本文介绍了一种半自动化的实验方案，利用基于ImageJ的免费宏工具SCAnED对皮肤切片中的免疫细胞和非免疫细胞进行识别与定量分析。
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摘要
摘要
组织内免疫细胞与非免疫细胞的空间分布及其细胞特异性标志物的表达，为研究细胞在原位（in situ）的功能提供了关键信息。人类皮肤是一个高度复杂的器官，具有明确的结构分区，包含多种不同表型的细胞。通过多荧光标记技术，可识别并进一步表征不同的皮肤细胞群体。然而，目前尚缺乏可用于皮肤样本图像分析的非商业化工具，以实现对表皮或真皮内单个细胞的in silico细胞分割。本文提供了一套详细的实验方案，涵盖皮肤切片的免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像，以及利用我们免费提供的工具 SCAnED（Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis，皮肤表皮与真皮区室分析）进行图像分析的完整流程。SCAnED 宏工具可精确定位并分类人类皮肤表皮和真皮区室中的细胞与细胞核。我们还提供了操作指南，用于测定不同细胞及细胞区室（如细胞质和细胞核）中标志物表达的平均强度水平，并结合随附的 Python 分析流程（以可在 Google Colab 中直接运行的 Jupyter notebook 形式提供），量化表达不同水平标志物的细胞数量。本方案将帮助无经验的用户确定皮肤组织中细胞特异性的表达谱，揭示细胞在表皮和真皮区室内的空间分布特征，从而更深入地理解人类皮肤复杂的组织结构与细胞组成。
引言
在细胞水平上理解皮肤组织，并识别细胞表型、形态及其在表皮和真皮区室内的定位，对于皮肤病学研究和组织病理学至关重要1,2。在健康状态下，表皮内的细胞组成包括角质形成细胞、黑色素细胞和朗格汉斯细胞，而在炎症性皮肤病和癌症中，这种组成会显著失衡。此外，位于表皮下方并含有成纤维细胞及大多数免疫细胞的真皮内，细胞的表型和定位在疾病状态下也可能发生显著改变。因此，细胞和细胞核的分割对于评估细胞特征（如细胞数量、蛋白质表达、形态和空间分布）以及细胞核特征（如大小、形状和转录因子表达）具有重要意义，有助于深入理解皮肤稳态及其相关疾病3,4,5。
尽管已有QuPath6、CellProfiler7和ilastik8等通用图像分析平台，但这些工具通常需要大量定制和脚本编写，才能适应皮肤组织的结构复杂性和细胞形态的异质性。目前很少有工具专门针对表皮和真皮区室的自动分割进行优化，且许多现有解决方案为商业软件，无法免费获取。这些局限性使得非专业用户难以建立适用于皮肤特异性分析的高效分析流程。
本文介绍了一种针对皮肤组织及其各组分中细胞与细胞核进行分析的全面实验方案，涵盖了从组织染色到利用半自动化图像分析流程进行图像分析的所有关键步骤。我们首先详细阐述了皮肤组织的免疫荧光染色方法，包括使用E-钙黏蛋白（E-cadherin）对表皮/真皮进行区域分割，以及使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行细胞/细胞核检测。为验证目的，本研究还引入了两种目标标志物：波形蛋白（Vimentin, VIM）和CD90。建议使用经优化浓度的抗体（见表1），并采用共聚焦显微镜在激光强度、曝光时间及分辨率等参数保持一致的条件下获取图像，以确保实验的可重复性。
此外，我们介绍了自行设计的 ImageJ 工具9 宏观 SCAnED，代表 S激酶 C区室 一个分析 E表皮和 Dermis，我们提供所有必要的步骤 计算机模拟 对表皮和真皮内的细胞核及细胞进行分割与检测。用户可在两种不同的细胞核检测方法中进行选择：一种是采用简单快速的阈值分割法，另一种是使用深度学习工具StarDist。10 以及在进行SCAnED方案之前训练好的皮肤模型。与通用工具不同，SCAnED专为皮肤组织学设计，能够自动划分表皮和真皮区域，并对两个区域内的多种标志物进行一体化定量分析，性能优于通用工具。这对于缺乏编程或深度学习专业知识的研究人员尤为有用，提供了一种即用型、专用于皮肤图像分析的工具。
我们进一步展示了如何从最多五种不同目标标记物的免疫荧光图像中提取每个细胞的平均荧光强度水平。最后，我们提供了一段用于统计分析所获得的单细胞数据的 Python 代码，该代码在 Google Colab11 中编写和运行，并以 Jupyter 笔记本的形式共享。本实验方案及 SCAnED 宏工具旨在为缺乏高级免疫荧光技术和计算专业知识的皮肤研究者提供一种实用工具，用于标记并半自动量化人体皮肤样本中细胞及其标记物的表达情况，重点关注表皮和真皮区室。
