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可操作的 体内 将肿瘤细胞重编程为类似1型传统树突状细胞的细胞

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DOI：

10.3791/68739

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2025年8月1日

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1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了 体内 通过强制表达转录因子 PU.1、IRF8 和 BATF3，在肿瘤微环境中将小鼠癌细胞重编程为类似 1 型树突状的细胞。

摘要

癌症免疫治疗的疗效依赖于1型传统树突状细胞（cDC1s）对实体瘤的细胞毒性T细胞反应的募集与激活。然而，用于癌症免疫治疗的cDC1s制备面临诸多限制，包括细胞产量低、功能异质性以及在肿瘤微环境（TME）中易受免疫抑制的影响。我们近期开发了一种基于 体内 将肿瘤细胞重编程为具有免疫原性的类似cDC1的细胞，使肿瘤细胞能够像cDC1细胞一样呈递肿瘤抗原，从而激发多克隆细胞毒性T细胞反应并产生持久的系统性抗肿瘤免疫。本文介绍一种可行的实验方案：通过在肿瘤细胞中过表达最小的cDC1特异性基因调控网络——PU.1、IRF8和BATF3（ collectively referred to as PIB），在肿瘤微环境（TME）内生成类似cDC1的细胞，随后皮下植入经转导的细胞与亲本细胞的混合物。PIB的过表达促使肿瘤细胞逐步获得造血标志物CD45以及专业的抗原呈递复合物MHC II类分子，这些分子可作为细胞表面的检测指标 体内 cDC1 重编程。与重编程过程相比 体外 YUMM1.7小鼠黑色素瘤模型的重编程 体内 表现出更快的动力学特性和更高的效率。cDC1样细胞在前3天内通过募集宿主免疫细胞，迅速重塑肿瘤微环境（TME），并在第9天时促进三级淋巴结构的形成。重编程的cDC1样细胞在肿瘤中至少存留9天，但在第15天时未被检测到。 体内 此处描述的cDC1重编程方案提供了一种可行且稳健的方法，可有效将“免疫冷”肿瘤转化为“免疫热”肿瘤。总体而言，该方案为研究cDC1介导的抗肿瘤免疫机制以及探索其与其他癌症免疫治疗方式的协同组合提供了强有力的平台。

引言

近年来，癌症免疫治疗手段取得了显著进展，包括免疫检查点阻断（ICB）、过继性细胞治疗（ACT）和疫苗等，这些进展已改变了癌症治疗的格局1。在黑色素瘤中，针对程序性死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的抑制治疗反应率可达60%2。然而，仍有超过40%的黑色素瘤患者对ICB无反应，而在免疫原性较低的癌症（如乳腺癌、微卫星稳定型结直肠癌和胶质母细胞瘤）中，治疗反应率仍低于5%，凸显出当前临床治疗中的不足3,4,5。实现广泛临床疗效的主要障碍之一是细胞毒性T细胞应答的激活不足，而该应答依赖于肿瘤微环境（TME）中有效的抗原呈递6。

传统1型树突状细胞（cDC1s）虽稀少，但在启动肿瘤特异性免疫中不可或缺，可提供三种关键信号以启动T细胞应答：（1）在主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子上专业性地加工和呈递抗原；（2）通过CD80和CD86提供共刺激信号；（3）包括IL-12在内的促炎性细胞因子信号。7,8在树突状细胞（DC）亚群中，cDC1s 擅长将肿瘤细胞相关抗原交叉呈递给初始 CD8 T 细胞以启动其活化，或重新激活记忆 CD8 T 细胞+ T细胞或驱动CD4+ T细胞向1型辅助性T细胞（TH1) 细胞9此外，cDC1细胞是趋化因子C-X-C基序趋化因子配体9和10（CXCL9/10）的主要产生者，这些趋化因子介导T细胞向肿瘤组织的募集。10,11,12,13近年来，大量研究强调，肿瘤排斥以及对免疫检查点阻断（ICB）或过继性细胞治疗（ACT）的有效应答，与肿瘤内cDC1细胞的存在密切相关12,13因此，cDC1细胞已成为癌症免疫治疗的一个极具吸引力的靶点，成功利用其独特特性可能具有重要的转化潜力。

目前生成cDC1的方法基于血液分离或从CD34分化+ 前体细胞或多能干细胞14,15,16主要的临床策略依赖于从血液中分离出自体树突状细胞（DC）亚群的混合物，并对其进行刺激 离体 通过Toll样受体激动剂或促炎性细胞因子诱导成熟、具有免疫原性的程序，然后回输16然而，这些策略受到细胞成熟度差、肿瘤微环境中的免疫抑制屏障以及输注的树突状细胞混合物中细胞亚群异质性的限制，其中仅有一小部分为cDC1细胞7此外，由于cDC1s在外周血中数量极低，将其单独分离用于癌症免疫治疗或疫苗接种具有较大挑战性（<0.3%)16此外，cDC1 可由 CD34 产生+ 使用细胞因子和NOTCH信号通路从祖细胞或诱导性多能干细胞诱导分化。然而，这些方法需要复杂的长期操作流程，且获得的树突状细胞亚群数量较少且具有异质性17,18,19.

为了解决这些局限性， 体内 重编程为癌症免疫治疗提供了一种合适的策略，可生成类似cDC1的细胞，这些细胞在表型、转录及功能特性上均类似于cDC1细胞20通过过表达cDC1特异性的最小基因调控网络——PU.1、IRF8和BATF3（统称为PIB），成纤维细胞、基质细胞和癌细胞被逐步重编程为类似cDC1的细胞，能够进行肿瘤抗原在MHC I类和II类分子上的加工与呈递，通过CD80和CD86提供共刺激信号，并分泌包括CXCL9/10和IL-12在内的细胞因子和趋化因子20,21,22,23cDC1 重编程在人类异种移植瘤中进展更快且效率更高 体内 且独立于免疫抑制，生成具有成熟免疫原性特征的类似cDC1细胞20在同基因型黑色素瘤肿瘤中，我们观察到 cDC1 样细胞重塑了其肿瘤微环境（TME），诱导三级淋巴结构（TLS）的形成，并招募和扩增了多克隆 T 细胞H1 以及细胞毒性记忆T细胞，从而诱导长期的系统性免疫20最后，我们开发了一种基于 原位 通过瘤内注射腺病毒载体将癌细胞重编程为类cDC1细胞20这些发现为将cDC1重编程作为一种新型癌症免疫治疗策略的临床转化铺平了道路，该策略可利用cDC1的功能特性。

