Method Article

从采样到数据独立采集质谱的神经肽表征工作流程

DOI:

10.3791/68741

⸱

August 8th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议概述了大鼠脑组织中全面的神经肽组学工作流程，该工作流程结合了数据依赖性采集-并行积累-连续片段化（DDA-PASEF）和数据独立采集（DIA）质谱。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

内源性神经肽是大脑功能的关键调节剂，在行为、压力、疼痛和稳态调节中发挥着关键作用，但它们的分析仍然很困难。从生物学上讲，它们丰度低，降解迅速，并且由前体蛋白加工而成，表达仅限于小的局部细胞群。从技术上讲，由于宽动态范围、多样化的翻译后修饰以及质谱数据集中的稀疏信号，它们的检测变得复杂。该协议概述了在timsTOF平台上使用数据依赖性采集（DDA）和数据独立采集（DIA）质谱（MS）在北 鼠 脑组织中进行神经肽分析的综合工作流程。在优化脑样品制备（包括解剖、肽提取和纯化）后，采用离子淌度气相分离进行纳米液相色谱（LC）-MS，以提高检测灵敏度和准确性。DDA 生成的光谱库支持 Skyline 中基于 DIA 的定量，从而实现高置信度的 MS2 级测量。这种集成的工作流程增加了神经肽的覆盖率并增强了定量重现性，为研究复杂脑组织中的神经肽提供了一个强大的平台。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经肽是一类功能多样的内源性信号分子，可作为神经元通讯、神经和神经内分泌系统功能的关键调节剂。它们作为神经调节剂、激素或辅助递质，影响广泛的生理过程，包括疼痛调节、压力反应、昼夜节律调节和食欲控制。与以小分子形式合成的经典神经递质不同，神经肽编码在通过翻译 mRNA 合成的大前体蛋白中。然后，前体蛋白或激素原经过蛋白水解处理以释放活性肽，这些肽被包装成密核囊泡 （DCV）。受到刺激后，神经肽被释放，通过与 G 蛋白偶联受体的相互作用发挥调节作用，通常作用较慢且持续时间更长。它们在维持中枢和周围神经系统功能方面的重要性使它们成为一个非常感兴趣的生物学和临床领域 1,2,3,4,5。

尽管神经肽具有相关性，但表征神经肽在分析上仍然具有挑战性。它们高度异质的结构——从短序列到扩展序列，通常带有不同的翻译后修饰（PTM），如酰胺化、乙酰化、磷酸化、氨基酸异构化或截断——导致质谱（MS）中电离和碎裂行为的变异性1,6,7,8 .此外，相对于生物基质成分，它们通常以低浓度存在，易于降解，并且以空间受限的方式定位在神经系统的复杂组织内。这些特征使鉴定和定量变得复杂，特别是在使用依赖于可预测的酶消化和均匀肽特性的传统蛋白质组学方法时9,10,11。

在这里，我们提出了一种鉴定和定量 Rattus norvegicus 大脑中内源性肽的综合策略，特别强调神经肽。这里的工作流程从优化的脑采样程序开始，然后是广泛的液相色谱（LC）分离，最后在捕获离子淌度谱（TIMS）平台上使用并行积累-连续碎裂（PASEF）进行高分辨率MS分析12,13,14,15,16.通过在前体选择之前结合离子淌度气相分离（IM-GPF），数据依赖性采集-PASEF（DDA-PASEF）方法能够改进前体分离并增强对低丰度神经肽的检测，否则其中许多在一维DDA工作流程中会被遗漏17。

虽然DDA由于其高质量的MS/MS谱图，仍然是肽鉴定中最常用的策略，但它本质上受到其依赖于强度前驱离子选择的限制，这对低丰度物质有偏差18,19,20。此外，其半随机采样会导致重复之间的缺失值，从而阻碍了可重复的量化。为了克服这些限制，我们使用DDA-PASEF数据构建了一个稳健的光谱库，随后可用于数据无关采集（DIA）分析。与DDA相比，DIA在规定的m/z窗口内对所有母离子进行采样，确保对丰富肽和稀有肽进行一致采样，并且当与Skyline中的光谱库和靶向分析相结合时，可以实现灵敏且可重复的MS2水平定量21,22,23,24。

