使用水培 14C 放射性标记测定和荧光粉成像监测植物组织中有机化合物的摄取和定位

摘要

本文概述了一种使用 ¹⁴种 C 标记的有机污染物研究植物介导的修复方法。它描述了水培植物制备、放射性标记摄取和荧光粉成像，以跟踪污染物的吸收、易位和代谢。该技术为评估各种植物物种和环境污染物的植物修复潜力提供了宝贵的工具。

摘要

植物修复，即使用植物来减轻环境污染物，为清洁受污染场地提供了一种可持续且具有成本效益的方法。开发有助于阐明植物吸收和污染物代谢背后机制的方法对于改进植物修复实践至关重要。本文介绍了一种使用放射性标记化合物评估植物对有机污染物的吸收和转化的方法。 ¹⁴C 标记的有机化合物，例如 ¹⁴型 C-环烷酸，用于追踪它们在植物组织中的吸收、易位、定位和代谢。我们之前曾将这种方法用于多种植物物种，包括 Elymus trachycaulus 和 Salix inside。这些观察结果在这里得到了模型植物拟 南芥的证实，该植物在改良的霍格兰溶液中水培生长。通过液体闪烁计数和荧光粉成像 监测 放射性标记摄取，从而可以可视化和定量植物组织内的放射性标记化合物。该方法详细介绍了植物材料的制备、放射性标记化合物的使用以及分析植物内污染物的分布和去向的过程。该方法还包括评估化合物渗出的策略，并允许评估植物对环境污染物的吸收和易位。这种方法提供了对植物介导的修复过程的深入了解，并可应用于各种环境污染物和植物物种的研究。

引言

生物修复是一种由植物和微生物等生物实体介导的修复技术。植物修复使用植物或植物产品从环境中去除污染物，可以补充或作为基于微生物的修复的替代方案，克服单独使用微生物的一些局限性1,2,3,4。植物修复是具有成本效益的，因为植物采用太阳能驱动的过程，污染物通过其根或芽被吸收，并在细胞和组织之间运输，在那里它们可以被代谢、隔离或挥发⁵。植物修复最有效的植物通常是具有弹性、耐逆性的物种，具有高蒸腾速率、快速生物质生产和深根系，例如在杨属和柳属⁶ 中发现的植物。作为固着生物，植物已经进化出不同的代谢途径来处理环境中的有毒化合物¹。这赋予了它们广泛的基因和生化过程，增强了它们管理污染物的能力。

植物降解框架首先由Sandermann等人（1977）⁷提出，概述了植物介导的污染物解毒的三阶段过程：转化、共轭和区室化。在每一阶段，污染物都会经历酶促修饰，从而增加其亲水性，降低其毒性，并使其更易于螯合或进一步矿化⁴。然而，由于植物主要依靠大气中的二氧化碳进行碳固定，因此它们将有机污染物完全矿化的能力可能有限。相反，污染物可能被封存在液泡或细胞壁中（植物螯合）或挥发到大气中（植物挥发）¹。

植物修复研究的一个关键挑战是检测植物是否可以从环境中吸收和转化有机污染物¹。传统的检测方法通常无法准确追踪污染物吸收和易位的途径，因此很难评估植物修复^{特定污染物的能力1,5}。放射性标记的碳 14 （¹⁴C） 有机化合物为这个问题提供了强大的解决方案。通过将植物暴露于 ¹⁴种 C 标记的污染物中，研究人员可以跟踪放射性标记碳掺入植物组织的情况，从而准确了解污染物的吸收、易位和转化。该技术能够识别能够修复特定有机污染物的植物物种，并提供一种可靠的方法来评估所涉及的生理途径。最终，^{使用 14}种 C 标记化合物增进了我们对植物修复潜力的理解，支持制定更有效、更有针对性的环境修复策略。

本文介绍了一种使用 ¹⁴种 C 放射性标记的有机污染物来监测植物从水培溶液中吸收、易位和去向的方法。最近的一篇出版物描述了一种类似的方法，用于跟踪 ¹⁴种 C 标记除草剂在叶面施用后的命运⁸。然而，这里描述的方法概述了如何评估水培溶液中放射性标记污染物的去除和易位，并评论了如何使该方法适应土壤的使用。

