SCAnED——一种用于表皮和真皮皮肤区室中半自动细胞与细胞核检测的开源皮肤分割宏工具

摘要

本文介绍了一种半自动化的实验方案，利用基于ImageJ的免费宏工具SCAnED对皮肤切片中的免疫细胞和非免疫细胞进行识别与定量分析。

摘要

组织内免疫细胞与非免疫细胞的空间分布及其细胞特异性标志物的表达，为研究细胞在原位（in situ）的功能提供了关键信息。人类皮肤是一个高度复杂的器官，具有明确的结构分区，包含多种不同表型的细胞。通过多荧光标记技术，可识别并进一步表征不同的皮肤细胞群体。然而，目前尚缺乏可用于皮肤样本图像分析的非商业化工具，以实现对表皮或真皮内单个细胞的in silico细胞分割。本文提供了一套详细的实验方案，涵盖皮肤切片的免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像，以及利用我们免费提供的工具 SCAnED（Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis，皮肤表皮与真皮区室分析）进行图像分析的完整流程。SCAnED 宏工具可精确定位并分类人类皮肤表皮和真皮区室中的细胞与细胞核。我们还提供了操作指南，用于测定不同细胞及细胞区室（如细胞质和细胞核）中标志物表达的平均强度水平，并结合随附的 Python 分析流程（以可在 Google Colab 中直接运行的 Jupyter notebook 形式提供），量化表达不同水平标志物的细胞数量。本方案将帮助无经验的用户确定皮肤组织中细胞特异性的表达谱，揭示细胞在表皮和真皮区室内的空间分布特征，从而更深入地理解人类皮肤复杂的组织结构与细胞组成。

引言

在细胞水平上理解皮肤组织，并识别细胞表型、形态及其在表皮和真皮区室内的定位，对于皮肤病学研究和组织病理学至关重要^1,2。在健康状态下，表皮内的细胞组成包括角质形成细胞、黑色素细胞和朗格汉斯细胞，而在炎症性皮肤病和癌症中，这种组成会显著失衡。此外，位于表皮下方并含有成纤维细胞及大多数免疫细胞的真皮内，细胞的表型和定位在疾病状态下也可能发生显著改变。因此，细胞和细胞核的分割对于评估细胞特征（如细胞数量、蛋白质表达、形态和空间分布）以及细胞核特征（如大小、形状和转录因子表达）具有重要意义，有助于深入理解皮肤稳态及其相关疾病^3,4,5。

尽管已有QuPath⁶、CellProfiler⁷和ilastik⁸等通用图像分析平台，但这些工具通常需要大量定制和脚本编写，才能适应皮肤组织的结构复杂性和细胞形态的异质性。目前很少有工具专门针对表皮和真皮区室的自动分割进行优化，且许多现有解决方案为商业软件，无法免费获取。这些局限性使得非专业用户难以建立适用....

方案

1. 在石蜡包埋的皮肤切片中进行E-cadherin、VIM和CD90的免疫荧光标记以及DAPI核染色

注意：本方案展示的是石蜡包埋切片的步骤。对于新鲜和冷冻组织样本，需先固定组织切片，然后继续本方案的第 1.3 步。

1. 使用风扇或烤箱熔化石蜡。
2. 通过梯度乙醇（乙醇浓度逐渐降低，水含量逐渐增加）对切片进行水化（例如：二甲苯 → 100% 乙醇 → 85% 乙醇 → 70% 乙醇 → 水）。
3. 根据抗原特性进行相应的抗原修复步骤。
4. 用含 0.3% Triton X 的 PBS 对组织切片进行通透处理（3 × 20 分钟）（参见 表 2）。
5. 用 PBS 洗涤载玻片（1 × 5 分钟）。
6. 用疏水性载玻片标记笔在每个样本周围画圈，以防止液体溢出并减少试剂用量，然后晾干。
7. 加入一抗（抗体缓冲液：PBS + 2% BSA）（参见 表 1 和 表 2）。将载玻片置于湿盒（加湿孵育盒）中，4°C 孵育过夜。
8. 用含 0.3% Triton X 的 PBS 洗涤载玻片（3 × 5 分钟）。
9. 用 PBS 洗涤载玻片（1 × 5 分钟），以去除残留的去垢剂。
10. 加入二抗和....