这种综合方法——涵盖脑肽提取、色谱分离、离子淌度增强 MS 采集和基于 DDA/DIA 的混合定量——在开发时考虑到了神经肽的复杂性。它最大限度地提高了肽覆盖率，同时最大限度地减少了数据丢失，解决了更简单的 DDA 驱动肽组学的关键局限性。因此，我们提出了一个灵活而强大的平台来探索哺乳动物大脑中的神经肽景观，该平台可以轻松适应各种实验问题和组织样本。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中的所有动物实验均按照伊利诺伊州机构动物护理和使用委员会 （23228） 批准的动物使用方案进行，严格遵守国家和 ARRIVE 动物伦理治疗和护理标准。

1. 动物解剖和脑隔离

  1. 立即进行冷盐水灌注，然后进行组织快速冷冻，以保持神经肽的完整性，最大限度地减少降解伪影，并提高下游肽组分析的数据质量。
  2. 按照机构动物护理指南，使用CO2 方法对大鼠实施安乐死。通过没有心跳和缺乏反射来确认死亡。
  3. 将大鼠仰卧;做一个切口以暴露胸腔。
  4. 在心脏的左心室做一个小切口。
  5. 在右心房做一个小切口，让血液和灌注液流出。
  6. 将切成尺寸的塑料移液器吸头连接到装有 50 mL 冰冷生理溶液（例如 0.9% 生理盐水或 mGBSS）的 60 mL 注射器上，插入左心室。
  7. 用溶液灌注动物身体。用锋利的剪刀或断头台将老鼠斩首。
  8. 用长刀或细剪刀去除覆盖大脑的皮肤和头骨。
  9. 小心地将大脑从颅腔中抬起，根据需要切断颅神经。
  10. 立即在干冰上冷冻大脑或在干冰上冷冻异戊烷快速冷冻。
  11. 转移到标记的冷冻管或箔纸中，然后储存在 -80 °C 下。

2.从大鼠脑组织中提取肽

  1. 对于全脑样本，使用分析天平快速称量每个冷冻组织。使用含有 10% 冰醋酸和 1% 甲醇水的 LC-MS 级溶液，溶剂与组织的比例为 10：1 （v/w） 对组织进行均质化。
  2. 将均质样品在冰上孵育20分钟。
  3. 将样品在 16,000 × g 在 4 °C 下离心 20 分钟。 小心地收集上清液，不要干扰沉淀。
  4. 使用10：1（v / w）溶剂与组织的比例将沉淀重悬于LC-MS级水中，并在冰上重复孵育20分钟。
  5. 在相同条件下（16,000 × g，20 分钟，4°C）再次离心，并收集第二个上清液。
  6. 将两种上清液混合，将总体积的 1/10 转移到新管中进行下游处理。使用真空浓缩器干燥该等分试样直至完全干燥。将剩余的提取物储存在-80°C以备将来使用。

3. 使用C18离心柱进行固相萃取（SPE）

注意：所有溶剂都应为LC-MS级。除非另有说明，否则使用台式离心机在室温下以 1,500 × g 进行离心步骤。

  1. 试剂制备
    1. 制备活化液（A）：50%乙腈/50%0.1%甲酸水溶液。
    2. 制备平衡洗涤液（B）：0.1%甲酸水溶液。
    3. 制备洗脱液（C）：50%乙腈/50%0.1%甲酸水溶液。
  2. 样品制备
    1. 在 200 μL 溶液 （B） 中复溶干燥的肽提取物。
    2. 将样品在 16,000 × g 在 4 °C 下离心 10 分钟。
    3. 小心收集SPE的上清液。
  3. 色谱柱调节和平衡
    1. 向 C18 离心柱中加入 150 μL 溶液 （A）。
    2. 以 1,500 × g 离心 1 分钟。
    3. 重复步骤 3.3.1 和 3.3.2 两次以确保完全激活。
    4. 加入 150 μL 溶液 （B）。
    5. 离心1分钟。
    6. 重复步骤 3.3.4 和 3.3.5 两次。
  4. 样品装载和清洗
    1. 将 200 μL 制备的样品溶液加载到色谱柱上。
    2. 离心1分钟。
    3. 将流通液重新加载回色谱柱上 3 次，以最大限度地提高肽保留率。
    4. 加入 150 μL 溶液 （B）。
    5. 离心1分钟。
    6. 重复步骤 3.4.4 和 3.4.5 三次以去除未残留的污染物。
  5. 肽洗脱
    1. 向色谱柱中加入 150 μL 洗脱溶液 （C）。
    2. 离心1分钟。
    3. 再次重复洗脱步骤 3.5.1-3.5.2。
    4. 将两种洗脱液混合并储存在冰上或在真空下干燥。