方案

注意：在继续执行本协议之前，请务必查阅相关机构和国家放射性同位素安全指南和法规。简而言之，处理所有放射性物质或任何可能与放射性同位素接触的东西，同时戴上双层手套、实验室外套和安全护目镜。该程序在实验室的专用空间中进行，用胶带标记含有放射性同位素的部分。此外，在所有程序后，立即清洁玻璃器皿和仪器，然后擦拭并通过闪烁计数 测试 它们是否存在污染放射性同位素。这些测定中使用的所有材料和液体也都处理在专用的放射性废物容器中，并按照卡尔加里大学和加拿大核安全委员会的指导方针妥善处理。

1. Hoagland 溶液的制备

1. 从商业混合物中制备 0.5 倍（半强度）Hoagland 溶液或从头开始制作培养基，由 0.5 mM NH₄H₂PO₄、3 mM KNO₃、2 mM Ca（NO₃）₂、1 mM MgSO₄、23 μM H₃BO₃、5 μM MnCl₂•4H₂O、400 nM ZnSO₄•7H₂O、 200 nM CuSO₄•5H₂O，70 nM H₂MnO₄•1H₂O，45 μM FeSO₄•7H₂O。
2. 加入MES或其他适当的缓冲液以达到10mM的最终浓度。
3. 将pH值调整到所需值（此处，pH值为5.0）。

2. 放射性标记溶液的制备

1. 将所需体积的 0.5x Hoagland 溶液（每次重复 50 mL）转移到干净的烧瓶中。
2. 将 0.1-0.26 kBq/mL 的放射性标记化合物加入 Hoagland 溶液中。
   注意：在本研究中，使用了溶解在甲醇中的 ¹⁴个C-AdCA（金刚烷-1-羧酸）。
3. 通过旋转烧瓶 2-3 分钟彻底混合。
4. 每次重复将 50 mL 放射性标记溶液等分到 125 mL 锥形瓶中。

3. 拟南芥 （ Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.） 植物准备

注意：水培种植拟南芥的方案详见Conn等人（2013）⁹。

1. 对于每株植物，用剪刀从标准 1.7 mL 微量离心管上取下盖子，并使用皮革打孔器在盖子中心刺穿一个直径为 3 mm 的孔。
2. 用胶带暂时密封瓶盖的顶部，并用含有0.8%琼脂的熔融0.5x Hoagland培养基填充瓶盖，然后放入改良的尖端盒（发芽罐）的盖子中（图1A）。
3. 通过在70%乙醇中连续洗涤10分钟，然后5分钟，然后在无菌滤纸上的流动罩中干燥拟南芥种子进行表面灭菌。
4. 通过微量离心机盖顶部打孔的孔将种子播种到琼脂培养基中。
5. 将种子在 4 °C 的尖端架中分层 2-4 天。
6. 在长日照条件下（16小时光照，8小时暗，~150μmol /^m，2秒光照和22°C）下将发芽罐移至生长室。
7. 用 0.5x Hoagland 溶液填充吸头架。
   注意：确保溶液接触琼脂以防止干燥。
8. 种植植物 2-3 周，根据需要（每 3-4 天）加满溶液，使琼脂与水培溶液保持接触。
9. 将菌盖和幼苗移植到直径为10毫米的开口中，该开口用钻头和钻锯钻头穿过50mL Falcon管盖的中心（图1B）。
10. 用直径为 30 毫米的钻锯钻头（成熟罐）在 10 升塑料手提袋盖上钻 12 个孔。
11. 将 Falcon 管盖放在手提袋顶部的开口上，使根部进入下面的手提袋。
12. 将气石附着在成熟罐的底部，并填充 Hoagland 溶液，直到根部大部分被淹没。
13. 将植物放回生长室并再生长 6-8 周（光照 16 小时，暗 8 小时，光照 ~150 μmol/m²秒，22 °C），直到莲座丛直径约为 10 厘米。

图 1：拟南芥发芽和成熟水培罐和 ¹⁴C-AdCA 处理容器。 （A）用于发芽拟南芥种子用于水培生长的发芽罐。（B）成熟罐中的拟南芥植物准备进行实验。（C）在实验过程中根浸没在 ¹⁴C-AdCA溶液中的拟南芥植物。50 mL烧瓶（ ¹⁴C处理容器）在暴露期间通常用铝箔（未显示）覆盖，以防止藻类生长。 请点击此处查看此图的大图。