在此，我们提出一种可操作的方案，基于肿瘤微环境（TME）中生成类似cDC1细胞的方法 体内 cDC1重编程。通过慢病毒将PIB递送至癌细胞，随后将转导的癌细胞与未转导的亲本癌细胞按特定比例混合并植入，可实现 体内 在肿瘤微环境（TME）内对受控比例的癌细胞进行重编程。此外，该方法不受以下因素限制 原位 病毒载体的递送效率20我们概述了高效慢病毒载体生产、功能滴定的步骤以及 体内 以同源性黑色素瘤模型 YUMM1.7 为例的 cDC1 重编程。我们详细描述了实验设计及用于分析的设门策略 体内 通过流式细胞术在肿瘤解离后对重编程的类cDC1细胞进行分析。我们还提供了评估肿瘤微环境（TME）变化的步骤，包括肿瘤组织的冷冻保存、切片及免疫荧光染色，随后进行共聚焦显微镜观察。最后，我们阐述了如何通过监测肿瘤生长和生存情况来评估cDC1诱导的免疫反应。该方法具有良好的可操作性和可扩展性，为研究人员提供了一种评估联合治疗策略的有力工具 体内 cDC1重编程，用于表征不同癌症模型中肿瘤微环境及三级淋巴结构新生的变化，或开展大规模筛选以调控多种免疫通路（例如抗原呈递或细胞因子/趋化因子分泌）的表达，并揭示其对抗肿瘤免疫的影响。

方案

动物实验操作在获得瑞典农业委员会批准后，依照瑞典法规进行。

1. 试剂准备

  1. 配制完全培养基 DMEM 时，加入 10% (v/v) 胎牛血清 (FBS)、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素 (Pen)、2 mM 谷氨酰胺替代物，以及 100 mg/mL 链霉素 (Strep)。
  2. 配制完全培养基 RPMI 1640 时，加入 10% (v/v) FBS、2 mM 谷氨酰胺替代物、1 mM 丙酮酸钠、50 mM 2-巯基乙醇、100 U/mL 青霉素 (Pen) 和 100 mg/mL 链霉素 (Strep)。
  3. 配制完全培养基 DMEM/F12 时，加入 10% (v/v) 胎牛血清 (FBS)、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸，以及 100 U/mL 青霉素 (Pen) 和 100 mg/mL 链霉素 (Strep)。
  4. 配制 1 mg/mL 聚乙烯亚胺 (PEI) 溶液时，将 100 mg PEI 粉末溶于 100 mL 无菌去离子水中，使用玻璃烧杯或锥形管。将烧杯置于磁力搅拌器上，室温 (RT) 搅拌形成涡流，直至完全溶解。逐滴加入盐酸 (HCl)/氢氧化钠 (NaOH) 将 pH 调至 6.9–7.1，并通过 0.22 µm PES 膜滤器过滤溶液。
  5. 配制 1 mM 丁酸钠溶液时，将 1.10 mg 溶于 10 mL 无菌去离子水中。
  6. 配制 8 mg/mL 聚凝素 (Polybrene) 溶液时，将 80 mg 聚凝素粉末溶于 10 mL 无菌去离子水中。
  7. 配制 FACS 缓冲液时，向磷酸盐缓冲液 (PBS) 中加入 2% FBS 和 1 mM EDTA。

2. 慢病毒生产

  1. 将1 mL细胞加入9 mL预热的DMEM完全培养基中，解冻HEK 293T细胞，并在350 × g 条件下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于20 mL DMEM完全培养基中，于37 °C、5% CO2 条件下在150 mm培养皿中培养细胞。
  2. 当细胞融合度达到80–90%时进行扩增和传代。传代时，用PBS洗涤一次，加入5 mL胰蛋白酶使细胞从培养皿上脱离，并在37 °C、5% CO2 条件下孵育5–10分钟。
  3. 用5 mL DMEM完全培养基收集细胞，在350 × g 条件下离心5分钟，并以1:6比例将细胞传代至新的150 mm培养皿中，于转染前48小时完成。
    注意：用于生产慢病毒的细胞系质量对获得高滴度病毒至关重要。细胞融合度不得超过95%，且避免接种时融合度低于<30%。
  4. 48小时后，或当细胞融合度达到70–80%时，在50 mL锥形管中配制转染混合物。使用以下转移质粒之一：1）SFFV-PIB-IRES-eGFP-a，一种包含转录因子PU.1、IRF8、BATF3、内部核糖体进入位点（IRES）以及增强型绿色荧光蛋白（eGFP）作为荧光转导报告基因的多顺反子慢病毒载体；或2）SFFV-eGFP，一种含多克隆位点和eGFP的对照慢病毒载体；或3）SFFV-mCherry，一种表达mCherry的慢病毒载体。加入10 µg转移质粒、7.5 µg包装质粒psPAX2和2.5 µg包膜质粒pMD2.G。用Opti-MEM补足体积至2 mL。最后，向转染混合物中加入60 µL转染试剂PEI（来自1 mg/mL储备液）。
    注意：慢病毒载体SFFV-eGFP在重编程实验中用作转导对照，以排除慢病毒介导的免疫原性影响；而SFFV-mCherry用于生成荧光标记的癌细胞系。
  5. 将转染混合物充分涡旋1分钟，并在室温下孵育15分钟，以形成DNA-脂质复合物。
    注意：细胞融合度显著影响病毒滴度。若在融合度低于70%时进行转染，由于接受质粒的细胞数量减少，将导致病毒滴度降低。
  6. 吸除HEK 293T细胞的培养基，加入10 mL不含青霉素/链霉素但含10%经无菌过滤胎牛血清（FBS）的DMEM培养基。
  7. 将转染混合物逐滴加入150 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2 条件下孵育16小时。
  8. 转染后，更换为20 mL含1 mM丁酸钠的DMEM完全培养基，在37 °C、5% CO2 条件下继续孵育24小时。
    注意：丁酸钠是一种I类组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，可通过诱导组蛋白高乙酰化打开染色质结构，从而增强HEK 293T细胞中病毒包装质粒和转移质粒的基因表达。可通过荧光显微镜观察eGFP表达情况来评估转染效率。
  9. 在转染后48小时和60小时分别收集含慢病毒的上清液至50 mL锥形管中。第一次收集后，每150 mm培养皿补充12 mL预热的DMEM完全培养基用于第二次收集。将收集的上清液置于4 °C保存，经0.45 µm低蛋白结合聚醚砜（PES）滤膜过滤后合并。
  10. 为浓缩病毒，将含慢病毒的培养基37 g 移入38.5 mL开口薄壁聚丙烯管中。使用台秤测量管子的重量。
    注意：应测量含慢病毒培养基的重量而非体积，因为重量在平衡时更为精确。管子的重量必须良好平衡，以避免损坏超速离心机。
  11. 将管子放入超速离心桶中，盖紧盖子，并将离心桶放入摆动转子中。在4 °C条件下以25,000 × g 离心90分钟。
  12. 离心结束后，从转子中取出管子并吸除上清液。
    注意：同一管子可重复加样，最多进行三轮离心，以在每管中获得更大的慢病毒沉淀。
  13. 将开口薄壁聚丙烯管倒置于实验室擦拭纸或其他吸水材料上5分钟，使多余液体流出并干燥沉淀。
  14. 向每份沉淀中加入200 µL冰上预冷的含HEPES的DMEM或PBS。将微量离心管放入50 mL锥形管中并盖上盖子，以保持无菌状态。
  15. 将沉淀在4 °C条件下孵育过夜，使其充分重悬。
  16. 合并重悬后的病毒液，分装并储存在-80 °C，可保存长达一年。
    注意：为避免反复冻融导致滴度下降，建议使用较小体积的分装量（例如50–200 µL）。