4. LC-MS/MS 分析

  1. 配制溶液（A）：0.1%甲酸水溶液，溶液;（B）：0.1%甲酸乙腈溶液;（C）：25 fmol/μL 保留时间标准品 （iRT） 0.1% 甲酸水溶液。
  2. 在LC-MS进样之前将样品重悬于20μL溶液（C）中。
    注意：分析了两个生物样品，每个样品在 DDA 和 DIA 运行中进样五次，每个样品每种方法有五次技术重复。
  3. 使用高效液相色谱（HPLC）系统进行肽分离，流动相A由溶液（A）组成，流动相B由溶液（B）组成。
  4. 将 1 μL 样品加载到 25 个 C18 分析柱（150 μm × 250 mm，1.9 μm 颗粒，120 Å 孔径）上，并在整个运行过程中保持在 40 °C。
  5. 使用以下梯度曲线以 600 nL/min 的流速进行 LC 分离：0-5 min：2-10% B;5-85 分钟：10-45% B;85-87 分钟：45-50% B;然后是高有机洗涤和再平衡。
    注意：LC通过离子源直接耦合到timsTOF MS。
  6. 对于 DDA 分析，请在 timsTOF MS 上使用默认应用方法 DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime 。
    1. 简而言之，在启用动态排除的 PASEF 模式下作质谱仪。将每个周期设置为在 1.1 秒占空比内由 10 次 PASEF MS/MS 扫描组成。
    2. 将质量范围设置为 m/z 100-1700，离子迁移率范围为 0.60 至 1.60 V·s/cm2，斜坡时间为 100.0 ms。将碰撞能量从 20.0 eV 上升到 59.0 eV，作为离子迁移率的函数。
  7. 离子淌度气相分离 （IM-GPF）
    1. 将0.6-1.6 V·s/cm2 的离子迁移率范围分割成三个重叠窗口：0.6-1.0、0.9-1.3和1.2-1.6 V·s/cm2。
    2. 为此，请将 timsControl 或 timsControl 编辑器的 TIMS 设置点击中的移动性开始和结束值更改为相应的窗口值。
    3. 获取每个窗口的数据。对于所有离子淌度采集窗口，使用 100 ms 的恒定积累和斜坡时间。
    4. 使用步骤 4.6 中详述的相同参数在 DDA-PASEF 模式下采集数据。
  8. 对于 DIA 分析，在 400-1200 m/z 的质量范围内采用 25 m/z 的隔离窗口宽度。采用与 DDA 方法相同的离子淌度实验 （IMEX） 设置。
    1. 其他 DIA 设置包括一个 MS1 渐变，然后每个周期 16 个 MS/MS 渐变，总循环时间为 1.8 秒。
    2. 使用默认的 蛋白质组学 DIA-PASEF 方法 作为 DIA 方法开发的模板。创建 DIA 方法后，将其加载到 Hystar 的方法选项卡中 。无需激活 DIA 模式。
      注意：成功加载后，DIA 方法将自动注册。

5. 数据处理

注意：数据采集后，应使用生物信息学工具（如PEAKS Online，PEAKS Studio，MSFragger，Maxquant或类似平台）进行肽鉴定。本研究使用了 Peaks Online，能够处理 .d 格式的原始数据。