4. 波罗的海灯心草 （Juncus balticus Willd. ） 植物准备

1. 在培养皿中以 4°C 将种子分层在两张湿滤纸之间，持续 1-2 周。
2. 取下顶部滤纸，将培养皿放入生长室中，在长日照条件下（光照16小时，暗8小时，光照²秒，22°C）1周。
3. 将幼苗移植到修饰的尖端架中，如拟南芥所述（步骤3.1-3.4）。
4. 植物生长 2-3 周（光照 16 小时，黑暗 8 小时，~150 μmol/m²秒光照和 22 °C），或直到根部长达 3-4 厘米。
5. 将植物移植到带有空气石的改良 10 L 手提袋中，填充 Hoagland 溶液直至根部大部分被淹没，并再生长 6-8 周（光照 16 小时，暗 8 小时，~150 μmol/m²秒光照和 22 °C）。

5. 沙洲柳（Salix interior Rowlee）小苗准备

注意：Alberts 等人 （2021）¹⁰ 描述了种植沙洲柳树小苗的方案。

1. 切下 10 厘米的茎插条（直径 5 毫米），并在室温下将其浸入 diH₂O 中过夜，以补水并刺激生根。
2. 将水合插条转移到装有 10 L 0.5x Hoagland 溶液的充气水培罐中，并生长 1 个月（光照 16 小时，暗 8 小时，光照¹⁵⁰μmol/m 2 秒光照和 22 °C）以建立根和芽生长。
   注意：每 2 周刷新一次 Hoagland 溶液，以防止小苗发育过程中营养缺乏。

6. 放射性同位素标记

1. 制备放射性标记溶液后，从溶液中收集100μL等分试样进行液体闪烁计数，以确定初始同位素浓度。
2. 轻轻吸干植物根部，并将 Falcon 管盖组件转移到 125 mL 锥形瓶（ ¹⁴C 处理容器）中，其中含有 0.5x Hoagland 溶液和步骤 2.4 中的 ¹⁴种 C 标记的有机化合物。
3. 在烧瓶上标记溶液液位，以确保在实验期间可以加满至起始体积，并考虑蒸散量。
4. 将烧瓶包裹在铝箔中，并在测定期间在生长灯下以 40-60 rpm 摇晃，或直到标记的植物转移到没有放射性标记的 0.5x Hoagland 溶液中进行一段时间。
5. 在收集 100 μL 等分试样之前，每 1-2 小时用没有放射性标记的 Hoagland 溶液将烧瓶中的体积加满至步骤 6.3 中制作的线。确保测量添加到每个烧瓶中的 Hoagland's 的体积，以比较每种溶液的蒸散速率。在前 6-8 小时后，采样时间可以增加到每 12-24 小时一次。
   注意：如果需要，此步骤可以持续数天，但随着实验的进行，请确保每天监测等分试样中的放射性。
6. 可选：为了监测追逐期间的渗出，将植物和猎鹰管盖组件转移到装有50mL新鲜Hoagland溶液（不含 ¹⁴C标记化合物）的烧瓶中，并在前6-8小时每2小时取出100μL等分试样，然后从实验开始间隔24小时。
   注意：为了区分化合物从植物根部的被动弥漫性和主动渗出，可以添加浓度为20μM的主动转运抑制剂，例如环孢菌素A。
7. 使用液体闪烁计数器测量在步骤6.1-6.6之间收集的每个等分试样的放射性计数。

