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方法文章

肝细胞药物诱导的衰老促进M2型巨噬细胞极化：对酪氨酸激酶抑制剂相关肝毒性的启示

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DOI：

10.3791/68725

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2025年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

本文内容

摘要

本研究通过SASP驱动的巨噬细胞极化，探讨拉帕替尼和奈拉替尼引起的肝毒性，从而在传统毒性检测之外提供更深入的作用机制理解。该方法揭示了衰老肝细胞如何影响免疫反应，对于评估药物的长期效应以及发现治疗药物性肝毒性的新靶点具有重要意义。

摘要

拉帕替尼（Lapatinib）和奈拉替尼（neratinib）是已被批准用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），但其临床应用因肝毒性而受限。在肝细胞内，细胞色素P450酶可将这些药物代谢为活性代谢产物，导致DNA损伤、线粒体功能障碍和氧化应激，从而引起肝细胞损伤。这种细胞应激可触发肝细胞衰老，即一种生长停滞状态，并伴随分泌一系列促炎因子和组织重塑因子，称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。SASP显著改变肝脏微环境，影响免疫细胞行为，并加剧组织损伤。我们发现，拉帕替尼和奈拉替尼可在HepG2肝细胞系中诱导细胞衰老及SASP的产生。此外，这些衰老细胞释放的SASP可促进RAW264.7巨噬细胞向M2样表型极化。尽管M2型巨噬细胞通常与抗炎反应和组织修复相关，但其过度或持续活化可能导致组织损伤和纤维化。我们的研究结果揭示了一种机制，即TKI诱导的肝细胞衰老及其SASP可调节免疫反应，并可能促成乳腺癌患者中的肝毒性。这凸显了靶向衰老细胞或SASP因子以减轻肝毒性、改善治疗效果的重要性，使得有效抗衰老药物（senotherapeutics）的发现成为一项关键的研究方向。目前尚无文献报道TKI诱导的肝细胞分泌组对巨噬细胞极化的影响。

引言

拉帕替尼（Lapatinib）和奈拉替尼（neratinib）均为小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI），分别于2007年和2017年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗转移性乳腺癌1。这些药物可抑制人表皮生长因子受体2（HER2）2，该受体是一种在某些乳腺癌中过表达的受体酪氨酸激酶3。尽管这些药物在临床上取得了一定成功，但拉帕替尼和奈拉替尼也与不良反应相关，尤其是肝毒性4,5。在接受拉帕替尼或奈拉替尼治疗的患者中，约有14%会出现以转氨酶水平升高为表现的急性肝损伤6。这种肝毒性主要归因于药物在肝脏中的代谢过程，该过程涉及细胞色素P450（CYP）酶，尤其是CYP3A4/57,8。这些酶催化生成醌亚胺中间体，后者具有亲电性且高度反应活性9,10。这些活性代谢产物包括O-去烷基化拉帕替尼、N-去烷基化拉帕替尼、N-羟基拉帕替尼、O-去烷基化奈拉替尼以及N-去甲基化奈拉替尼，可与细胞大分子形成共价加合物，从而破坏正常的细胞功能，最终导致肝损伤11。

拉帕替尼和奈拉替尼的活性代谢产物还可诱导氧化应激，而氧化应激是细胞衰老的关键触发因素12。细胞衰老是一种生长停滞但代谢活跃的状态，其特征是分泌多种促炎性细胞因子、生长因子和蛋白酶。这种分泌表型被称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）13,14,15。SASP 可显著影响周围微环境，通常促进炎症反应和组织重塑。在癌症治疗背景下，SASP 可富集肿瘤干细胞群体，并改变免疫反应以利于肿瘤存活16。此外，促炎性细胞因子可能加剧组织损伤。我们推测，在接受拉帕替尼和奈拉替尼治疗的患者中，肝损伤部分归因于酪氨酸激酶抑制剂（TKI）诱导的细胞衰老及促炎性 SASP 的产生。

我们的实验表明，拉帕替尼和奈拉替尼可诱导肝细胞产生活性氧（ROS），导致DNA损伤和线粒体功能障碍，进而引发细胞衰老。这种衰老可能通过释放SASP因子影响巨噬细胞极化，从而导致拉帕替尼/奈拉替尼诱导的肝毒性。

巨噬细胞在免疫反应中发挥关键作用，其功能表型可因不同刺激而发生转变17,18。经典的M1型巨噬细胞通常与促炎反应相关，包括产生TNF-α和IL-1β等细胞因子，通常被视为急性炎症的标志19,20。相比之下，M2型巨噬细胞与纤维化、组织修复21、免疫抑制以及对慢性炎症的反应相关22,23。衰老相关分泌表型（SASP）中的炎症细胞因子可影响巨噬细胞的极化，促进M1型巨噬细胞向M2样表型转化23。这种极化状态的转变可能对免疫微环境产生重要影响，导致免疫抑制、肿瘤进展以及组织结构的重塑。