3. 功能性病毒滴定

注意：应对每批慢病毒重复此步骤，以确定实现转导细胞（eGFP+）与未转导细胞（eGFP-）数量比为1:1所需的最适病毒剂量。

  1. 在适当的培养基中解冻并扩增癌细胞（例如，将YUMM1.7小鼠黑色素瘤细胞系培养于DMEM/F12完全培养基中）。
    注意：在进行重编程实验前，细胞应至少经历一轮分裂。不同实验间的细胞传代次数应保持一致。
  2. 在建立肿瘤前一天，吸除细胞培养基，用PBS洗涤一次，然后每100 mm培养皿或150 mm培养皿分别加入2 mL或5 mL胰蛋白酶。在37 °C、5% CO2条件下孵育5–10分钟，再分别向100 mm或150 mm培养皿中加入8 mL或5 mL完全培养基以终止消化，并将细胞收集至50 mL锥形管中。
  3. 以350 ×g离心5分钟以去除胰蛋白酶，然后用完全培养基重悬细胞。
  4. 取10 µL细胞悬液，加入10 µL台盼蓝染液，使用血细胞计数板计数活细胞数量。
  5. 将6 × 105个细胞转移至含有12 mL完全培养基的新50 mL锥形管中，并向细胞悬液中加入12 µL浓度为8 mg/mL的polybrene，使终浓度达到8 µg/mL。
  6. 将2 mL细胞悬液移入6孔组织培养板的每个孔中。
    注意：如有需要，可将每孔细胞数量增加至1.2–1.8 × 106个。
  7. 向各孔中加入递增体积的慢病毒，以确定实现转导细胞（eGFP+）与未转导细胞（eGFP-）比例为1:1所需的最适病毒体积。
    注意：建议以三复孔形式分别加入推荐体积的慢病毒，即1、2、4、8、16和32 µL。对空载对照慢病毒载体SFFV-eGFP和SFFV-mCherry进行功能滴定。
  8. 在37 °C、5% CO2条件下孵育细胞24小时。
  9. 第0天，吸除含慢病毒的培养基，更换为新鲜培养基，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育72小时。
  10. 第3天，在荧光显微镜下观察细胞eGFP表达情况。
    注意：此步骤可快速验证细胞转导效率，但不能替代第3.14步中通过流式细胞术对eGFP+与eGFP-细胞精确比例的分析。
    某些癌细胞（如B16小鼠黑色素瘤细胞）中eGFP信号可能较弱，难以通过荧光显微镜检测，建议直接进行流式细胞术分析。
  11. 吸除培养基，用PBS洗涤细胞一次，每孔加入500 µL胰蛋白酶。在37 °C、5% CO2条件下孵育5–10分钟。
  12. 每孔用1.5 mL FACS缓冲液吹打收集细胞，将细胞悬液转移至5 mL聚苯乙烯管中。取部分细胞样本，使用血细胞计数板结合台盼蓝染色法计数活细胞数。
  13. 将细胞悬液以350 ×g离心5分钟，弃上清后用100 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，随后进行流式细胞术分析。
  14. 通过流式细胞术定量测定转导（eGFP+）与未转导（eGFP-）细胞的精确比例。用于体内实验时，应选择最接近1:1比例的慢病毒用量。
    注意：为准确确定eGFP+与eGFP-细胞的比例，应将未转导的癌细胞作为阴性对照用于设门分析。

4. 皮下肿瘤建立用于 体内 重编程

  1. 在适当的培养基中解冻并扩增癌细胞，以生成表达mCherry的细胞。
    注意：mCherry 的表达有助于在流式细胞术分析中将肿瘤内的癌细胞与其他细胞群体（例如内源性间质细胞和免疫细胞）区分开来。
  2. 执行步骤 3.2–3.4，并将细胞重悬于完全培养基中，浓度为 105 每毫升细胞数
  3. 加入8 µg/mL的polybrene和已确定体积的SFFV-mCherry慢病毒至细胞悬液中，以达到 >90% 转导效率。
    注意：或者，如果实现 >90% 转导率会损害细胞活力，需分选 mCherry 阳性细胞+ 转导后72小时通过荧光激活细胞分选（FACS）分离细胞，并在培养中扩增分选后的细胞。
  4. 将5 mL细胞悬液（含有5 × 10⁶个细胞）接种于培养板中5 每100 mm培养皿接种细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 24 小时。
  5. 24小时后，将培养基更换为10 mL完全培养基，并在37 °C、5% CO₂条件下继续培养扩增细胞。2 在开始重编程实验前至少7天。
  6. 扩增后，按照步骤 3.2–3.4 制备细胞悬液，用于后续转导，加入先前确定体积的 SFFV-PIB-IRES-eGFP，使转导细胞（eGFP）与未转导细胞的比例最接近 1:1+）至未转导（eGFP-第3天的细胞。
  7. 向50 mL锥形管中的细胞悬液中加入8 µg/mL的polybrene，以及先前确定体积的慢病毒。轻轻混匀，避免产生气泡。
  8. 移液2 mL细胞悬液（含有105 每孔接种细胞至6孔组织培养板中，于37 °C、5% CO₂条件下培养24小时2.
    注意：也可将细胞接种于100 mm组织培养皿中的5 mL转导培养基中。但需注意，在较大体积中转导效率可能会降低，应按照步骤3.1–3.13所述通过实验确定。
    建议转导比目标数量多至少10%的细胞，以补偿转导过程中可能发生的细胞损失，并确保在肿瘤建立过程中有足够的体积用于移液或注射。
  9. 24 h后，弃去含慢病毒的培养基，用PBS洗涤两次，每孔加入500 µL胰蛋白酶，于37 °C、5% CO₂条件下孵育5–10 min2.
  10. 在光学显微镜下检查细胞是否已完全从培养板上解离，然后用完全培养基将细胞收集至50 mL锥形管中。
  11. 离心5分钟（350 × g）使细胞沉淀 g，用PBS洗涤沉淀，再以350 × g离心5分钟 g取少量样品，使用血细胞计数板和台盼蓝染色法计数活细胞。
  12. 将沉淀重悬于预冷的PBS中，调整浓度至2-4 × 107 每毫升细胞数，相当于1-2 × 106 每肿瘤注射体积为 50 µL 的细胞。
    注意：重要的是，这些细胞数量已针对YUMM1.7黑色素瘤肿瘤进行了验证，用于分离体内重编程的cDC1样细胞以进行流式细胞术分析。对于其他细胞系以及其他实验读数（如肿瘤生长和生存实验），需通过实验经验确定合适的细胞数量。对于肿瘤生长和生存实验，建议使用较低的细胞数量，每瘤接种100,000至250,000个细胞。
  13. 转移到进行动物实验的工作区域，并将细胞置于冰上。
    注意：细胞制备完成后，应尽快进行细胞注射，因为细胞活力会随着时间的推移而下降。
  14. 每只小鼠用 60 µL 麻醉液，通过将赛拉嗪（3 mg/kg）和氯胺酮（135 mg/kg）溶于 PBS 中配制而成。
  15. 通过腹腔注射60 µL麻醉剂使CD45.1小鼠麻醉。将小鼠随机分组，并置于加热垫上以防止体温下降。在小鼠眼部涂抹眼膏，以预防麻醉期间的眼部脱水。
    注意：必须使用 CD45.1 小鼠，以便区分 体内 表达野生型CD45.2等位基因的重编程cDC1样细胞及内源性免疫细胞。若细胞系为CD45.1型，可使用C57BL/6小鼠（CD45.2）作为受体。实验组间小鼠应匹配性别和年龄，并在肿瘤建立前进行随机分组。本研究中使用8周龄雌性小鼠。
  16. 等待5-10分钟，直至所有小鼠完全麻醉。
  17. 用剃刀剃除小鼠右侧 flank 部的毛发；可选地，使用耳标钳进行标记。用70%乙醇消毒该区域，并清除残留的毛发。
  18. 用P1000移液器反复吹打重悬癌细胞。将细胞悬液转移至0.5 mL 30 G注射器中。
  19. 用两根手指轻轻提起小鼠剃毛后侧腹部的皮肤，在皮肤褶皱处插入针头尖端。
    注意：需小心避免被针头刺伤手指。
  20. 松开皮肤，用一只手固定注射器，另一只手用两根手指拉伸小鼠的皮肤。
  21. 缓慢注射50 µL癌细胞悬液，使注射部位形成椭圆形隆起（皮下肿胀）。
    注意：如果未形成隆起，可能是悬液渗漏至周围皮下组织，这可能导致成瘤结果不一致或成瘤失败。
  22. 术后密切观察所有小鼠苏醒，以确保麻醉后的存活。
  23. 将小鼠饲养于温度控制在23 ± 2 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中，并可自由摄取食物和水。
    注意：如果需要监测肿瘤生长，请执行步骤 4.24–4.26；否则跳过这些步骤，直接进入下一章节。
  24. 为监测肿瘤生长，用一只手轻轻固定小鼠，以便清晰观察肿瘤。
  25. 使用电子卡尺测量肿瘤的长度（l），宽度（w）和高度（h）。计算肿瘤体积（V）使用公式： V = (l x w x h) / 2.
  26. 每两到三天测量一次肿瘤尺寸。当肿瘤体积达到人道终点标准（例如 1,500 mm³）时，依照伦理和机构指南对动物实施安乐死。