  1. 数据库搜索
    1. 使用适当的参考数据库进行肽搜索，例如精选的大鼠信号肽数据库、大鼠蛋白质组或人蛋白质组，或基于样品源的精选信号肽数据库。
      注意：这些数据库可以从 NCBI 或 UniProt （https://www.uniprot.org/） 等可靠来源获得。请注意，仅识别数据库中的蛋白质或肽。通过 UniProt 中的 “信号肽” 注释过滤大鼠蛋白质组来整理大鼠信号数据。用 Uniprot 术语来说，通过 “信号肽” 过滤意味着将蛋白质组缩小到参与分泌、膜定位或区室运输的蛋白质。该自定义数据库包含 5630 种蛋白质。将蛋白质数据库的大小从 50,000 个限制为 5,000 个具有多种优势。首先，它通过降低随机肽谱匹配的可能性来增强鉴定置信度，从而提高肽分配的准确性。其次，较小的数据库提高了计算效率，可以缩短处理时间并减少对计算资源的需求。第三，更简洁的数据库可以更好地控制错误发现率 （FDR），从而实现更可靠和统计上稳健的蛋白质鉴定。然而，数据库需要相对较大，以避免人为的置信度分数膨胀和不准确的 FDR 估计。
    2. 在程序 GUI 中使用以下推荐参数配置数据库搜索： 前驱体质量误差容限：10-25 ppm;碎片质量误差容限：0.01-0.05 Da;酶特异性：无（非特异性消化）;肽长度范围：4-45个氨基酸。
    3. 定义要包含在搜索中的 PTM 集。
    4. 完成数据库搜索后，导出每个离子迁移率窗口对应的pepxml和mzXML（或MGF）文件，包括标准的全迁移率范围（0.6-1.6 V·s/cm2）。
  2. 天际线图书馆建设
    1. 打开 Skyline 并创建一个新文档，确保选择蛋白质 组学界面 ，并使用 默认设置 ，除非另有说明。
    2. 导航到 文件>导入>肽搜索。
    3. 在 导入肽搜索 向导中，选择 构建并 添加相关的 pepxml 文件（确保相应的 mzXML 或 MGF 文件位于同一目录中）。
    4. 将 iRT 标准肽 设置为 自动，选择 DIA 作为工作流程，然后单击 下一步。
    5. 文库构建后，选择大约 10-15 个肽作为 iRT 标准品，用于跨重复比对。如果提示重新校准 iRT，请单击 确定 继续。
    6. 在 “提取色谱图 ”页面中，单击“ 浏览 ”以选择并导入所有 DIA 原始文件，然后单击 “继续”。
    7. 在 “过渡设置” 窗口中，将 前驱体电荷 范围设置为 1-5， 产品电荷 范围设置为 1-3， 离子类型 设置为 ，p，y，b，并定义 产品离子选择 从离子 2 到 最后一个离子。其他推荐设置： 离子匹配容差：0.05 Da， 拾取峰：5。
    8. 在“ 肽设置 ”窗口中，设置与 4.1.3 中描述的峰搜索设置匹配的修改。
    9. 在“ 隔离方案” 页上，输入隔离和方案的名称，然后选择“ 预先指定的隔离窗口”。单击 导入 并加载其中一个 DIA 文件以自动导入实验的隔离窗口配置。
    10. 使用以下参数设置 全扫描采集 设置。 获取方式：DIA; 产品质量分析仪：质心;隔离 方案：使用上面定义的方案; 质量精度：10-20 ppm; 迁移率分辨率：30-50;启用仅在预测放疗后 5 分钟内的扫描 ;（可选）如果需要导入 MS1 色谱图，请修改 MS1 过滤 。选择合适的质谱分析仪和分辨率，以实现最佳的 MS1 色谱图提取。
    11. 导入 FASTA 并 生成诱饵。设置 诱饵生成方法：随机播放序列。
    12. 选择酶：消化在内源性肽分析中是非特异性的。通过从下拉酶菜单中选择添加来编辑酶。将酶的名称设置为两者，将 C 端切割为 KR，将 N 端切割为 KR，允许半切割，然后单击确定。将错过的设置为 3。
    13. 导入目标 FASTA 文件，然后单击 “完成”。如果出现提示，请确认 “相关蛋白质”页面 。
    14. 确保已成功创建光谱库并已导入 DIA 数据。手动检查已鉴定的肽列表，并进行下游定量和定性分析。
  3. 定性和定量测量
    注意：定性和定量分析是在 Skyline 中完成的。有关 Skyline 中 DIA 数据分析的详细信息，请访问 https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath。
    1. 如果加载了DDA数据，请从菜单中选择设置>转换设置，在采集方法中选择DDA;在“设置”>“肽设置”中，选择“MS 1”水平进行定量。
    2. 如果加载了 DIA 数据，则在设置 >过渡设置中，在 采集方法中选择 DIA;在 “设置”>“肽设置”中，选择“MS 2 水平”进行定量。
    3. 在 “查看>文档网格”中，选择“ 肽定量”，然后选择 “导出 电子表格”。合并 DDA 结果和 DIA 结果的电子表格。
      注意：电子表格总结了所有样品中文库中所有肽的峰面积。在本实验中，肽峰面积归一化为保留时间标准肽 GISNEGQNASIK，它是 Pierce 保留时间混合物的一部分。通过计算每种肽的峰面积与标准品的峰面积之比来进行归一化。