为了研究拉帕替尼和奈拉替尼诱导的巨噬细胞极化，我们采用了RAW264.7细胞系，这是一种在免疫学研究中常用的鼠源性类巨噬细胞系24,25。RAW264.7细胞来源于BALB/c小鼠，广泛用于炎症、吞噬作用及免疫应答的研究25。该细胞系可对多种刺激物（包括脂多糖（LPS））产生反应，因此在研究巨噬细胞功能、细胞因子产生以及肿瘤生物学方面具有重要价值26。在本研究中，使用拉帕替尼和奈拉替尼处理人肝癌细胞系HepG2，以模拟患者中观察到的肝毒性效应。由于HepG2细胞系具有人类来源和肝细胞癌谱系的特点，常被用作药物代谢和肝毒性研究的模型27。在使用酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）处理HepG2细胞后，收集条件培养基并将其加入RAW264.7细胞中。随后监测巨噬细胞的表型变化，重点关注该处理是否诱导巨噬细胞从促炎性的M1表型向免疫抑制性的M2表型转变。

药物诱导的肝毒性通常通过细胞毒性检测、炎症标志物评估以及动物模型来研究。与这些方法相比，我们通过衰老相关分泌表型（SASP）因子及其对巨噬细胞极化的影响来检测酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼（lapatinib）和奈拉替尼（neratinib）诱导的肝毒性，具有多项优势。首先，我们的方法建立了药物诱导的衰老肝细胞所产生的SASP因子与先天免疫之间的联系，这一联系可进一步延伸至组织重塑、慢性炎症及致癌过程28,29,30,31。传统的毒性筛查方法无法捕捉肝脏与免疫细胞之间的短期相互作用，也无法揭示酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在长期药物暴露背景下对肝炎症和纤维化的长期影响。当结合适当的蛋白质组学方法以鉴定SASP组分时，该技术有助于识别TKI诱导肝毒性的预测性生物标志物，并为设计减轻该毒性的治疗干预措施提供依据29,30,31。

在实施过程中，研究人员应采用如上所述的肝细胞与免疫细胞系共培养或条件培养基系统，并评估衰老相关生物标志物以及M1和M2型巨噬细胞。该方法最适合用于评估药物诱导的急性或慢性肝损伤，或用于探索减少癌症治疗脱靶效应的策略29,30,31。

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方案

1. 细胞培养

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖改良伊格尔培养基（MEM）培养HepG2细胞，使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养RAW264.7细胞，每3天更换一次培养基。
    注意：除非出现真菌或细菌污染，否则不建议使用抗生素。RAW264.7细胞生长迅速，应在2天后进行传代。

2. MTT 实验

  1. 细胞计数与细胞铺板
    1. 在细胞培养箱中，使用完全培养基（MEM + 10% 胎牛血清）在60 mm培养皿中培养HepG2细胞。
    2. 当细胞融合度达到约80%时，移除培养基，用1 mL 1× PBS快速洗涤一次，加入600 μL 0.5×胰蛋白酶。孵育5–6分钟。
      注意：所有步骤均应在BSL-2级细胞培养柜中进行。
    3. 在BSL-2级生物安全柜内加入1.2 mL完全培养基以中和胰蛋白酶。
      注意：为防止过度消化，应加入相当于所加胰蛋白酶体积两倍的完全培养基。
    4. 将细胞悬液转移至5 mL微量离心管（MCT）中，在室温（RT）下以180 g（1000 rpm）离心3–4分钟，使细胞沉淀。
    5. 弃去上清液，用1 mL培养基重悬细胞沉淀，吹打混匀形成单细胞悬液，并在显微镜下使用血细胞计数板进行计数。
    6. 随后，在96孔板中每孔接种5000–7000个HepG2细胞，每种药物浓度设三个复孔，加入完全培养基，在培养箱中继续培养12–16小时。
      注意：药物处理时细胞融合度应为50–60%，此步骤应在超净台内进行。
  2. 药物处理
    1. 在超净台内，将拉帕替尼和奈拉替尼从原液浓度（分别为30 mM和3.5 mM）用二甲基亚砜（DMSO）逐步稀释成工作浓度。最终在生长培养基（MEM + 5% FBS）中的浓度分别为：拉帕替尼1、2.5、5、10、15、25、50 µM；奈拉替尼1、2、3、4、5、6、10 µM。每种药物均设一个无处理对照组。
    2. 弃去含细胞的96孔板中原有培养基，每孔加入100 µL含药物的培养基，在培养箱中孵育48小时。
  3. 染色与定量
    1. 孵育48小时后，向每孔加入10 µL MTT染料（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐；5 mg/mL），溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS），在培养箱中继续孵育至少2小时，直至出现紫色结晶。
      注意：直接将染料加入含药物的培养基中，且细胞与染料孵育时间不得超过4小时。
    2. 孵育结束后，移除染料，每孔加入100 µL DMSO溶解结晶，孵育15分钟后，在595 nm波长下测定光密度（OD）。
      注意：此步骤可在超净台外进行。