5. 用于流式细胞术分析的肿瘤分离

  1. 准备剪刀、镊子、FACS缓冲液，以及含冰冻RPMI完全培养基的12孔非组织培养板，用于收集肿瘤样本。
  2. 按每份肿瘤组织准备，将 30 µL 100 mg/mL 胶原酶 D 与 3 µL 10 mg/mL DNA酶 I 混合于 3 mL RPMI 完全培养基中（终浓度为 1 mg/mL 胶原酶 D 和 10 µg/mL DNA酶 I），配制肿瘤消化液。
    注意：如果消化效率不理想，可添加 2–5 mM CaCl₂2 以支持胶原酶活性。
  3. 通过颈椎脱位或CO2 分离当天因窒息死亡。
    注意：如果 CO2 实施安乐死时，引入CO2 以每分钟30%–70%的腔室体积通气，并通过经批准的辅助方法（如颈椎脱位）确认动物死亡。
  4. 用剪刀和镊子切除皮下肿瘤，将每个肿瘤放入含有冰冻RPMI的12孔非组织培养板的孔中。尽量减少非肿瘤组织的切除。
  5. 将肿瘤样本切成1-2 mm3 用剪刀剪碎组织，将组织碎片收集至含有3 mL消化液的50 mL锥形管中，于37 °C、200–250 rpm振荡条件下孵育30–45分钟。
    注意：每15分钟涡旋振荡或用移液器吹打一次，以促进消化过程。
  6. 消化后，使用5 mL血清移液管剧烈吹打混合物1分钟。将细胞悬液经70 µm细胞滤网过滤至新的50 mL锥形管中。
  7. 使用10 mL注射器的推杆将未消化的组织块在70 µm细胞筛网上压碎，并用10 mL完全RPMI培养基冲洗筛网。
  8. 将细胞悬液在 350 × g 4 °C下离心5分钟，重悬于1 mL FACS缓冲液中，计数活细胞。
  9. 将细胞悬液转移至5 mL聚苯乙烯管中，在350 × g 5分钟，重悬106 每100 µL FACS缓冲液中的活细胞数
  10. 将细胞分别分装至不同的聚苯乙烯管中，用于单色（SC）和荧光减一（FMO）对照。
  11. 配制抗体染色混合液，其中包含用于阻断非特异性结合的大鼠血清（1:100）、用于在分析中排除死细胞的可固定活力染料（1:100），以及荧光标记的抗体anti-CD45.1、anti-CD45.2和anti-MHC-II（均按最佳浓度使用）。向每份样本中加入100 µL混合液，于4 °C避光孵育20分钟。
  12. 用 2 mL FACS 缓冲液洗涤样本 2 次，随后进行流式细胞术分析。
  13. 通过在转导（eGFP）细胞中设门，定量表达CD45.2和/或MHC-II的cDC1样细胞所占百分比+）肿瘤细胞（CD45.1-mCherry+).
    注意：本方案可用于在肿瘤切除后进行免疫表型分析 体内 通过在染色面板中添加针对内源性淋巴样和/或髓系免疫细胞群体的抗体，对cDC1进行重编程。

6. 共聚焦显微镜分析用肿瘤组织的冷冻与切片

  1. 按照步骤 5.1 和 5.3 的要求准备肿瘤分离。使用剪刀和镊子切除皮下肿瘤。
  2. 将肿瘤置于新配制的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 中，在 4 °C 条件下轻轻振荡固定。根据肿瘤大小调整固定时间，建议每 mm³ 组织固定 1 小时。
  3. 将肿瘤转移至含 15% 蔗糖的 PBS 溶液中，在 4 °C 条件下轻轻振荡孵育，直至组织沉入管底。随后在相同条件下转移至含 20% 蔗糖的 PBS 溶液中。
  4. 当肿瘤完全沉降至管底后，将其置于 20% 蔗糖 PBS 溶液与 OCT 包埋剂按 1:1 比例混合的溶液中，在 4 °C 条件下振荡孵育 30 分钟。
  5. 移除混合液，将组织置于冷冻模具中，加入 100% OCT 包埋剂，并使用液氮速冻。
    注意：务必穿戴适当的个人防护装备（防冻手套、面罩和实验服），以防冻伤或因液体迅速汽化造成伤害。应在通风良好的区域操作，避免窒息风险。
    1. 将组织块储存于 -80 °C 的密闭容器中，以防脱水。