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

具有代表性的实验方案如 图1所示。对使用标准离子迁移率范围和 IM-GPF 获取的 DDA-PASEF 数据（图 2）的分析表明，IM-GPF 方法的肽覆盖率要高得多（图 2B）。值得注意的是，使用标准 DDA-PASEF 方法鉴定的大多数肽与 IM-GPF 数据集中发现的肽重叠。为了最大限度地提高肽鉴定覆盖率，通过整合两种方法的鉴定来生成一个全面的光谱库。

使用精选的大鼠信号肽数据库对通过 DDA- 和 DIA-PASEF 获取的重复数据集（图 3）进行进一步的数据库分析，揭示了两种方法共有的 217 种蛋白质。此外，DIA-PASEF唯一鉴定出115种蛋白质，69种蛋白质是DDA-PASEF独有的。利用源自 DDA 和 IM-GPF 数据的光谱库进行的探索性分析表明，DIA-PASEF 能够可靠地检测神经肽，例如 NPAFLFQPQRF（神经肽 SF）和 YGGFMRRVGRPEWWMDYQ（源自脑啡肽原）。由于峰分配不良，在相应的DDA-PASEF数据集中无法可靠地检测到这些神经肽（图3B，C）。

从定量角度来看， 图4A 中的散点图显示DDA前体强度和DIA片段离子强度之间存在适度的正相关关系，这符合预期，因为两种方法都定量了相同的肽，但捕获了不同的离子类型。 图4B 中所示的选定肽的箱线图进一步说明了通过两种方法获得的定量测量的可重复性。箱线图显示了通过 DIA 和 DDA 测量的每种肽的相对峰面积，误差线表示技术重复之间的测量变异性。所选肽源自阿片类激素原，包括脑啡肽原 （PENK） 和抗甲诺啡原 （PDYN），这两种药物在调节疼痛和镇痛方面都起着核心作用。

figure-results-1
图 1：用于鉴定和定量大鼠脑组织内源性肽的肽组学工作流程概述。 该工作流程包括组织解剖、肽提取和纯化、使用气相分馏 （IM-GPF） 进行 LC 离子淌度-MS （LC-IM-MS） 数据采集，以及用于生成光谱库和进行定量分析的数据处理。该图的部分内容是在 BioRender 中创建的。谭，Y. （2025） https://BioRender.com/vrejrsk。请点击此处查看此图的大图。