3. SA-β-半乳糖苷酶检测

  1. 药物处理
    1. 将HepG2细胞以每皿40 x 104 个细胞的密度接种于35 mm培养皿中，共设三组：一组用于拉帕替尼处理，一组用于来那替尼处理，另一组作为未处理对照组。
      注：细胞计数与接种步骤同2.1步骤所述。
    2. 从5 mM工作液中加入1 µL拉帕替尼，从3.5 mM母液中加入1.43 µL来那替尼至2 mL培养基中，使拉帕替尼和来那替尼的终浓度均为2.5 µM（亚致死剂量）。
      注：亚致死药物剂量根据MTT实验中的细胞存活曲线选定。
    3. 移除培养皿中原有培养基，用500 µL 1x PBS快速洗涤一次，加入含药培养基（在超净台内操作），置于培养箱中孵育48 h。
  2. 固定与染色
    1. 孵育48 h后，移除药物，用500 µL 1x PBS快速洗涤一次，随后加入1.5 mL含2%甲醛和0.2%戊二醛的1x PBS固定液，在室温下固定10 min。
    2. 固定完成后，用1 mL 1x PBS洗涤两次，确保彻底去除固定液。加入1.5 mL染色液（40 mM柠檬酸钠/磷酸钠缓冲液，5 mM K4[Fe(CN)6]，5 mM K3[Fe(CN)6]，150 mM NaCl，2 mM MgCl2，1 mg/mL X-gal溶于高压灭菌水），在37 °C无CO2条件下孵育8 h。
      注：孵育时间可根据细胞类型调整；对于HepG2细胞，孵育时间不应超过8 h。
    3. 染色完成后，用1 mL 1x PBS快速洗涤两次，使用倒置荧光显微镜在20x和40x放大倍数下采集明场图像。每组处理至少采集四至五个视野图像。
      注：固定液和染色液体积需根据培养皿大小调整；所有步骤可在超净台外进行。
  3. 图像定量分析
    1. 选取一个视野的图像，手动计数总细胞数及呈蓝色信号的细胞数，计算蓝色信号阳性细胞的百分比。至少分析四张图像，取平均值，绘制于电子表格图表中，并进行t检验。

4. 活性氧检测

  1. 细胞铺板与药物处理
    1. 将HepG2细胞以每皿40 × 104 个细胞的密度接种于35 mm玻璃底培养皿中，共设三组：一组用于拉帕替尼处理，一组用于奈拉替尼处理，另一组为未处理对照组。
      注意：细胞计数与铺板步骤同2.1步骤所述。
    2. 采用与3.1步骤中相同的处理策略。
  2. 染色与成像
    1. 处理48小时后，在培养皿中加入2 µM细胞ROX深红染料（5 mM母液）和1 µM MitoTracker Green（1 mM母液），染色30分钟，并用500 nM Hoechst核染色染料（500 µM母液）进行复染。
      注意：染料应在生物安全柜内添加，避免直接暴露于光照下。复染是指在加入其他染料的同时加入Hoechst核染色染料。
    2. 30分钟后移除染料，用1×PBS洗涤以去除多余染料，然后使用共聚焦显微镜在100倍放大倍数下成像（油镜，激发波长分别为640 nm、488 nm和405 nm）。
  3. 图像定量分析
    1. 使用Fiji ImageJ软件对细胞ROX红色荧光信号进行定量，并与未处理对照组的信号进行比较。利用MitoTracker Green信号确认荧光来源于线粒体。在绘制平均值柱状图后，进行t检验。