7. 肿瘤组织切片的免疫荧光染色

  1. 使用冷冻切片机将肿瘤切成约 8 µm 厚的切片，并将其贴附在显微镜玻片上。如有需要，可将玻片保存于 -80 °C。
    注意：为保持组织完整性，在将组织块和贴有肿瘤切片的玻片运送至冷冻切片机或从冷冻切片机取出时，应始终将其置于干冰上。确保切片过程中冷冻切片机温度维持在 -20 °C。
  2. 将玻片在 PBS 中解冻 5 分钟，并在 4% 多聚甲醛（PFA）溶液中室温固定 10 分钟。
  3. 固定后，用 PBS 洗涤玻片 5 分钟。
    注意：确保组织始终保持湿润状态；在后续所有染色步骤中均需将组织浸没于液体中。若实验需暂停，可将玻片在室温下保存于 PBS 中，最长不超过 3 小时。避免将玻片在 PBS 中过夜保存。
  4. 进行抗原修复时，向蒸锅中加水并开启加热。将一个装有去离子水的瓶子和一个装有 10 mM 柠檬酸钠（pH 6）的瓶子放入蒸锅中，并用铝箔覆盖蒸锅开口。不打开锅盖的情况下，将温度计穿过蒸锅盖的通风口，刺穿铝箔，监测温度，确保溶液温度升至约 99 °C。
  5. 当缓冲液温度达到约 99 °C 时，先将玻片浸入去离子水中 10 秒，然后迅速转移至抗原修复液中。
  6. 在约 99 °C 条件下孵育玻片 15 分钟。
  7. 用 1x PBS 洗涤玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  8. 使用疏水屏障笔（Hydrophobic Barrier Pap Pen）围绕每份组织切片划线，形成疏水边界，防止后续添加液体时发生扩散或泄漏。
    注意：后续 PBS 洗涤可能破坏组织周围的疏水边界，需重新绘制。根据需要重复划线。
  9. 在室温下用 150 µL 封闭缓冲液（含 5% 血清和 0.5% Triton X-100 的 1x PBS）对组织进行封闭和通透处理，孵育 60 分钟。所有染色步骤中所用血清应与二抗来源物种一致。
  10. 用 1x PBS 洗涤玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  11. 在封闭缓冲液（含 5% 血清和 0.5% Triton X-100 的 1x PBS）中加入 20 µg/mL 的一抗 anti-CD45 抗体，与组织在 4 °C 条件下孵育过夜。
    注意：若使用其他抗体，需通过实验确定最佳抗体浓度。
  12. 用 1x PBS 洗涤玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  13. 在避光条件下，将组织切片与 AlexaFluor-647 标记的山羊抗大鼠二抗按 1:250 比例稀释于封闭缓冲液（含 5% 血清的 1x PBS）中，在室温下孵育 2 小时。
    注意：加入二抗后，所有后续操作均需在避光条件下进行，以防止荧光染料发生光漂白。
  14. 用 1x PBS 洗涤玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  15. 在避光条件下，将组织与 1 µg/mL DAPI 和 20 µg/mL AlexaFluor-594 标记的抗体共同加入封闭缓冲液（含 5% 血清的 1x PBS）中，在室温下孵育 1 小时。
  16. 用 1x PBS 洗涤玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
  17. 在每份肿瘤切片上滴加一滴封片液，然后在盖玻片上滴加数滴封片介质。迅速将盖玻片倒置覆盖在玻片上，确保肿瘤区域附近无气泡产生。
  18. 让玻片在室温下过夜干燥，随后使用共聚焦显微镜进行成像。

结果

可处理系统的示意图概述 体内 重编程方案如下所示 图1. 首先，我们构建了编码cDC1诱导性重编程因子PU.1、IRF8和BATF3的多顺反子慢病毒载体SFFV-PIB-IRES-eGFP（PIB-eGFP），其后接内部核糖体进入位点（IRES）和增强型绿色荧光蛋白（eGFP），并在HEK 293T包装细胞系中进行生产。为排除慢病毒本身可能引起的免疫原性影响，我们同时构建了对照用的空载体SFFV-MCS-eGFP（eGFP），该载体包含多克隆位点（MCS）和IRES-eGFP，但不含有上述重编程因子。病毒生产完成后，收集含病毒的上清液，并通过超速离心进行浓缩。随后对病毒进行功能滴定，以确定实现转导细胞（eGFP阳性）与非转导细胞比例为1:1所需的病毒用量+）至未转导（eGFP-) 细胞，我们在转导后第3天对其进行评估。随后，利用所得病毒量在第-1天转导选定的癌细胞系。24小时后，收集细胞并将其皮下植入以建立肿瘤。该策略确保了转导的细胞重编程为类似cDC1的细胞 体内，于移植后的指定时间点，我们切除肿瘤并进行后续分析，包括对解离的肿瘤细胞进行流式细胞术，以定量分析 体内 重编程效率，或对冷冻保存的肿瘤切片进行免疫荧光染色以表征肿瘤微环境（TME）中的变化。

首先，为了确保产生高滴度的慢病毒，我们在转染前监测了HEK 293T细胞，使其达到70–80%的融合度，并在转染24小时后通过荧光显微镜观察eGFP表达情况以评估转染效率（图2A）。接着，我们在转染后48小时和60小时收集含病毒的培养基，进行超速离心，并将病毒分装后储存于-80 °C（图2B）。然后，我们确定了在YUMM1.7黑色素瘤细胞中实现eGFP+与eGFP-细胞1:1比例所需的最适病毒感染量。将105个YUMM1.7细胞接种于6孔板的每个孔中，用逐渐增加体积的慢病毒感染细胞，并在24小时后将含病毒的上清液更换为新鲜的DMEM/F12完全培养基（图2C）。在第3天，我们首先通过荧光显微镜检测eGFP的表达，随后通过流式细胞术精确量化eGFP+细胞的比例（图2C）。为了量化eGFP+与eGFP-细胞的比例，我们设门选取活的单细胞群体，以排除死细胞和双联体细胞（图2D）。最终确定所制备的慢病毒批次中，PIB-eGFP病毒和对照eGFP病毒的最适感染体积均为每105个YUMM1.7细胞使用2 µL，分别导致eGFP+细胞比例为50.0 ± 0.3%和63.0 ± 0.9%（图2E）。

