模型被广泛应用，但由于神经体积小且脆弱，其技术上存在挑战。本文所述的这种改良缝合方法满足了对可重复、标准化显微外科方案以最大限度减少机械损伤的关键需求。

Protocol

所有动物作均按照德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指导方针进行（协议编号：20200082AR）。这里描述的JoVE实验程序使用了成年雄性和雌性FVB小鼠（8-10周龄，体重20-25克）。C57BL/6小鼠（8-10周龄，20-25克）仅用于正式实验前的初步手术，以优化作和缝合精度。这些练习确认“环前截断”程序在两种品系中产生了相当的结果;因此，本稿中所有正式数据均来自FVB小鼠。最初共纳入10只FVB小鼠（5公5雌）进行坐骨神经截断，随后接受ML162+PEG治疗。其中一只动物表现出先天性解剖变异，坐骨神经在截断部位前分叉为两支，导致手术不完整且被排除在分析之外。因此，对九只动物进行了行为学和组织学分析（n=9）。两性在再生和行为恢复方面表现相当，且未观察到性别特异性差异。另一只小鼠接受了无神经切断的双缝穿透（假对照），以评估缝合手术本身对行为结果的潜在影响。在再生反应上，性别间未观察到显著差异。动物在标准条件下饲养，采用12小时光暗周期，温度为75华氏度，相对湿度为40%-60%，可自由获取食物和水。雄性和雌性小鼠均被使用，雄性与雌性动物之间未观察到明显差异。手术在SomnoSuite低流量麻醉系统下进行异氟醚麻醉。行为测试从术后第2天开始进行，并在第4、7、10、14、18、22和27天重复测试，具体时间见相应图表。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 坐骨神经切断/缝合及药物治疗