5. 条件培养基（CM）的收集

  1. 用 2.5 µM 的拉帕替尼（lapatinib）或奈拉替尼（neratinib）处理 HepG2 细胞，处理 48 小时（处理策略与步骤 3.1 类似，但本实验需在 60 mm 培养皿中接种 70 × 104 个细胞）。
  2. 48 小时后，移除药物，并用 500 µL 的 1× PBS 洗涤一次。
  3. 在细胞衰老达到最大程度时（即药物处理 48 小时后），向药物处理组细胞及未处理的对照组细胞中分别加入 4 mL 无血清 MEM 培养基（不含 FBS 或其他任何添加剂），继续培养 48 小时。
    注意：无血清培养基的体积需根据培养皿大小进行调整。
  4. 随后，收集含有全部分泌组分的无血清培养基，称为条件培养基（conditioned media），并于 -80 °C 保存以备后续使用。
    注意：收集条件培养基（CM）后，应以 2800 g（4000 rpm）离心 5 分钟，以去除死细胞及其他细胞碎片。RAW264.7 细胞通常在 DMEM 中培养，但条件培养基需根据 HepG2 的培养条件在 MEM 中收集。为保持兼容性，在用于 RAW264.7 细胞孵育前，应将条件培养基与无血清 DMEM 按 1:1 比例混合。

6. RAW264.7细胞中M1/M2型极化

  1. 细胞铺板
    1. 按照步骤2.1所述进行细胞计数和铺板操作，但省略胰酶消化步骤。在消化RAW264.7细胞时，加入600–700 µL的0.5×胰酶溶液，在培养箱中孵育15–20分钟；为中和胰酶，加入2 mL生长培养基（DMEM + 10% FBS），并将70 × 104个细胞分别接种至三个60 mm培养皿中：拉帕替尼组、奈拉替尼组及一个未处理对照组。
  2. RAW264.7细胞诱导
    1. 移除常规生长培养基，用1 mL 1× PBS洗涤一次，然后加入相应的条件培养基（CM）处理48小时。
      注意：在加入条件培养基前，需将其与无血清DMEM按1:1比例混合，因为RAW264.7细胞在DMEM中生长，若将细胞长期置于MEM中会引起应激反应，可能影响实验结果。将RAW264.7细胞在无血清条件培养基中培养48小时也可能导致细胞应激；在此情况下，可在收集数据前将孵育时间缩短至24–30小时。
    2. 孵育结束后，弃去条件培养基，用1 mL 1× PBS洗涤，每皿加入600 µL胰酶溶液，孵育10分钟，随后在室温下以180 g（1000 rpm）离心3分钟收集细胞沉淀。所得沉淀可用于蛋白纯化，或保存于-80 °C以备后续使用。
      注意：胰酶消化时间因细胞类型而异，离心力不建议超过180 g。
  3. 蛋白提取与Western印迹
    1. 通过将放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液与蛋白酶抑制剂混合液按100:1比例混合配制裂解缓冲液。将裂解缓冲液加入细胞沉淀中，重悬后冰上孵育30分钟。
      注意：裂解缓冲液体积需根据细胞沉淀量调整，裂解操作可在超净台外进行。若沉淀物保存于-80 °C，应先在冰上解冻，短暂离心后去除残留培养基。
    2. 孵育结束后，在4 °C下以20,000 g离心30分钟，收集上清液用于Western印迹分析，或保存于-20 °C以备后续使用。
    3. 取35–40 µg蛋白样品，加入1×上样缓冲液，在95 °C加热5–6分钟，使用10%和12%丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳（90 V），随后转移至硝酸纤维素膜。
    4. 注意：有关Western印迹的更详细信息，请参见Joubert等人的研究32。
    5. 使用辣根过氧化物酶（HRP）显影液，分别通过抗NOS2和抗ARG1抗体检测M1和M2极化标志物iNOS（M1）和精氨酸酶1（M2）的表达水平。
      注意：两种一抗（抗NOS2和抗ARG1）的稀释比例均为1:1000，二抗（抗兔抗体）稀释比例为1:10,000。
  4. 使用LPS和IFN-γ诱导巨噬细胞极化
    1. 将70 × 104个RAW264.7细胞接种于两个60 mm培养皿中。
      注意：铺板操作同步骤6.1。
    2. 12–16小时后，将4 µL浓度为1 µg/mL的脂多糖（LPS，储存液浓度为1 mg/mL）与1.33 µL浓度为33 ng/mL的干扰素-γ（IFN-γ，储存液浓度为100 µg/mL）加入4 mL生长培养基（DMEM + 10% FBS）中混匀，添加至已铺好的RAW264.7细胞中，保留一组作为未诱导对照。
    3. 48小时后，通过胰酶消化收集细胞沉淀，提取蛋白，进行Western印迹分析，并分别使用抗iNOS和抗ARG1抗体检测iNOS（M1）和ARG1（M2）的表达水平。
      注意：所有细胞培养废弃物和生化废弃物均应放入生物危害废物桶中，经适当高压灭菌后妥善处理。