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方案
1. 在石蜡包埋的皮肤切片中进行E-cadherin、VIM和CD90的免疫荧光标记以及DAPI核染色
注意：本方案展示的是石蜡包埋切片的步骤。对于新鲜和冷冻组织样本，需先固定组织切片，然后继续本方案的第 1.3 步。
- 使用风扇或烤箱熔化石蜡。
- 通过梯度乙醇（乙醇浓度逐渐降低，水含量逐渐增加）对切片进行水化（例如：二甲苯 → 100% 乙醇 → 85% 乙醇 → 70% 乙醇 → 水）。
- 根据抗原特性进行相应的抗原修复步骤。
- 用含 0.3% Triton X 的 PBS 对组织切片进行通透处理（3 × 20 分钟）（参见 表 2）。
- 用 PBS 洗涤载玻片（1 × 5 分钟）。
- 用疏水性载玻片标记笔在每个样本周围画圈，以防止液体溢出并减少试剂用量，然后晾干。
- 加入一抗（抗体缓冲液：PBS + 2% BSA）（参见 表 1 和 表 2）。将载玻片置于湿盒（加湿孵育盒）中，4°C 孵育过夜。
- 用含 0.3% Triton X 的 PBS 洗涤载玻片（3 × 5 分钟）。
- 用 PBS 洗涤载玻片（1 × 5 分钟），以去除残留的去垢剂。
- 加入二抗和羊血清（参见 表 1）。将载玻片置于避光环境中孵育 1 小时。
- 用含 0.3% Triton X 的 PBS 洗涤载玻片（3 × 5 分钟）。
- 用 PBS 洗涤载玻片（1 × 5 分钟），以去除残留的去垢剂。
- 加入 DAPI 进行细胞核染色（参见 表 1）。将载玻片置于避光环境中孵育 30 分钟。
- 用含 0.3% Triton X 的 PBS 洗涤载玻片（3 × 5 分钟）。
- 用 PBS 洗涤载玻片（1 × 5 分钟）。
- 在每个样本上滴加 1 滴荧光封片剂（约 5–15 µL），小心盖上盖玻片（必要时去除气泡）。将载玻片置于避光环境中干燥。
| 抗体 &染料 | 工作浓度 | 稀释 |
| 抗波形蛋白抗体 | 0.8 µg/mL | 1:50 |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | 1 µg/mL | 1:333 |
| 抗CD90抗体 | 1:1000 | |
| AF488 抗小鼠 | 1:500 | |
| AF568 抗兔 | 1:500 | |
| AF647 抗小鼠 | 1:500 | |
| DAPI | 1 µg/mL |
表1：抗体与染料。
| 1. 染色缓冲液 | ||
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
| BSA | 2% | 1 g |
| PBS | 1x | 50 mL |
| 总量 | 不适用 | 50 mL |
| 2. 透化缓冲液 | ||
| 试剂 | 终浓度 | 用量 |
| Triton X | 0.30% | 300 µL |
| PBS | 1x | 100 mL |
| 总量 | 不适用 | 100 mL |
表2：溶液配方。
2. 共聚焦成像
注意：本实验方案使用配备10倍物镜（NA 0.4）以及4种激光线（405 nm、488 nm、561 nm、640 nm）的共聚焦激光扫描显微镜。
- 使用荧光显微镜获取图像（示例图像见图1）。
- 使用以下扫描尺寸参数创建宏、训练StarDist模型，并尽可能用于图像采集：图像尺寸 = 4,096 × 4,096 像素（或 1,273 × 1,273 微米），位深度 = 16位，最小像素尺寸 = 0.3 微米，信噪比（SNR）≥ 3。
图1：皮肤切片的免疫荧光染色。 DAPI：标记细胞核，CD90：成纤维细胞标志物，E-cadherin：用于标记表皮，VIM：表达VIM的细胞，Merge：DAPI（品红色）、CD90（蓝色）、E-cadherin（黄色）和VIM（绿色）染色的叠加图像。比例尺 = 100µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 使用 SCAnED 宏进行图像分析（补充文件 1、补充视频 S1 和补充视频 S2）
- 启动宏（SCAnED.mp4 视频）。
- 使用 Bio-Formats 及默认设置在 Fiji/ImageJ 中打开免疫荧光图像。
注意：此步骤中不要拆分通道。 - 通过导航至 Plugins | Macros | Run 下载并运行 SCAnED 宏，并选择 SCAnED 宏脚本（补充文件 1）。
- 按照宏提供的屏幕逐步说明进行操作。
- 使用 Bio-Formats 及默认设置在 Fiji/ImageJ 中打开免疫荧光图像。
- 使用 SCAnED 宏对表皮和真皮进行 in silico 分割。