接下来，为了评估 体内 重编程效率，我们构建了一个荧光标记（mCherry）+) 癌细胞系（YUMM1.7-mCherry）。这使得我们能够通过活细胞中mCherry的信号设门，以区分癌细胞与基质细胞或免疫细胞+ 流式细胞术分析中的细胞（图3A，B）。随后，我们用每10⁵个YUMM1.7-mCherry细胞加入2 µL PIB-eGFP病毒或对照eGFP病毒进行转导5 细胞以实现1:1的eGFP+ eGFP- 比例。我们皮下植入了1.6 × 106 每只CD45.1小鼠肿瘤中的细胞数，并保留部分细胞用于培养 体外 用于比较。我们通过流式细胞术评估重编程效率，圈选活的 mCherry+ eGFP+ 和 CD45.1- 细胞，以排除已吞噬 eGFP 或 mCherry 的宿主免疫细胞（图3B）。从第1天到第9天，我们观察到CD45.2和/或MHC-II表达的逐步获得，标志着部分重编程的类似cDC1细胞（CD45.2+ MHC-II- 或 CD45.2- MHC-II+）以及完全重编程的类cDC1细胞（CD45+ MHC-II+) (图3C）。我们验证了小鼠癌细胞的重编程 体内 第9天时，cDC1样细胞的比例高于 体外 条件（9.54 ± 1.54% CD45+ MHC-II+ 体内 vs. 4.72 ± 1.1 % CD45+ MHC-II+体外，P = 0.018）。重编程的动力学过程也得到加速，早在第4天即可观察到更高比例的类似cDC1细胞（8.7 ± 3.3% CD45+ MHC-II+体内 vs. 0.3 ± 0.1% CD45+ MHC-II+体外，P = 0.05），表明环境信号的存在可促进向类似cDC1细胞的更快且更高效的重编程19。尽管 体外 重编程的类cDC1细胞持续存在至第15天， 体内 cDC1样细胞持续存在9天，但在第15天时未被检测到，提示其被宿主免疫系统从肿瘤微环境中清除（图 3C).

最后，我们旨在表征肿瘤微环境（TME）在早期发生的变化 体内 前9天内cDC1的重编程。我们对表达eGFP和PIB-eGFP的肿瘤组织在冷冻保存并切片后，分别于第3天和第9天进行了免疫荧光染色 体内 重编程，重点关注表达泛造血细胞标记物CD45的免疫细胞浸润。值得注意的是，与表达eGFP的肿瘤相比，cDC1样细胞在第3天即可显著促进更多CD45阳性细胞浸润至肿瘤微环境（每肿瘤区域CD45染色的平均荧光强度：49.6 ± 17.0 vs. 8.0 ± 5.8）。 图 4A，B）。有趣的是，我们在肿瘤治疗9天后于肿瘤微环境（TME）中检测到了TLS。 体内 重编程。这表明cDC1样细胞可在3天内迅速将肿瘤微环境（TME）从“免疫冷”状态重塑为“免疫热”状态，继而于第9天诱导三级淋巴结构（TLS）的形成。

Polycystronic lentiviral vector experiment diagram; cell transduction, reprogramming, tumor analysis.
图1生成类cDC1细胞的方案概述 体内 癌细胞重编程 慢病毒载体 SFFV-PIB-IRES-eGFP 编码 PU.1、IRF8 和 BATF3，其多顺反子表达盒受脾灶形成病毒启动子（SFFV）调控，eGFP 位于内部核糖体进入位点（IRES）之后，用于通过流式细胞术和荧光显微镜追踪转导细胞——该载体在 HEK 293T 包装细胞系中生产。随后，慢病毒载体经超速离心浓缩并进行功能滴定，以确定以 1:1 比例转导癌细胞所需的病毒量+ 未转导的 eGFP- 细胞。对于 体内 重编程实验中，于第-1天将癌细胞以最佳量的慢病毒感染进行铺板。次日，将转导了GFP的细胞以1:1比例混合+ 和未转导的GFP- 细胞经洗涤后收集，用于在小鼠中建立皮下肿瘤。平行 体外 在第3天通过流式细胞术验证转导效率并维持培养。每2至3天监测动物的肿瘤生长情况和存活率。在预定时间点收集肿瘤组织，解离后进行表面标志物染色，用于流式细胞术分析。 alternatively，将完整组织固定、冷冻保存并切片，用于免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析。 体内 通过流式细胞术分析评估重编程效率，同时利用共聚焦成像表征肿瘤微环境的变化。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Lentivirus production in HEK 293T cells, chart showing transfection and ultracentrifuge steps.
图2：慢病毒的制备与功能滴定 体内 cDC1重编程 （A） 当 HEK 293T 细胞融合度达到约 70–80% 时，使用转染混合物进行转染，混合物包含 10 µg 转移质粒 SFFV-PIB-eGFP（PIB-eGFP）或空载慢病毒对照质粒 SFFV-eGFP（eGFP），以及 7.5 µg psPAX2、2.5 µg mPD2.G 和 60 µL 1 mg/mL PEI。转染后 24 小时拍摄 HEK 293T 细胞的明场与荧光显微镜图像，显示 eGFP 表达，表明质粒成功递送。比例尺 = 200 µm。 （B） 浓缩慢病毒的超速离心工作流程示意图。转染后48小时和60小时收集含慢病毒的HEK 293T细胞上清液，经0.45 µm低蛋白结合PES滤膜过滤后，使用台秤称取37 g于开口薄壁聚丙烯管中。将管子置于摆动桶转子中进行超速离心，吸除上清液后将沉淀在室温下干燥5分钟。随后将沉淀重悬于冰上预冷的含HEPES的DMEM培养基中，4°C孵育过夜，分装后于-80 °C保存。 (C) 功能滴定实验策略，用于确定实现GFP+与GFP-细胞1:1比例的最佳病毒感染剂量。转导72小时后YUMM1.7黑色素瘤细胞中eGFP表达的明场与荧光显微镜图像，显示重编程因子及eGFP成功递送。比例尺 = 100 µm。 (D) 代表性流式细胞术图示，展示用于定量 eGFP 比例的设门策略+ 细胞。活细胞通过排除死细胞染料（DAPI）阳性群体进行门控，随后排除双联体。 (E) 流式细胞术定量分析不同病毒剂量下的转导效率，以确定实现1:1 GFP的最适体积+/GFP- 细胞。对于 PIB-eGFP 和 eGFP 慢病毒，每 105 细胞达到预期比例。缩写：cDC1s = 1型传统树突状细胞；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；PIB = PU.1、IRF8 和 BATF3；PEI = 聚乙烯亚胺。 请点击此处以查看此图的放大版本。