1. 将动物放置在加热垫上，通过立体解剖显微镜观察坐骨神经（见图1A）。
2. 使用SomnoSuite低流量麻醉系统对小鼠进行麻醉。
   注意：在开始手术前，请通过没有反射反应（如对脚趾夹击的反应）来确认麻醉深度。在眼睛上涂抹兽医眼药膏以防止角膜干燥。
3. 剃掉大腿及周围的毛发。
   注意：尽可能干净地去除剃光和掉落的毛发。否则，毛发会粘在10-0尼龙缝线上，污染坐骨神经。剃须后，可以用实验室胶带或胶带轻柔去除残留毛发，以确保手术区域清洁。通过依次用70%乙醇、碘酒擦拭剃须区域，最后用70%乙醇用高压消毒棉球消毒手术部位。
4. 找到股骨，在大腿中部位置，距离股骨约~1毫米，平行于股骨，切开约1.0厘米（范围0.8-1.2厘米）的小皮肤切口。
   1. 轻轻后缩臀大肌，露出下面的股二头肌。然后，用剪刀尖轻轻分开股二头肌的前后头，不割开，露出坐骨切迹下方的坐骨神经。这些步骤是在直接目视观察下完成的，而非显微镜下。
5. 使用微小解剖产钳将坐骨神经拉出体外，以便进行坐骨神经手术（见图1A）。
   注意：用胶带固定产钳，防止其扩散超过一定程度，以减少对坐骨神经的损伤。将镊子尖端置于坐骨神经下方，利用小鼠大腿作为支点将坐骨神经向上抬起。注意只抬起有助于缝合所需的高度，避免施加张力或向外拉扯，因为过度拉伸会损伤轴突或周围结构。
6. 将显微镜对准暴露的坐骨神经。从此步骤开始，使用显微镜进行第15步（见图1A）。
7. 用10-0尼龙缝穿透坐骨神经两倍（见图1B，C）。进入第1-8步进行未切割控制。进入第1-11步进行神经截断。
   注：两处穿透点相距约一神经宽度（~0.7毫米），对称地位于预定截断部位的两侧。这种间距确保了近端和远端断桩的正确对齐，同时最大限度地减少病变处的机械应力。用缝线穿透坐骨神经中心，确保缝线的两个穿透点完全平行。10-0缝线较小，必须用超细镊子控制。采用非吸收的10-0尼龙是因为它在30天观察期内具有极佳的拉伸稳定性和极低的组织反应性。该材料广泛应用于小鼠和大鼠的显微外科神经修复模型中^18,31。未使用可吸收缝线，因为逐渐退化可能影响切断神经残端的排列，功能尚未完全恢复。为最大限度减少操作员差异，所有手术均由一名受过专业训练的外科医生在立体显微镜下进行大量显微手术后完成。“环前切断”方法进一步减少了变异性，无需在截断后进行神经作，从而确保动物间的一致排列和张力。这需要大量练习和高水平的控制能力。在进行动物手术前，初学者可能会发现使用细合成线（如牙线）练习缝合动作，有助于在立体显微镜下提升灵活性和控制力。
8. 小心地用尼龙缝线打个结。
9. 将暴露的坐骨神经置于肌肉层下方，并用4-0尼龙缝线闭合皮肤。
10. 确定10-0尼龙缝线双重穿透坐骨神经不会影响小鼠行为。
    注意：为证实这一点，接受双缝穿透但未截断的小鼠接受了实验组中使用的相同行为测试，包括针刺、足部缺陷不对称和脚趾外展。这些小鼠的满分持续相当于未手术的野生型对照组，表明单纯缝合手术未损害坐骨神经功能。
11. 用手术刀切断两条10-0尼龙缝之间的坐骨神经（见图1D）。
    注意：为最大限度减少变异性，所有手术均由同一位受过培训的实验者采用标准化程序进行。此外，“环前截断”设计本质上通过避免截断后神经处理，最大限度地减少了变异性，确保所有动物的缝合位置和张力一致。缝合线的位置通过解剖显微镜验证，以确保动物间的一致性。
12. 把产钳收起来。
13. 用不含氯化钙的Ca+游离磷酸盐缓冲生理盐水（PBS;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO_4，pH 7.4）冲洗切断神经。
    注意：用无钙PBS冲洗切断的神经残端约10-20秒，以清除血液并防止过早闭合。缝合应在1-2分钟内迅速完成，以保持对齐和组织活性。
14. 用纸巾吸收^Ca-2+游离PBS。
15. 小心地用尼龙缝线打结（见图1E）。如果没有计划或需要药物治疗，请进入第20步。
    注：显微缝合使用标准方结，由两根相对的拉结组成，用细镊子在立体显微镜下轻轻收紧。两条被缝线连接的断裂轴突恢复到接近原始形状。断裂血管的重新连接可以作为近端和远端神经断端正确对齐的视觉指示。手术过程中，组织应保持新鲜湿润，无发白或压迫。避免缝线绑得太紧，否则可能导致血管塌陷或神经变形。在打结前，确保神经末梢近似且无张力。如有需要，应轻柔地调整肢体位置，以促进自然对齐，避免拉扯神经，因为过度紧张可能增加神经瘤或纤维化的风险。
16. 用注射器将0.25微米的ML162在DMSO中稀释并注入PBS的坐骨神经上。让缝合的坐骨神经浸入药物中1分钟。
17. 用无菌棉签吸收ML162去除。
18. 将500毫米PEG放入预热至37°C的蒸馏水中，使用注射器将PEG注入缝合的坐骨神经。让缝合的坐骨神经浸入药物中1分钟。
    注意：500 mM的PEG是一种致密溶液，在作室温下可能凝固。作时将注射器放在加热垫上，确保PEG保持液态。PEG被认为通过去除相邻脂质双层之间的水分子，促进膜融合，从而实现膜的紧密接触和自发融合。尽管具体分子机制仍在研究中，但该方法已被证明有助于轴突连续性，并促进周围神经损伤模型的功能恢复。
19. 用纸巾吸收PEG去除。
20. 用含^Ca2+的PBS冲洗缝合神经（PBS补充1 mM CaCl₂;137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM 磷酸缓冲液，pH7.4）。
21. 用组织吸收含Ca²⁺的PBS，去除它。
22. 将暴露的坐骨神经置于肌肉层下方，并用4-0尼龙缝线闭合皮肤。
23. 动物从麻醉中恢复后，将它放回笼子。
    注：皮肤闭合后，手术部位使用含止痛药的外用抗生素软膏治疗。每只动物都会在加热垫上被监测，直到它们恢复足够的意识以维持胸骨卧姿。动物随后被单独安置，只有在运动功能完全恢复后才返回群体。尽管手术环境未在层流罩下维持，所有手术器械均进行了消毒，手术采用无菌技术，戴手套，使用无菌工具。

2. 行为测试 - 针刺

注意：评估受伤后高阈值机械敏感反应³³。

1. 把老鼠放在铁丝网网格里，让它自由活动30分钟，适应新环境。
2. 后爪跖面最外侧部分被划分为5个区域（A到E）。轻柔地将Austerlitz（000号）涂抹在同侧爪跖面。针刺从最侧的脚趾（A区）到脚跟（E区）各按了两次。
   注意：不要穿透皮肤。
   注意：当动物迅速将爪子从两个针刺刺激中移开时，反应被视为积极。这只老鼠在该区域被评为1级，然后在下一个区域进行了测试（最高5级）。如果没有任何申请获得积极回应，则整体成绩为0分。使用同一侧的隐膜区域作为阳性对照。它总会引发积极的回应。

3. 行为测试——足部失误（FF）不对称性

注：测量坐骨神经轴突支配更近端肌肉的能力，³⁴。

1. 让动物在笼子上高处的铁丝网格子上自由活动，以适应环境。其中一项试验包含每个后肢共50步。
2. 动物失误时得分。评分标准如下。
   评分1： 部分过错。在腿完全掉到大腿之前被拉回来。
   评分2： 完全是过错。完全掉到裆部。
3. 计算所有受伤和未受伤动物在每次术后时段的综合足部缺陷评分。
   综合脚部失误得分 = （# 部分失误 x 1） + （# 全失误 x 2）
4. 将复合足部骨折得分除以50（总步数/肢体），得到每个后肢的骨折百分比。
   % 脚踏 = 综合脚踏 评分 / 50（总步数）× 100%
5. 用完整后肢足部缺陷比例减去受伤后肢足部缺陷的比例，得出每只动物在术后时间点的不对称评分。
   足部失误（FF）不对称得分 = %FF（完整肢体）- %FF（受伤肢体）