- 提示时选择 E-cadherin 通道。
- 通过导航至 Image | Adjust | Threshold 手动调整阈值，并点击 OK，以完整捕获表皮区域的 E-cadherin 通道信号。
- 如有需要，通过在 ImageJ 中选择 Flood Fill Tool 图标，点击表皮上部区域并点击 OK，确认“溢出填充”步骤以闭合 E-cadherin 掩膜中的间隙（参见 补充图 S1A-E 及讨论部分中的故障排除提示）。
- 如果掩膜被反转，在提示时选择 Yes 和 OK 以反转选区；否则选择 No 和 OK（参见 补充图 S1F,G 及讨论部分中的故障排除提示）。
- 提示时选择 DAPI 通道。表皮-真皮分割前后核图像如 图 2 所示。
- 使用阈值函数进行核分割
- 自动定义强度水平。
- 使用 StarDist 进行核分割
- 在 ImageJ 中打开 StarDist（图 3）。
- 将核检测模型（补充文件 2）加载到 StarDist 图形用户界面（图 4）。用于构建 StarDist 模型的相应训练样本对如 补充图 S2 所示。
注意：若出现 StarDist 错误，应使用 Tensor Flow 1.15 版本（参见 补充图 S3）。 - 首先点击核通道。
- 相应调整瓦片（tile）设置（确保瓦片数量与预期的图像块大小匹配（256 × 256 像素））（参见 图 3 和 图 4）。
注意：StarDist 分割所需时间取决于核的数量。
- 核蛋白强度测量与定量
注意：在运行 SCAnED 前，请前往 Analyze | Set Measurements 并配置参数，以确保输出数据准确且相关（图 5）。- 提示时选择 Yes，以测量核内标志物的强度。
- 选择适当的标志物通道（最多五个）。
- 按照宏的指示将结果保存为 CSV 文件。
- 对每个通道重复此操作。
- 所有通道处理完成后，按照宏的指示将结果保存为 CSV 文件。
注意：为便于可视化，后续分析中我们包含了一个特定皮肤区域的放大视图（图 6）。
- 细胞分割（胞质区域）
注意：细胞分割基于核 ROI 的扩展，因此必须在核分割完成后启动。- 若使用阈值函数进行核分割，则应用二值膨胀（binary dilation）。
- 若使用 StarDist 进行核分割，则使用扩大扩展（enlargement expansion），该方法处理时间较长（参见 补充图 S4）。
- 胞质蛋白强度测量与定量
- 选择 Yes 以测量整个细胞中标志物的强度。
- 按照宏的指示保存结果 CSV 文件。
- 按顺序对每个标志物通道重复此操作。
- 核和细胞测量应保持相同的通道顺序，以确保输出数据的一致性。
- 每当宏提示时选择 Discard，以避免表皮与真皮之间的核数据混淆。图 7 展示了基于阈值分割的所有步骤。
图 2：表皮和真皮细胞核的通道特异性分析与分离。 DAPI免疫荧光染色显示了完整皮肤中细胞核的形态和空间分布（左图）。DAPI染色的表皮细胞核在细胞核通道中的呈现，揭示了表皮区室中细胞核的分布情况（中图）。DAPI染色的真皮细胞核在细胞核通道中的呈现，展示了真皮区室中细胞核的分布（右图）。比例尺 = 100µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：使用“StarDist”选项。 截图展示了“StarDist 2D”选项在菜单/插件/StarDist/StarDist 2D 中的位置。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：使用细胞核检测模型的说明。下载“nuclei_detection_model.zip”文件，并在浏览部分中提供该文件的路径。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：配置测量设置。（A）截图突出显示菜单中“设置测量”（Set Measurements）选项的位置，用于自定义后续分析的测量参数。（B）“设置测量”（Set Measurements）对话框，显示用于调整测量设置的界面，允许用户指定数据采集和分析的参数。请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：特定区域的放大视图。（A）DAPI（品红色）与VIM（绿色）染色的叠加图像。（B）A图中特定区域的放大视图，详细展示了皮肤组织中VIM的表达情况。请注意表皮和真皮中细胞核形态的差异。比例尺 = 100 µm（A），20 µm（B）。请点击此处查看该图的高清版本。
