肝细胞药物诱导的衰老促进M2型巨噬细胞极化：对酪氨酸激酶抑制剂相关肝毒性的启示

摘要

本研究通过SASP驱动的巨噬细胞极化，探讨拉帕替尼和奈拉替尼引起的肝毒性，从而在传统毒性检测之外提供更深入的作用机制理解。该方法揭示了衰老肝细胞如何影响免疫反应，对于评估药物的长期效应以及发现治疗药物性肝毒性的新靶点具有重要意义。

摘要

拉帕替尼（Lapatinib）和奈拉替尼（neratinib）是已被批准用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），但其临床应用因肝毒性而受限。在肝细胞内，细胞色素P450酶可将这些药物代谢为活性代谢产物，导致DNA损伤、线粒体功能障碍和氧化应激，从而引起肝细胞损伤。这种细胞应激可触发肝细胞衰老，即一种生长停滞状态，并伴随分泌一系列促炎因子和组织重塑因子，称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。SASP显著改变肝脏微环境，影响免疫细胞行为，并加剧组织损伤。我们发现，拉帕替尼和奈拉替尼可在HepG2肝细胞系中诱导细胞衰老及SASP的产生。此外，这些衰老细胞释放的SASP可促进RAW264.7巨噬细胞向M2样表型极化。尽管M2型巨噬细胞通常与抗炎反应和组织修复相关，但其过度或持续活化可能导致组织损伤和纤维化。我们的研究结果揭示了一种机制，即TKI诱导的肝细胞衰老及其SASP可调节免疫反应，并可能促成乳腺癌患者中的肝毒性。这凸显了靶向衰老细胞或SASP因子以减轻肝毒性、改善治疗效果的重要性，使得有效抗衰老药物（senotherapeutics）的发现成为一项关键的研究方向。目前尚无文献报道TKI诱导的肝细胞分泌组对巨噬细胞极化的影响。

引言

拉帕替尼（Lapatinib）和奈拉替尼（neratinib）均为小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），分别于2007年和2017年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗转移性乳腺癌¹。这些药物可抑制人表皮生长因子受体2（HER2）²，该受体是一种在某些乳腺癌中过表达的受体酪氨酸激酶³。尽管这些药物在临床上取得了一定成功，但拉帕替尼和奈拉替尼也与不良反应相关，尤其是肝毒性^4,5。在接受拉帕替尼或奈拉替尼治疗的患者中，约有14%会出现以转氨酶水平升高为表现的急性肝损伤⁶。这种肝毒性主要归因于药物在肝脏中的代谢过程，该过程涉及细胞色素P450（CYP）酶，尤其是CYP3A4/5^7,8。这些酶催化生成醌亚胺中间体，后者具有亲电性且高度反应活性^9,10。这些活性代谢产物包括O-去烷基化拉帕替尼、N-去烷基化拉帕替尼、N-羟基拉帕替尼、O-去烷基化奈拉替尼以及N-去甲基化奈拉替尼，可与细胞大分子形....

方案

1. 细胞培养

1. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖改良伊格尔培养基（MEM）培养HepG2细胞，使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养RAW264.7细胞，每3天更换一次培养基。
   注意：除非出现真菌或细菌污染，否则不建议使用抗生素。RAW264.7细胞生长迅速，应在2天后进行传代。

2. MTT 实验

1. 细胞计数与细胞铺板
   1. 在细胞培养箱中，使用完全培养基（MEM + 10% 胎牛血清）在60 mm培养皿中培养HepG2细胞。
   2. 当细胞融合度达到约80%时，移除培养基，用1 mL 1× PBS快速洗涤一次，加入600 μL 0.5×胰蛋白酶。孵育5–6分钟。
      注意：所有步骤均应在BSL-2级细胞培养柜中进行。
   3. 在BSL-2级生物安全柜内加入1.2 mL完全培养基以中和胰蛋白酶。
      注意：为防止过度消化，应加入相当于所加胰蛋白酶体积两倍的完全培养基。
   4. 将细胞悬液转移至5 mL微量离心管（MCT）中，在室温（RT）下以180 g（1000 rpm）离心3–4分钟，使细胞沉淀。
   5. 弃去上清液，用1 mL培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀形成单细胞悬液，并在显微镜下使用血....