figure-results-2
图 2：数据库肽和蛋白质鉴定。（A） 条形图，比较了在不同离子迁移率窗口中鉴定的前体、肽谱匹配 （PSM） 和独特肽的总数。（B）饼图，说明在所有移动窗口中常见识别的肽和在单个窗口中唯一检测到的肽的比例。（C，D）热图描绘了整个迁移率范围（0.6-1.6 V·s/cm2）（C）和受限迁移率窗口（0.6-1.0 V·s/cm2）（D）的离子信号在m/z和离子迁移率维度上的分布。（E）翻转图显示了使用DDA和DIA方法获取的数据集中鉴定的蛋白质数量，突出显示了共享和独特的蛋白质鉴定。（F）热图表示在DIA获得的重复（上图）和DDA获得的重复（下图）中鉴定的源自脑啡肽前体的肽。在四次 DDA 重复中的两次中未检测到白脑啡肽，这表明基于 DDA 的采集中可能存在缺失值。请点击此处查看此图的大图。

figure-results-3
图3：使用谱库对DDA-PASEF和DIA-PASEF数据进行比较和探索性分析。 （A）神经肽SF在DIA和DDA-PASEF重复中的保留时间比对。（B）来自DIA（上）和DDA（下）数据集的PENK（212-229）碎片离子的EIC。（C）来自DIA重复的神经肽SF的片段离子色谱图显示出高共洗脱和光谱质量。 请点击此处查看此图的大图。

figure-results-4
图 4：DIA-PASEF（MS2 水平）和 DDA-PASEF（MS1 水平）之间的定量测量比较。 （A） 该散点图比较了使用 DIA 和 DDA 模式获得的肽信号强度。具体来说，x 轴表示来自 DDA 的 log10 转化前体峰面积，而 y 轴表示每个肽的 DIA 的 log10 转化片段峰面积。（B）箱线图表示四种代表性肽PENK 107-133、PENK 188-195、PDYN 221-233和PDYN 235-248的相对峰面积。误差线表示技术重复之间的可变性。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在肽组学中，特别是在分析内源性肽时，保留天然肽谱对于数据完整性和生物学解释至关重要。冷盐水灌注不仅可以去除血液，还可以使大脑发冷，从而显着减少由于内源性蛋白酶的活性而迅速发生的死后蛋白水解降解。通过降低大脑温度，酶活性减慢，循环蛋白酶从脉管系统中排出，同时也减少死后代谢变化25,26。用冰冷的盐水灌注还可以冲洗大脑脉管系统中的血液。这一步尤为重要，因为血液中含有高丰度蛋白质（如白蛋白和球蛋白）和循环蛋白酶，这些蛋白酶会干扰神经肽的检测。大量血液蛋白的死后降解会增加神经肽提取物的复杂性并掩盖低丰度信号，最终损害鉴定和定量25,26,27。立即冷冻脑组织，无论是在干冰上还是在冷冻的异戊烷中快速冷冻，几乎可以立即停止酶促过程。这种保存对于检测低丰度和全长成熟神经肽并确保可靠的定量尤为重要。如果没有这些步骤，肽降解会导致变异性和伪影增加，从而影响鉴定和定量。因此，抽血、冷灌注和快速脑冷是直接影响测量前肽组学数据质量、灵敏度和可重复性的基础技术。

对从大鼠大脑中提取的肽的分析显示存在两种不同的离子迁移率羽流（图2C，D）。这种现象可能归因于不同的分子类别或肽的不同电荷态。如果羽流对应于不同的分子类别，则共洗脱的非肽物种可能会与肽竞争选择和碎裂。此外，如果分离是由电荷态的差异引起的，则含有高电荷肽的羽流有望产生更高质量的MS/MS谱图，从而有助于更可靠的肽鉴定。

为了研究这一点，我们实施了离子淌度分馏策略，获取三个离散淌度窗口的数据：0.6-1.0、0.9-1.3 和 1.2-1.6 V·s/cm²。这些窗口共同跨越了通常在标准 DDA-PASEF 肽实验中分析的整个离子迁移率范围。如 图2所示，尽管在全扫描范围内（0.6-1.6 V·s/cm2）检测到的前体总数最高，但在0.6-1.0 V·s/cm2 窗口内观察到的肽谱匹配（PSM）数量明显更多。这一发现表明，两个羽流的存在确实可能是由于其他分子的干扰。