图7：通过阈值法对表皮和真皮中的细胞核及细胞进行SCAnED分割。（A）整张图像：DAPI（品红色）与VIM（绿色）染色的合并图。上半部分：（B）分离后表皮细胞核的DAPI与VIM染色合并图。（C）通过阈值法获得的表皮细胞核掩膜。（D）将表皮细胞核的细胞核分割结果叠加至DAPI与VIM合并图像上，有助于可视化表皮区室内的细胞核分布。（E）将表皮细胞核的细胞分割结果叠加至DAPI与VIM合并图像上，通过阈值和膨胀处理有助于可视化表皮区室内的细胞核分布，因其显示的选择区域大于细胞核。下半部分：（F）分离后真皮细胞核的DAPI与VIM染色合并图。（G）通过阈值法获得的真皮细胞核掩膜。（H）将真皮细胞核的细胞核分割结果叠加至DAPI与VIM合并图像上，有助于可视化真皮区室内的细胞核分布。（I）将真皮细胞核的细胞分割结果叠加至DAPI与VIM合并图像上，有助于可视化真皮区室内的细胞核分布。比例尺 = 20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
4. 提取的单细胞数据的分类与可视化（补充视频 S3）
注意：每个免疫荧光标记会生成两个 CSV 文件：一个用于表皮区室，另一个用于真皮区室。
- 使用同型对照样本建立标记物特异性的强度阈值。
- 使用提供的 Jupyter Notebook 将 SCAnED 宏生成的 CSV 输出文件导入 Google Colab。首先下载相应的 Jupyter Notebook（例如 补充文件 3 或 补充文件 4），前往 Google Colab（https://colab.research.google.com/），点击 文件，打开笔记本，选择文件，逐个运行代码单元。当提示 选择文件 时，点击按钮并上传 .csv 文件。
- 针对每种抗体，计算同型对照的平均荧光强度。为确定每种抗体的截断值，打开 DotPlot 笔记本（补充文件 4），上传相应的同型对照文件，并运行代码。
- 根据同型对照和特异性抗体图谱中点的分布情况，选择适当的强度阈值以区分背景信号（同型对照）与真实信号（特异性染色）。使用这些值作为截断值，将单个细胞分类为标记物表达阳性或阴性。
- 将实验样本中的标记物强度与计算所得的阈值进行比较。
- 将强度 ≥ 阈值的细胞分类为阳性。
- 将强度 < 阈值的细胞分类为阴性。
- 根据标记物表达组合对亚群进行分类，例如识别单阳性、双阳性或三阳性细胞群体。
- 使用两种类型的图谱可视化标记物表达的分布及相互关系：
- 生成直方图并叠加直方图，通过运行 直方图 代码（下载 补充文件 3，前往 Google Colab（https://colab.research.google.com/），点击 文件，打开笔记本，选择文件，运行代码）比较不同条件之间的强度分布（例如对照皮肤与病变皮肤）（图 8）。
- 生成点图，通过运行 DotPlot 代码（下载 补充文件 4，前往 Google Colab（https://colab.research.google.com/），点击 文件，打开笔记本，选择文件，运行代码）模拟流式细胞术风格的散点图，用于评估共表达模式（图 9）。
- 导出处理后的数据，以便使用统计学检验进行进一步分析并评估显著性差异。
图 8：VIM 阳性细胞平均强度的叠加直方图比较。该叠加直方图比较了健康样本（H，蓝色）与银屑病样本（P，橙色）在真皮层中 VIM 阳性细胞的平均强度。请点击此处查看该图的放大版本。
图9：点图上的双阳性信号。 本图展示了双染色点图，有助于更清晰地分辨单阳性、双阳性和双阴性细胞群。此示例显示了CD90和VIM在（A）健康皮肤和（B）银屑病皮肤的真皮层，以及（C）健康皮肤和（D）银屑病皮肤样本的表皮层中的双染色结果。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
在之前的一项研究中，我们成功应用SCAnED检测并量化了人皮肤真皮层细胞中赖氨酰氧化酶（LOX，一种胞质蛋白）以及转录因子缺氧诱导因子1（HIF-1）的表达水平12，凸显了该工具在皮肤研究中的适用性。
为了进一步评估我们的皮肤分割宏在表皮和真皮区室中识别细胞和细胞核的精确性，我们使用 DAPI 和 E-钙黏蛋白对石蜡包埋的健康皮肤和银屑病炎症皮肤组织样本进行染色，以分割细胞核以及表皮/真皮结构，并结合波形蛋白（VIM）和 CD90 作为目标分子的代表性标志物。VIM 是一种 III 型中间丝蛋白，VIM 和 CD90 均主要在真皮间充质细胞（如成纤维细胞）中表达，少数表皮细胞（如朗格汉斯细胞、其他免疫细胞和黑色素细胞）也表达这些标志物13,14。在银屑病（一种慢性炎症性皮肤病）中，免疫细胞向皮肤的浸润在表皮和真皮中均增加，且与健康皮肤相比，真皮中的成纤维细胞数量也有所升高12
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讨论