4. 行为测试 - 脚趾外展

注意：评估神经损伤后的运动恢复情况。根据之前的研究，脚趾外展运动测试比步态分析更灵敏，用于检测坐骨神经损伤后运动功能的恢复情况³⁰。

1. 轻轻用布覆盖动物，抬起尾巴以便清晰观察后爪。
   注意：另一种方法：轻轻抓住老鼠的后颈，固定尾巴，把尾巴翻转，让老鼠扭动观察脚趾的动作。
2. 分脚评分如下：
   评分2： 全面展开。定义为所有脚趾完全、宽广且持续地展开至少2秒。
   评分1： 中间扩散。任何未达到满扩散分的移动。微微颤抖，或部分动作。
   评分0：无扩散。一点动静都没有。
   注：所有行为评估（针刺、脚趾骨折和脚趾外展）均由不涉及治疗组的实验者进行双重检查。根据我们之前研究（Ko等人²⁵）采用的设计，手术时随机分配动物到治疗组，该研究包括四种实验性条件（仅缝合、PEG、ML162、ML162+PEG）。本文呈现了ML162 + PEG组的数据，这些数据经过独立分析，同时保持了原始的实验严谨性。

5. 组织灌注与组织学处理

1. 对动物进行深度麻醉，并通过左心室进行磷酸盐缓冲盐水（PBS）经心灌注。
2. 切开右心房，使血液完全引流。
3. 将收集的组织浸泡在4%对甲醛（PFA）中，4°C过夜固定。
4. 用PBS洗涤固定组织三次，然后在PBS中以4°C孵育过夜。
5. 通过将组织浸泡在30%蔗糖中，4°C一夜进行冷冻保护。
6. 将组织嵌入OCT化合物中，冷冻后用低温容器以12微米厚度切片。
7. 组织块保存在-80°C，冷冻切割保存在-20°C，直到使用。
8. 仅进行坐骨神经采集时，省略灌注，因为血液含量对这些周围组织的免疫染色质量影响不大。

Results

之前的PEG融合方案¹⁸经过修改，以保持手术效果一致并减少缝合²⁵号线造成的神经损伤。通过在截断前将缝线穿透神经，可以最大限度地减少用镊子夹住或用针刺造成的损伤。为测试穿透神经的缝线绑扎对神经功能的影响，缝线穿过完整神经两次并打结（图2A，无SNT缝合）。术后30天检查穿透神经的缝线未形成瘢痕（图2A，无无神经接合线）。仅接受无超声线接合的小鼠在所有行为测试中均得分完美，表明神经穿透未影响神经功能（图3B、图4B和图5B）。

在之前的研究中，SNT/缝合术后...

Discussion

使用神经切断模型进行神经再生研究在小鼠坐骨神经上广泛进行^31,39。然而，由于其体积小且质地柔软，小鼠坐骨神经难以用手术器械轻柔处理，缝合时组织容易撕裂。微缝过程通常涉及过度作，可能导致神经变形和创伤。即使减少不必要的器械刺激，缝合神经的过度活动仍可能导致错位，影响早期功能恢复。这些变量影响了截断模型中实验结果的一致性和可靠性，凸显了需要一种确保重复性和最大限度减少神经损伤的外科手术方法。

该手术程序旨在控制变量，同时尽量减少外科医生的干预。在设计该手术时，考虑了以下因素：（1）尽量减少手术器械的使用，以减轻神经的压力。尽量避免用镊子夹住神经;（2）尽量减少缝合结的数量，因为打结也可能对神经造成足够的损伤;（3）尽量减少对外科医生手术技术的依赖。经过广泛评估，结论是神经损伤或变形最常见的原因是缝合时用器械拉扯断裂神经的外科手术。因此，采用了一种穿透并定位缝线再切割神经的方法，以消除用手术工具作神经的...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 镊子	杜莫斯塔尔-生物学	11295-51	每只手各一个。你需要两个人才能握住10-0尼龙缝线。
10-0尼龙缝线	DemeTECH	NL761000,4F0P
4-0尼龙缝线	矩阵巫师	0197
抗β-微管蛋白	R&D系统	MAB1195
反NF-200	米利波尔西格玛	N4142
奥斯特利茨尺寸000			对于针刺测试
CF488 共轭α-钾毒素	生物体	00005
解剖剪刀	肯特科学公司;
细缝剪刀	肯特科学公司;
虹膜钳	肯特科学公司;
K&H 小动物加热垫	K&H 宠物产品
ML162	米利波尔西格玛	SML2561
小鼠手术套件	肯特科学公司;
针架	肯特科学公司;
聚乙二醇（PEG）	米利波尔西格玛	P5413
SCG10	Novus生物制品	NBP1-49461
SomnoSuite	肯特科学公司;		用于异氟醚麻醉
分流钳			用来暴露坐骨神经。