与传统的全扫描方法相比，基于离子淌度的前体分离使肽覆盖率提高了 30%。在全扫描数据集中鉴定的肽中，大约有 82% 与使用分馏鉴定的肽重叠（图 2B），突出了分馏策略的一致性和稳健性。基于这些观察结果，我们利用离子淌度分离和全扫描数据构建光谱库，用于使用DIA-PASEF对神经内分泌肽进行定量分析。

对通过 DDA 和 DIA 获取的重复数据集进行数据库分析，发现 DIA 数据中更多的肽和蛋白质鉴定，包括 115 种由 DIA 唯一鉴定的蛋白质（图 2E）。其中包括神经肽，例如 Pro-FMRFamide 相关肽 FF 和 VF。相比之下，69 种蛋白质仅由 DDA 鉴定，其中许多与细胞粘附和神经元发育有关。这些发现表明，DDA 和 DIA 方法可以以互补的方式应用，以实现更广泛的肽覆盖范围。

进一步的分析表明，DIA采集有效地解决了使用DDA进行内源性肽分析中经常遇到的一些缺失值问题。例如，在四次DDA重复中仅检测到两次（图2F，下图），而在所有四次DIA重复中始终检测到Leu-脑啡肽（图3F，上图）。

Skyline是一个广泛用于定量蛋白质组学的平台，用于分析DDA和DIA-PASEF数据集28。该软件通过谱库匹配、片段离子共洗脱和保留时间比对促进肽鉴定。为了评估 DIA-PASEF 减少缺失鉴定的能力，我们对 DIA 数据集中专门检测到的肽进行了定性评估。

如 图3D所示，在同一保留时间窗口内，在所有DIA重复中始终检测到神经肽SF。DDA重复中的检测表现出相当大的变异性，保留时间从25分钟到45分钟不等（图3A）。观察到的不一致，包括具有低置信度分数的峰错误分配，可能是由于碎片离子覆盖率有限或质量低，如 图3B所示。相比之下， 图3C 显示，与神经肽SF相对应的片段离子在所有DIA重复中都很好地对齐，支持可靠的自动鉴定。

对源自脑啡肽原的PENK（212-229）肽的MS/MS谱图质量的比较进一步证明了DIA-PASEF的优势。相对于 DDA，从 DIA 获得的光谱表现出更高的强度和更好的碎片离子质量（图 3），这对于检测低丰度的内源性肽特别有益。

定量分析证实，DIA-PASEF在生物重复中产生了一致且可重复的测量结果，其性能与DDA相当（图4）。此外，DIA能够在MS2水平上进行定量，提供片段离子水平特异性，并提高了相对于基于MS1的DDA的肽鉴定的可信度。这些发现支持将 DIA-PASEF 用作复杂生物基质中靶向神经肽定量的可靠且有效的方法，特别是在数据完整性和可重复性至关重要的情况下。

该协议概述了神经肽分析和定量的综合策略。IM-GPF方法有助于构建高质量的光谱库。虽然与 DDA-PASEF 相比，DIA-PASEF 具有更高的重现性和更高的肽覆盖率，但它也增强了基于 MS2 的定量。结合这两种采集策略可以增加整体肽覆盖率，因为每种方法都对鉴定不同的肽做出独特的贡献（图2E）。该协议的局限性是需要充足的样品材料来支持光谱库生成和通过DDA和DIA-PASEF方法进行数据采集。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有需要披露的竞争利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所的支持，奖项编号为 P30DA018310 （J.V.S.）。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1% 甲酸水雪科学 LS118-500LC/MS级
乙酸 费舍尔科学 A11350LC/MS级
乙腈Fisher Scientific AA47138K7LC/MS级
酸Fisher Scientific PI28905LC/MS级
甲醇费舍尔科学 AA47192K7LC/MS 级
nanoELute2BrukerN/A
Pierce C18 离心柱Fisher Scientific AA47192K8
Pierce 肽保留时间校准混合物Thermo FisherA11351LC/MS 级
SpeedVac 真空浓缩器Genevachttps://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/制造商不再提供本研究中使用的特定型号。提供了当前等效模型的链接供参考
timsTOF Pro2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
WaterFisher Scientific AA47146M6LC/MS 等级
费甲

References

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