结果

为评估酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼和奈拉替尼对肝细胞癌（HepG2）细胞的影响及其对巨噬细胞的下游旁分泌效应，开展了一系列实验。用不同浓度的拉帕替尼或奈拉替尼处理HepG2细胞，并在48小时后通过MTT法检测细胞活力（图1A、B）。根据存活曲线，选择2.5 µM的亚致死剂量用于后续实验。

该浓度能够显著诱导线粒体活性氧（ROS）水平升高，通过CellROX Deep Red染色得以显示，并经线粒体特异性染料MitoTracker Green共染色进一步证实（图2）。同时，通过检测SA-β-半乳糖苷酶活性以评估ROS相关的细胞衰老，结果显示处理后β-半乳糖苷酶活性显著增加（图3）。

讨论

本研究探讨了通过收集经酪氨酸激酶抑制剂（TKI）处理的HepG2肝细胞的条件培养基，拉帕替尼或奈拉替尼治疗对巨噬细胞极化的间接影响。利用RAW264.7巨噬细胞，我们观察到在条件培养基作用下，巨噬细胞呈现M2表型，表现为ARG1表达上调。形态学上，处理后的巨噬细胞呈现出典型的增大和拉长形状，进一步支持M2样状态的诱导。下文将讨论该实验方案的关键步骤、可能的修改、故障排除、局限性以及与现有方法的比较。

维持TKI的剂量和暴露时间的一致性至关重要，因为变异可能影响衰老程度及SASP的产生。准确测定ROS和SA-β-半乳糖苷酶活性对于确认衰老诱导至关重要^28,29。药物处理后必须进行充分洗涤和无血清孵育，以防止残留药物或血清因子污染，这些因素可能干扰巨噬细胞的后续效应^28,29。条件培养基（CM）与新鲜培养基的比例以及细胞暴露时间必须标准化，以确保极化结果.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HepG2细胞系	NCCS		贴壁细胞系
RAW264.7 细胞系	NCCS		贴壁细胞系
DMEM（Dulbecco改良型Eagle培养基）	Himedia	AT066	高葡萄糖，粉末
MEM（改良伊格尔培养基）	Gibco	611100-053	粉末
PBS（磷酸盐缓冲液）	Himedia	TS1101	粉末
胰蛋白酶-EDTA溶液	Himedia	TCL007	溶液
FBS（胎牛血清）	Himedia	RM1112	液体
MTT 染料	Himedia	TC191	粉末
拉帕替尼	Selleckchem	S2111	粉末
奈拉替尼	Cayman Chemical Company	18404	粉末
DMSO（二甲基亚砜）	Himedia	TC185	溶液
甲醛	Rankem	F0080	溶液
戊二醛	Sigma-Aldrich	340855	溶液
柠檬酸一水合物，纯品	Himedia	GRM229	粉末
无水磷酸氢二钠	Himedia	MB024	粉末
亚铁氰化钾，K4[Fe(CN)6]	Fisher Scientific	P-236-500
铁氰化钾，K3[Fe(CN)6]	Fisher Scientific	P-232-500
NaCl	SRL	41721	粉末
六水合氯化镁	Himedia	GRM-1068	粉末
X-Gal	SRL	45904	粉末
脂多糖	Sigma-Aldrich	L6529
人重组干扰素-γ	Himedia	CF040-20MCG
Cell ROX 深红试剂	Thermo Fisher Scientific	C10422
Hoechst	Invitrogen，赛默飞世尔科技	H3570	粉末
MitoTRACKER Green	Invitrogen，Thermo Fisher Scientific	1842298	粉末
抗ARG1抗体	亲和力	DF6657	溶液，计算分子量-35 kDa，观察分子量-65 kDa
抗NOS2抗体	Cloudo Clone Corp.	PAA837Hu01	溶液，计算分子量-130 kDa，观察分子量-65 kDa
抗iNOS抗体	亲和力		溶液，计算分子量-130kDa，观察分子量-120kDa
抗GAPDH抗体	Biobharati LifeScience Pvt. Ltd	BB-AB0060	溶液
抗兔抗体	Cayman Chemical Company	10004301	溶液
硝酸纤维素膜	默克密理博有限公司	HATF00010（产品编号）
femtoLUCENTTMPLUS HRP	G Bioscience	786-003
60 mm 培养皿	NUCK	150462
96孔板,	NUCK	165306
细胞培养箱	赛默飞世尔科技	371
显微镜	1. LEICA 倒置显微镜   2. 尼康共聚焦显微镜	1. DMIL LED     2. Ti2E，A1R	两者均为型号编号
iBright 成像系统	Invitrogen，赛默飞世尔科技	CL1500（型号）
酶标仪	Bio-RAD	iMark 微孔板读数仪
离心	赛默飞世尔科技	Sorvall ST 8R（型号）