7. 植物的荧光粉成像

1. 在不含放射性标记的0.5x Hoagland溶液中冲洗根部15分钟，以去除松散结合的放射性同位素。
2. 收集 100 μL 冲洗液进行液体闪烁计数。
3. 称量植物或非木本植物材料以确定新鲜质量。
4. 用凝胶干燥器将植物材料在一张贴有标签的滤纸上，在真空下在50°C下干燥2小时，然后在室温下干燥过夜。
   注意：干燥后，植物可以储存较长时间（4-6个月），并且可以在以后的日期进行成像，放射性信号下降最小。
5. 将荧光粉屏暴露在荧光粉橡皮擦上的强光下 15 分钟，以清除荧光粉屏。
6. 将 2-10 μL 具有已知放射性的放射性标记溶液分配到一张滤纸上，并在室温下干燥过夜。
   注意：这里使用放射性的标准：67、33、17、8、4 和 2 Bq，但可以更改以适应来自植物样品的信号强度。
7. 将荧光粉筛放在干燥的植物样品和放射性标准品的顶部，在黑暗中或封闭的不透明容器中，并将它们暴露至少24小时。
   注意： 如果图像曝光不足或曝光过度，请相应地调整曝光时间。
8. 使用激光扫描荧光粉成像系统以 50 μm 分辨率对屏幕进行成像。
9. 使用 ImageJ 软件分析荧光粉图像信号强度和分布¹¹.
   1. ImageJ 步骤：通过选择文件 >分析>设置测量值来打开图像...选择 “区域” 和 “平均灰度值”>“确定”。选择最适合组织的 形状选择工具 。 单击 并 拖动 图像以突出显示感兴趣的区域。按 Ctrl + M。将面积和平均灰度值复制到电子表格中。
10. 使用标准曲线中的放射性标准将平均灰度值转换为 Bq。
11. 使用以下公式计算植物组织中的总活性（积分密度）：
    积分密度 （Bq） =（组织的平均 Bq （Bq/cm²） - 背景 （Bq/cm²）） * 面积 （cm²）
    1. 可选：使用ImageJ软件¹¹将灰度图像转换为颜色强度刻度。

结果

¹⁴C 标签摄取程序适用于拟南芥以外的多种植物物种，包括 Salix interior、Elymus trachycaulus （Link） Gould ex Shinners 和湿地物种，例如 Juncus balticus^10,12。然而，出于代表性的目的，我们介绍了拟南芥生态型 Columbia-7 （Col-7） 的结果。此前，我们证明环烷酸（NA）等环境污染物被水培溶液中生长的几种植物物种吸收和代谢^10,12。众所周知，NAs影响模式植物拟南芥的生长、细胞器形态和动力学以及基因表达13,14,15。

讨论

近几十年来，植物修复作为一种被动、经济且环保的清洁工业废物和受污染场地的方法而受到关注¹。识别污染物吸收增强的植物物种并了解控制有机分子吸收的分子过程可以改进植物修复策略。与其他间接方法不同，这里描述的放射性标记摄取和荧光粉成像技术可以广泛用于跟踪植物中目标异生素和内源性有机化合物的摄取和易位。

为了模拟根际的条件，将放射性标记溶液调整到 pH 值为 5.0，以反映植物根部及其周围通常发现的微酸性环境。然而，这种可能持续存在于土壤中的天然酸性梯度不会保留在水培溶液中，因此需要添加缓冲液^12,16。此外，为了安全和最佳信噪比，我们建议将放射性同位素浓度限制在 0.1-0.26 kBq/mL 之间。在需要更高浓度来模拟环境条件或观察特定效果的情况下，可以通过添加更高浓度的等效非放射性 ¹²C 同位素来增加浓度。该协议还可以通过将

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Hoagland 改良基础盐混合物	植物技术实验室	H353型	含有硫酸亚铁
琼脂	生物商店	AGR001型
MES（2-（N-吗啉）乙烷磺酸）	生物商店	MES555型
pH计	梅特勒-托利多	五易
甲醇	生物商店	MET302
12C-金刚烷羧酸	西格玛·奥尔德里奇	106399
14C-金刚烷羧酸	维特拉克斯		自定义合成
125 mL锥形瓶	大众	30623-174
50 mL Falcon 试管	大众	CA21008-940
微升直管	大众	87003-294
植物生长室	康维伦
小费箱	迪亚迈德	DIATEC530-8376
Rubbermaid Roughneck 3 加仑手提包	亚马逊河	B0B3345MYH
滤纸	大众	CA28320-020
培养皿	大众	11019-566
带烧瓶架的摇床	福玛科学	型号 4516
闪烁鸡尾酒	研究产品国际	111195
闪烁瓶	大众	10014-296
闪烁计数器	贝克曼库尔特	LS 6000IC	使用的样品瓶将取决于您的闪烁计数器
凝胶干燥机	生物辐射	型号 583
激光扫描荧光粉成像仪	生物辐射	分子成像仪 FX