SCAnED 方案是一种用于对人体皮肤组织中免疫细胞和非免疫细胞进行区室特异性分析的半自动化方法。该流程结合基于 E-钙黏蛋白的染色方案，实现表皮与真皮的分割，利用 DAPI 进行细胞核和细胞检测，随后通过基于 ImageJ 的宏程序量化细胞核和细胞中标志物的表达水平。此外，我们指导用户使用 Python 分析流程，以可视化提取的单细胞数据。该方案具有灵活性，支持对最多五种不同目标标志物进行分析。
SCAnED 的优势之一是能够区分表皮和真皮区域。在针对感染或炎症过程中免疫细胞浸润至特定皮肤区域的研究中，对细胞进行分区分析对于实现准确定量至关重要。例如，对健康皮肤样本与银屑病（一种炎症性皮肤病）患者皮肤样本的比较显示，在健康皮肤的表皮中仅有约 5% 的 VIM 阳性细胞，而在银屑病样本中该比例上升至约 8%。这一发现与先前已发表的研究结果14,15一致，证实了本方案能够灵敏地检测到与疾病相关的、特定区室的细胞组成变化。
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
该图像分析流程的开发由下奥地利州政府作为多瑙河过敏研究集群项目的一部分以及费林格癌症研究基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.3% Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma Aldrich | ||
| CD90 | Cell Signaling | D3V8A | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| 去离子水 | |||
| E-cadherin | Abcam | ab1416 | |
| 荧光封片介质 | Dako | S3023 | |
| 山羊抗小鼠IgG1交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记 （AF 488抗小鼠） | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| 山羊抗小鼠IgG2a交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记（AF 647抗小鼠） | Thermo Fisher Scientific | A-21241 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568标记（AF 568抗兔） | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 山羊血清 | Agilent Technologies Österreich GmbH, Dako | X0907 | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Vimentin | Dako | M7020 | |
| 材料 | |||
| 孵育盒（湿盒） | |||
| 盖玻片 | Thermo Fisher | ||
| 用于染色的疏水性液体排斥记号笔 | Daido Sangyo | Z377821 | 24x50mm |
| 溶液 | |||
| 通透缓冲液（含0.3% Triton X的PBS） | 参见表2 | ||
| 染色缓冲液（含2% BSA的PBS） | 参见表2 | ||
| 软件与数据集 | |||
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | FV3000（基于倒置IX83） | 配备10倍物镜（NA 0.4）和4种激光光源（405 nm、488 nm、561 nm、640 nm，Coherent） |
| Fiji（ImageJ） | V1.54h | ||
| Google Colab | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc. | Prism 10 | 用于进一步的统计分析 |
| HALO | Indica Labs | ||
| Python程序 | Python 3.11.12 | ||
| QuPath | 开源软件（Bankhead, P. 等, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5） | v0.5.1 | |
| StarDist | 安装TF1.15.0 CPU版本 |
参考文献
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