结果

在之前的一项研究中，我们成功应用SCAnED检测并量化了人皮肤真皮层细胞中赖氨酰氧化酶（LOX，一种胞质蛋白）以及转录因子缺氧诱导因子1（HIF-1）的表达水平¹²，凸显了该工具在皮肤研究中的适用性。

为了进一步评估我们的皮肤分割宏在表皮和真皮区室中识别细胞和细胞核的精确性，我们使用 DAPI 和 E-钙黏蛋白对石蜡包埋的健康皮肤和银屑病炎症皮肤组织样本进行染色，以分割细胞核以及表皮/真皮结构，并结合波形蛋白（VIM）和 CD90 作为目标分子的代表性标志物。VIM 是一种 III 型中间丝蛋白，VIM 和 CD90 均主要在真皮间充质细胞（如成纤维细胞）中表达，少数表皮细胞（如朗格汉斯细胞、其他免疫细胞和黑色素细胞）也表达这些标志物^13,14。在银屑病（一种慢性炎症性皮肤病）中，免疫细胞向皮肤的浸润在表皮和真皮中均增加，且与健康皮肤相比，真皮中的成纤维细胞数量也有所升高¹²

讨论

SCAnED 方案是一种用于对人体皮肤组织中免疫细胞和非免疫细胞进行区室特异性分析的半自动化方法。该流程结合基于 E-钙黏蛋白的染色方案，实现表皮与真皮的分割，利用 DAPI 进行细胞核和细胞检测，随后通过基于 ImageJ 的宏程序量化细胞核和细胞中标志物的表达水平。此外，我们指导用户使用 Python 分析流程，以可视化提取的单细胞数据。该方案具有灵活性，支持对最多五种不同目标标志物进行分析。

SCAnED 的优势之一是能够区分表皮和真皮区域。在针对感染或炎症过程中免疫细胞浸润至特定皮肤区域的研究中，对细胞进行分区分析对于实现准确定量至关重要。例如，对健康皮肤样本与银屑病（一种炎症性皮肤病）患者皮肤样本的比较显示，在健康皮肤的表皮中仅有约 5% 的 VIM 阳性细胞，而在银屑病样本中该比例上升至约 8%。这一发现与先前已发表的研究结果^14,15一致，证实了本方案能够灵敏地检测到与疾病相关的、特定区室的细胞组成变化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3% Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma Aldrich
CD90	Cell Signaling	D3V8A
DAPI	Roche	10236276001
去离子水
E-cadherin	Abcam	ab1416
荧光封片介质	Dako	S3023
山羊抗小鼠IgG1交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488标记 （AF 488抗小鼠）	Thermo Fisher Scientific	A-21121
山羊抗小鼠IgG2a交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记（AF 647抗小鼠）	Thermo Fisher Scientific	A-21241
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568标记（AF 568抗兔）	Thermo Fisher Scientific	A-11011
山羊血清	Agilent Technologies Österreich GmbH, Dako	X0907
PBS	Gibco	14190-094
Vimentin	Dako	M7020
材料
孵育盒（湿盒）
盖玻片	Thermo Fisher
用于染色的疏水性液体排斥记号笔	Daido Sangyo	Z377821	24x50mm
溶液
通透缓冲液（含0.3% Triton X的PBS）			参见表2
染色缓冲液（含2% BSA的PBS）			参见表2
软件与数据集
共聚焦激光扫描显微镜	Olympus	FV3000（基于倒置IX83）	配备10倍物镜（NA 0.4）和4种激光光源（405 nm、488 nm、561 nm、640 nm，Coherent）
Fiji（ImageJ）		V1.54h
Google Colab	Google
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Prism 10	用于进一步的统计分析
HALO	Indica Labs
Python程序		Python 3.11.12
QuPath	开源软件（Bankhead, P. 等, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5）	v0.5.1
StarDist			安装TF1.15.0 CPU版本