In vivo cDC1 reprogramming, flow cytometry analysis; involves PIB-eGFP, CD45.1 mice; charts.
图3评估 体内 cDC1重编程效率 (A) 体内cDC1重编程效率评估实验流程示意图。首先将癌细胞用表达mCherry的慢病毒感染，以生成荧光标记的细胞系（YUMM1.7-mCherry），随后在第-1天以优化剂量的PIB-eGFP慢病毒进行二次感染。之后将细胞以eGFP与mCherry标记细胞1:1的比例皮下注射+/eGFP- 第0天将细胞植入CD45.1小鼠以建立肿瘤，并使PIB转导的细胞在肿瘤微环境（TME）中重编程为类似cDC1的细胞。随后在指定时间点分离肿瘤组织，进行消化处理，并通过流式细胞术对CD45.1、CD45.2和MHC-II进行染色检测。由此可排除CD45.1宿主来源的免疫细胞，从而定量分析 体内 通过表达 CD45.2 和 MHC-II 评估 cDC1 重编程效率。平行实验 体外 在各个时间点均保留培养物作为对照 体内 重编程 （B） 代表性流式细胞术图示，展示第9天的设门策略。细胞根据mCherry进行设门+ 和GFP+ 以鉴定成功转导的癌细胞。通过排除CD45.1标记物来排除宿主免疫细胞。+ 细胞 (C) 定量分析 体内 重编程效率（左侧）通过流式细胞术检测YUMM1.7-mCherry细胞中CD45阳性细胞的百分比+ MHC-II+ 细胞（完全重编程）和CD45.2+ HLA-DR- 或 CD45.2- HLA-DR+ cDC1样细胞（部分重编程）在eGFP门控内+ mCherry+ 细胞。代表性流式细胞术图谱（右）显示，在指定时间点，经PIB-eGFP转导的YUMM1.7-mCherry细胞中CD45.2和MHC-II表达的逐步获得情况。以eGFP转导的YUMM1.7-mCherry细胞作为对照 体外 重编程的类cDC1细胞被用于比较。(数据见于)C) 表示 3 至 5 次生物学重复实验的均值 ± 标准差。( 中的统计分析C对 CD45 进行了检测+ MHC-II+ 使用Mann-Whitney检验对细胞进行分析。*P < 0.05。缩写：cDC1s = 1型传统树突状细胞；PIB = PU.1、IRF8 和 BATF3；TME = 肿瘤微环境。 请点击此处以查看此图的放大版本。

Tumor microenvironment remodeling: fluorescence microscopy of eGFP, CD45; analysis chart included.
图4：分析肿瘤微环境中的免疫浸润 体内 cDC1重编程。（A） 代表性共聚焦图像显示 CD45+ 皮下植入PIB-eGFP或对照eGFP转导细胞（转导细胞与亲本细胞比例为1:1）后第3天和第9天YUMM1.7肿瘤中的细胞。比例尺＝500 µm。 （B） PIB处理组与对照组eGFP转导的YUMM1.7肿瘤在第3天和第9天CD45染色MFI的定量分析。(数据见B) 表示 3 至 6 次生物学重复实验的平均值 ± 标准差。( 中的统计分析B) 采用 Mann-Whitney 检验进行分析。*P < 0.05 和 ***P < 0.001. 缩写：cDC1s = 1型传统树突状细胞；PIB = PU.1、IRF8和BATF3；MFI = 平均荧光强度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

在此方案中，我们描述了一种可操作的方法，用于生成类似cDC1的细胞 体内 实体瘤中癌细胞的重编程。我们的结果表明，PU.1、IRF8 和 BATF3 的过表达可驱动肿瘤微环境（TME）中的细胞逐渐获得 cDC1 表型，直至第 9 天，此后类 cDC1 细胞从肿瘤中耗竭。最终，这导致到第 3 天时 CD45+ 细胞向 TME 的浸润增加，从而引发肿瘤微环境的重塑 "免疫冷" 肿瘤微环境的形成 "免疫热型".

目前生成cDC1的方案包括从外周血富集自体DC，或由CD34+ 造血祖细胞，或由多能干细胞分化而来14,15,16,17,18,19然而，这些方法存在一些限制因素：成熟度不足、抗原呈递能力降低以及细胞因子/趋化因子产生能力下降 体内，对免疫抑制的易感性、树突状细胞的高度异质性以及所产生细胞数量较少7在此，我们提供一种可实现cDC1样细胞规模化生成的实验方案 体内 用于功能与机制研究。

通过该方法，我们检测了转录因子组合 PU.1、IRF8 和 BATF3 的表达是否足以驱动 体内 重编程。该方案能够精确控制递送效率，因为改变直接植入的基因修饰细胞剂量会直接影响治疗效果。我们此前已证明，2%的转导细胞（相当于0.15% CD45）+ 和 MHC-II+ cDC1样细胞足以诱导抗肿瘤免疫反应20此外，第3天观察到的快速免疫细胞浸润表明，部分重编程的类似cDC1细胞具有功能活性。 体内，因为在此时间点并未观察到完全重编程的类cDC1细胞数量有显著增加。未来，利用携带自杀基因的改良载体，在特定时间点诱导特定细胞群体死亡，以探究部分重编程与完全重编程的类cDC1细胞在抗肿瘤效应中的功能差异，将十分有意义。24该方案还可用于探索与表观遗传佐剂联用，以提高重编程效率25最后，该方法也可用于制备其他树突状细胞亚型。 在体内，启动不同类型的免疫反应，例如抗病毒反应或耐受性反应14此外，我们可以利用 体内 将重编程作为一种平台，用于开展条形码筛选，以筛选转录因子组合来生成多种免疫细胞类型。这一可能性有望通过利用特定免疫细胞亚群的多样化功能特性，提高治疗策略的灵活性。

在我们之前的研究中，我们已证明免疫抑制的体内环境并不会阻碍将人类癌细胞重编程为具有免疫原性的cDC1细胞20。本文中，我们表明在小鼠中，体内重编程的速度和效率均高于体外，提示这种在体内增强的重编程现象在两个物种间具有保守性。然而，该方法的一个局限性在于初始载体递送过程中缺乏体内环境，因此无法判断环境信号是否影响体内递送效率。这一问题应通过比较不同递送体系在原位进行评估。我们已发现腺病毒载体在原位递送方面优于慢病毒载体20 ，未来可将其与非病毒递送体系进行比较，例如线性RNA、环状RNA、自我扩增RNA或小分子化合物组合26,27。

我们先前已证明，在黑色素瘤模型中，cDC1重编程可赋予癌细胞分泌促炎性细胞因子和招募淋巴细胞的趋化因子的能力，并实现MHC-I和MHC-II上的专业性抗原加工与呈递23,28这会导致肿瘤微环境（TME）从一种状态重塑为另一种状态 "免疫冷" 到一个 "免疫富集型" 通过诱导三级淋巴结构（TLS）形成，促进细胞毒性效应T细胞、NK细胞和B细胞的浸润，同时减少调节性T细胞和耗竭性T细胞等免疫抑制性细胞群体。20在患者中，对免疫治疗的积极反应与肿瘤内三级淋巴结构（TLS）的存在相关，此类结构可对肿瘤抗原持续启动T细胞和B细胞，从而产生针对肿瘤的特异性抗体应答29,30在未来，我们设想采用这种易于操作的 体内 cDC1重编程方案，用于揭示不同癌症类型中诱导三级淋巴结构新生、肿瘤微环境重塑及抗肿瘤免疫的机制，并鉴定是否刺激了肿瘤特异性抗体的产生。

