本研究介绍了一种运行Pathway2Targets算法的实验方案，该算法是一个R语言脚本，可根据批量RNA测序实验中病例组与对照组样本间细胞内信号通路谱的比较结果，预测并筛选潜在的治疗靶点。
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本文内容
摘要
摘要
本方案概述了一个多步骤的计算流程，用于从RNA测序数据中识别潜在的治疗靶点，包括相关软件的安装、环境配置验证，以及使用edgeR进行差异表达分析。随后，我们展示了如何利用信号通路影响分析（SPIA）算法来预测具有统计学意义的通路。为确保结果的可靠性，我们重点关注显著性通路（p < 0.05），以减少假阳性结果。与传统的基因集不同，这些通路反映了蛋白质-蛋白质相互作用网络，能够为细胞周期、免疫应答和代谢等细胞过程提供机制性见解。随后，利用Pathway2Targets算法对这些通路进行分析，该算法通过应用程序编程接口（API）与OpenTargets.org数据库对接。该算法采用一种新颖的加权方法，对已知药物靶点在所识别通路中的重要性进行评分，并实时提供分析进度。运行时间取决于通路的复杂性和靶点密度。输出结果包含两个排序文件：第一个文件列出了预测的药物靶点及其加权评分，第二个文件则包含相关治疗药物的多种详细信息。该流程整体上有助于在疾病特异性基因表达谱背景下，对可成药靶点和治疗方案进行优先排序。
引言
大规模RNA测序能够比较病例细胞群体与对照细胞群体中数千个基因的表达水平。实验通常设计为至少包含三个重复样本，理想情况下为生物学重复，但技术重复亦可满足要求。该设计可考虑生物学变异性，并降低离群样本的影响。对这些表达模式的分析可深入了解目标疾病对正常细胞过程的影响，并可能有助于预测相关治疗药物。
批量RNA测序数据的预处理通常包括：对测序读段进行质量控制（重复序列、测序接头、GC含量等）、读段修剪与接头去除、读段比对/定量1,2,3，以及差异表达分析4,5,6。幸运的是，已有多种分析流程实现了自动化，以减少这些步骤中所需的手工操作7,8,9。预处理完成后，常见的下游分析通常包括基因本体功能富集分析、信号通路富集分析以及剪接变异分析。这些下游分析能够对差异表达结果进行更高层次的归纳，相较于单纯的基因列表，更有利于结果的解释。....
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方案
本研究中分析的批量RNA测序数据来自公开可用的数据库（NCBI基因表达综合数据库和序列读取档案）25,26。因此，原始数据收集者确保了这些样本来自知情并同意的受试人类个体，且采集过程符合伦理规范。
1. 下载并安装 R 软件
- 安装 R（版本 4.0 或更高版本），方法是从综合 R 存档网络（CRAN）https://cran.r-project.org/mirrors.html 选择合适的链接并点击 选择选项 0-Cloud，然后根据计算机的操作系统遵循相应的说明。此过程通常需要 5-10 分钟。
- 从 https://posit.co/download/rstudio-desktop/ 安装 R Studio（版本 2024 或更高版本），然后按照下载页面上的说明进行操作。安装 RStudio 通常需要约 10 分钟。
注意：安装 RStudio 是可选操作（但强烈推荐），因为它提供了一个集成开发环境，可简化代码执行、提供语法高亮、便于包管理，并帮助用户可视化输出结果，这对于不熟悉 R 的用户尤为有益。
2. 下载并安装相关工具的 R 脚本
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结果
方案中第1-3步所述的设置对于后续执行SPIA和Pathway2Targets算法是必要的。每一步结束时，系统将生成一条消息，以确认软件已成功安装。第4步包括下载现有的差异表达结果集，这些结果可以是提供的示例文件、其他现有文件，或预处理自定义的RNA测序数据集。第4步的主要要求是工作流程使用edgeR作为差异表达分析算法，并将结果存储为rds文件中的SingleCellExperiment对象。
使用SPIA算法预测具有统计学意义的细胞内信号通路（补充代码文件1 和 补充代码文件2；约130行代码）在步骤5中进行描述。运行后，该算法通过实时日志显示当前正在计算的通路（图2），表明算法正在正常运行。尽管许多SPIA分析可在约1小时内完成，但实际所需时间取决于差异表达基因（DEG）的数量、自举重复次数及其他因素。表1展示了SPIA输出文件（补充表1）的部分内容，列出了相关p值<0.05的.......
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讨论
本方案的第1-3步专门涉及安装底层R软件、脚本和依赖项，以成功运行下游软件。所需R软件包的详细列表见（补充表4）。方案的第4步涉及获取一个R数据文件（.rds格式），该文件包含差异表达分析的结果输出。常用的软件包括edgeR6、DESeq24和limma5。我们构建的工作流程兼容以rds格式输出的edgeR结果，所用参数如下：使用每百万序列的对数2计数进行标准化（log = TRUE），在标准化中考虑转录本长度偏移量（offset = dge0$offset），设定保留基因的过滤条件（min.count = 10），设定在所有样本中保留基因的过滤条件（min.total.count = 15），离散估计方法（trend.method = "locfit"），以及模型（glmQLFit）。目前已有多种计算工作流程可用于预处理RNA测序读段或读段计数文件，并生成edgeR输出，包括Galaxy平台27以.......
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披露
BEP 持有 Pythia Biosciences 的股权。本研究未获得外部资金支持。
致谢
我们感谢杨百翰大学研究计算办公室在访问校园高性能计算环境期间提供的专业知识和支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Pathway2Targets R 脚本 | Brigham Young University（Pickett 实验室） | 版本 3.1 | https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R |
| R 软件 | 综合 R 存档网络（CRAN） | 版本：4.4.3 | https://cran.r-project.org |
| R Studio Desktop 软件 | posit | 版本：2024.12.1+563 | https://posit.co/download/rstudio-desktop/ |
| SPIA R 脚本 | Brigham Young University（Pickett 实验室） | 版本：3.1 | https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd |
参考文献
- Dobin, A., et al. Ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with hisat2 and hisat-genotype. Nat Biotechnol. 37 (8), 907-915 (2....
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