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结果

为评估酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼和奈拉替尼对肝细胞癌（HepG2）细胞的影响及其对巨噬细胞的下游旁分泌效应，开展了一系列实验。用不同浓度的拉帕替尼或奈拉替尼处理HepG2细胞，并在48小时后通过MTT法检测细胞活力（图1A、B）。根据存活曲线，选择2.5 µM的亚致死剂量用于后续实验。

该浓度能够显著诱导线粒体活性氧（ROS）水平升高，通过CellROX Deep Red染色得以显示，并经线粒体特异性染料MitoTracker Green共染色进一步证实（图2）。同时，通过检测SA-β-半乳糖苷酶活性以评估ROS相关的细胞衰老，结果显示处理后β-半乳糖苷酶活性显著增加（图3）。

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讨论

本研究探讨了通过收集经酪氨酸激酶抑制剂（TKI）处理的HepG2肝细胞的条件培养基，拉帕替尼或奈拉替尼治疗对巨噬细胞极化的间接影响。利用RAW264.7巨噬细胞，我们观察到在条件培养基作用下，巨噬细胞呈现M2表型，表现为ARG1表达上调。形态学上，处理后的巨噬细胞呈现出典型的增大和拉长形状，进一步支持M2样状态的诱导。下文将讨论该实验方案的关键步骤、可能的修改、故障排除、局限性以及与现有方法的比较。

维持TKI的剂量和暴露时间的一致性至关重要，因为变异可能影响衰老程度及SASP的产生。准确测定ROS和SA-β-半乳糖苷酶活性对于确认衰老诱导至关重要28,29。药物处理后必须进行充分洗涤和无血清孵育，以防止残留药物或血清因子污染，这些因素可能干扰巨噬细胞的后续效应28,29。条件培养基（CM）与新鲜培养基的比例以及细胞暴露时间必须标准化，以确保极化结果...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Shiv Nadar卓越机构提供的基础设施支持。本研究由科学技术部资助，项目编号为CRG/2022/003242。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HepG2细胞系NCCS贴壁细胞系
RAW264.7 细胞系NCCS贴壁细胞系
DMEM（Dulbecco改良型Eagle培养基）HimediaAT066高葡萄糖，粉末
MEM（改良伊格尔培养基）Gibco611100-053粉末
PBS（磷酸盐缓冲液）HimediaTS1101粉末
胰蛋白酶-EDTA溶液HimediaTCL007溶液
FBS（胎牛血清）HimediaRM1112液体
MTT 染料HimediaTC191粉末
拉帕替尼SelleckchemS2111粉末
奈拉替尼Cayman Chemical Company18404粉末
DMSO（二甲基亚砜） HimediaTC185溶液
甲醛 RankemF0080溶液
戊二醛Sigma-Aldrich340855溶液
柠檬酸一水合物，纯品HimediaGRM229粉末
无水磷酸氢二钠 HimediaMB024粉末
亚铁氰化钾，K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-236-500
铁氰化钾，K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific P-232-500
NaClSRL41721粉末
六水合氯化镁HimediaGRM-1068粉末
X-GalSRL45904粉末
脂多糖Sigma-AldrichL6529
人重组干扰素-γHimediaCF040-20MCG
Cell ROX 深红试剂Thermo Fisher ScientificC10422
HoechstInvitrogen，赛默飞世尔科技H3570粉末
MitoTRACKER GreenInvitrogen，Thermo Fisher Scientific1842298粉末
抗ARG1抗体亲和力DF6657溶液，计算分子量-35 kDa，观察分子量-65 kDa
抗NOS2抗体Cloudo Clone Corp.PAA837Hu01溶液，计算分子量-130 kDa，观察分子量-65 kDa
抗iNOS抗体亲和力溶液，计算分子量-130kDa，观察分子量-120kDa
抗GAPDH抗体Biobharati LifeScience Pvt. LtdBB-AB0060溶液
抗兔抗体Cayman Chemical Company10004301溶液
硝酸纤维素膜 默克密理博有限公司 HATF00010（产品编号）
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
60 mm 培养皿NUCK150462
96孔板, NUCK165306
细胞培养箱 赛默飞世尔科技371
显微镜 1. LEICA 倒置显微镜   2. 尼康共聚焦显微镜 1. DMIL LED     2. Ti2E，A1R 两者均为型号编号
iBright 成像系统Invitrogen，赛默飞世尔科技CL1500（型号）
酶标仪Bio-RADiMark 微孔板读数仪
离心 赛默飞世尔科技Sorvall ST 8R（型号）

参考文献

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

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