我们此前观察到协同作用存在于 在体 cDC1重编程与抗PD-1或抗CTLA-4的免疫检查点阻断20。这表明 "免疫富集型" 由cDC1重编程所创造的肿瘤微环境可能为与其他免疫疗法（如过继性细胞治疗，包括T细胞受体-T细胞、嵌合抗原受体-T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞）的联合应用提供有利条件。该方法的另一优势在于可进行大规模无偏倚的组合筛选或CRISPR筛选，在耐药性肿瘤类型中对类cDC1细胞过表达或敲除免疫相关受体、细胞因子、趋化因子或淋巴毒素，从而揭示不同信号通路在增强cDC1介导的免疫应答中的作用。总之，本实验方案为广泛的科研群体提供了宝贵的资源，因为 体内 cDC1重编程是癌症免疫治疗中机制研究与治疗创新的灵活而强大的平台。

披露

C.-F.P. 在 Asgard Therapeutics AB 拥有股权利益，并担任管理职务，该公司基于体内树突状细胞重编程技术开发癌症免疫疗法。C.-F.P. 是 Asgard Therapeutics 持有的已授权专利 US 11,345,891、JP 7303743 和 CN ZL201880005047.3 以及专利申请 WO 2018/185709 和 WO 2022/243448（与 E.A. 共同发明）的发明人，这些专利涵盖了本文所述的细胞重编程方法。

致谢

我们感谢造血与免疫细胞重编程实验室的 Mariana Lopes 和 Camille Chatelain 对手稿的编辑和校对。

本研究是在瑞典研究理事会资助的国家先进治疗医药产品研究学院（National ATMP Research School）的框架下完成的。本文讨论的项目还获得了欧洲研究理事会欧盟“地平线2020”研究与创新计划（866448-TrojanDC 和 101189370）、诺和诺德基金会（Novo Nordisk Fonden，NNF22C0079466）、欧洲创新理事会（European Innovation Council，101130218-RESYNC）、瑞典癌症基金会（Cancerfonden，23 2932 Pj）、瑞典研究理事会（2020-00615）、瑞典创新局（Swedish Innovation Agency，2024-02178）、ALF（44410）、葡萄牙科学技术基金会（FCT，2022.02338.PTDC）以及葡萄牙复苏与弹性计划通过“下一代欧盟”基金（NextGenerationEU，C644865576-00000005）的共同资助。谨此感谢克努特和爱丽丝·瓦伦伯格基金会（Knut and Alice Wallenberg Foundation）、隆德大学医学院和斯科讷地区（Region Skåne）提供的慷慨财政支持。

材料可用性：

用于重编程的载体和质粒可从Asgard Therapeutics公司通过材料转移协议获得。评估本文结论所需的其他所有数据均包含在正文或补充材料中。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 低蛋白结合滤膜，150 mL 瓶顶真空过滤器Fisher Scientific15983297
2-巯基乙醇 50 mMThermoFisher Scientific31350010
抗小鼠 CD45 单克隆抗体（克隆：30-F11），大鼠 IgG2b，κThermoFisher Scientific14-0451-82
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl（CD45.1）杰克逊实验室002014
BD Micro-Fine U-100 胰岛素注射器（0.5 mL）Fisher Scientific11395751
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室000664
胶原酶 DSigma Aldrich11088882001
Corning Falcon 细胞筛（适用于 50 mL 离心管）Sigma AldrichCLS352340
Corning 盖玻片 24 × 50 mm Sigma AldrichCLS2975245
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）ThermoFisher ScientificD1306
DNase ISigma Aldrich10104159001
eBioscience 可固定活力染料 eFluor 450Invitrogen65-0863-14
eBioscience 免疫组化抗原修复液 - 低 pH（10×）ThermoFisher Scientific00-4955-58
胎牛血清（FBS）ThermoFisher ScientificA5256701
Fluoromount-G 封片介质ThermoFisher Scientific00-4958-02
GFP 抗体 [Alexa Fluor 594]Novus BiologicalsNB600-308AF594
Gibco DMEM/F-12 营养混合物（DMEM/F-12）ThermoFisher Scientific31331028
Gibco MEM 非必需氨基酸溶液（100×）ThermoFisher Scientific11140035
Gibco Opti-MEM IThermoFisher Scientific11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基ThermoFisher Scientific52400025
Gibco 丙酮酸钠（100 mM）ThermoFisher Scientific11360070
Gibco 台盼蓝溶液，0.4%ThermoFisher Scientific15250061
GlutaMAX 补充剂 ThermoFisher Scientific35050061
山羊抗大鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，多克隆，Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11006
HEK 293T 细胞ATCCCRL-11268
六亚甲基溴化物（Polybrene）Sigma AldrichH9268
HyClone 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）CytivaSH30243.01
HyClone 青霉素-链霉素溶液（100×）（Pen/Strep）CytivaSV30010
HyClone 磷酸盐缓冲液（PBS）CytivaSH30028.02
氯胺酮注射液（100 mg/mL）MSD 动物健康瑞典公司QN01AX03
切片机刀片 - C35pfm medical207500005
小鼠抗 CD45.2（104），表面标记，APC，单克隆Biolegend109814
小鼠抗 MHCII（M5/114.15.2），表面标记，PE-Cy7，单克隆Biolegend107630
正常山羊血清Abcamab7481
正常大鼠血清（无菌）Abcamab7488
敞口薄壁聚丙烯管贝克曼库尔特生命科学326823
多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇ThermoFisher Scientific043368.9M
pFUW-tetO-Batf3，编码小鼠 Batf3 的单顺反子表达盒Addgene139837
pFUW-tetO-Irf8，编码小鼠 Irf8 的单顺反子表达盒Addgene139838
pFUW-tetO-Pu.1，编码小鼠 Pu.1 的单顺反子表达盒Addgene139839
质粒 pMD2.GAddgene12259
质粒 psPAX2Addgene12260
质粒 SFFV-eGFP（eGFP）实验室内部克隆-
质粒 SFFV-mCherry（mCherry）实验室内部克隆-
质粒 SFFV-PIB-eGFP，  编码小鼠 PU.1、IRF8 和 BATF3（PIB）的多顺反子表达盒 实验室内部克隆-用于重编程的质粒和载体可通过与 Asgard Therapeutics 公司签订材料转让协议获取
聚乙烯亚胺（PEI），线性，分子量 25000，转染级Polysciences23966
ReadyProbes 防水屏障标记笔ThermoFisher ScientificR3777
丁酸钠Sigma Aldrich303410
蔗糖Sigma-AldrichS7903
SuperFrost Plus 黏附载玻片EprediaJ1800AMNZ
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek4583
TrypLE Express 酶（1×），无酚红ThermoFisher Scientific12604021
TT Cryomold 中号方模（15 × 15 × 5 mm）Sakura Finetek4566
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575020
赛拉嗪注射液（20 mg/mL）VM PharmaQN05CM92
YUMM1.7 细胞Antineo

参考文献

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