由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

摘要

该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内 肿瘤的形成

摘要

在真实环境中有效模拟疾病对于增进我们对多种病理机制的理解至关重要。在这方面，类器官相较于传统的二维模型能够提供更为逼真的环境 体外同样，同源小鼠模型还允许研究人员研究更完整的肿瘤-宿主相互作用，例如与免疫系统之间的相互作用， 体内在此，我们提供了一项完整的实验方案，用于从小鼠体内分离输卵管上皮细胞——高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的起源细胞，并将其建立为原代类器官培养物，以及其后续的 体外 培养与维持。随后，我们描述如何利用遗传工程技术，例如慢病毒或逆转录病毒介导的基因过表达，以及CRISPR-Cas9基因敲除，对这些细胞系进行修饰，将其转化为癌前类肿瘤体。我们还报道了如何利用它们进行 体外 验证，通过提取遗传物质和免疫荧光染色进行。最后，我们说明如何将这些肿瘤类器官有效注射至高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的原位——卵巢囊，以启动肿瘤形成。

引言

高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）仍是一种认知不足且致死率极高的疾病。长期以来，缺乏能够真实反映HGSOC生物学特性及治疗反应的体外（in vitro）和体内（in vivo）模型，严重阻碍了该领域的进展。例如，多项（甚至可能是大多数）研究使用的细胞系并不具备HGSOC的关键基因组/遗传特征，导致其研究结果的相关性受到质疑^1,2,3,4。以常用的ID8同源小鼠模型为例，该模型来源于卵巢表面上皮（OSE），且Trp53为野生型⁵。相比之下，大多数甚至全部HGSOC起源于输卵管上皮（FTE）⁶，且HGSOC几乎普遍存在TP53突变或失活⁷。研究人员随后尝试通过在该模型中引入Trp53突变加以修正⁵，但由于Trp53突变是HGSOC发病过程中的早期事件，这一改造可能在该细胞系的转化过程中介入过晚，因此很可能无法真实模拟HGSOC的正常发生发展过程。

在过去十年中，研究人员尝试通过构建更接近真实的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）模型来改善这一状况。例如，通过基因工程小鼠模型（GEMMs），在缪勒管谱系细胞中引入相关突变，通常借助 Cre 重组酶系统来调控发病过程，从而在 in vivo^8,9,10 条件下更好地模拟疾病。然而，这些模型通常构建复杂，且可能存在 Cre 泄漏、Cre 效应或"旁效应"^11,12,13 等其他问题。在此背景下，同源性类器官模型似乎为希望在 in vitro 和 in vivo 条件下更准确模拟该疾病的科研人员提供了一种稳健的折中方案^{14,15,16,17,18,19}。事实上，目前大多数可用且被广泛使用的 HGSOC 模型均为二维模型，但它们无法充分模拟细胞外基质（ECM）的复杂性，而 ECM 是影响细胞生物学行为的关键因素。类器官是由干细胞来源的自组织三维组织，能够在培养皿中重现器官早期的结构与功能复杂性²⁰。其构建通常通过将具有多能性的单个细胞悬浮于基底膜基质（BMM）（如 Matrigel²¹）中实现。In vitro 条件下，这些模型相较于二维模型能更准确地再现 in vivo 环境。同时，由于其同源性特征，这些模型可被移植至具有完整免疫系统的小鼠体内，从而更真实地重建疾病的发生与发展过程^14,15。这一优势明显优于患者来源的异种移植模型（PDX），后者虽然具有最接近真实的肿瘤遗传背景，但必须移植到免疫缺陷小鼠模型中才能实现移植。

在本实验方案中，我们描述了如何建立同基因型高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）类器官模型。该流程包括从小鼠输卵管上皮（FTE）组织中分离并建立原始野生型类器官培养体系，通过基因工程手段构建具有疾病相关基因型的类器官，最终将其移植回卵巢囊腔以生成完全发育的肿瘤。我们还补充了几项常用实验的附加方案，例如免疫荧光（IF）染色 体外 类器官及细胞系的二维转化，用于大规模细胞生产，例如用于注射。本方案面向希望构建具有可控遗传背景的HGSOC同基因型类器官模型的研究人员，旨在更真实地研究HGSOC生物学特性 体外 肿瘤微环境中的条件及其相互作用 体内.

方案

所有动物组织采集和操作均在纽约州纽约市亚历山大生命科学中心和纽约大学朗格尼医学中心珀尔马特癌症中心的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准下，遵循伦理规范进行。

1. 材料准备

1. 小鼠类器官培养基（MOM）的配制
   1. 通过混合表1中的成分来制备基础培养基。
      注意：培养基在4 °C下可稳定保存长达一个月。
2. 二维培养基（2D 培养基）的配制
   1. 在含丙酮酸钠和高糖的DMEM培养基中加入重组小鼠表皮生长因子（EGF，终浓度50 ng/mL）、胰岛素-转铁蛋白-硒（终浓度分别为胰岛素10 mg/L、转铁蛋白5.5 mg/L、硒6.7 µg/L）、3%热灭活胎牛血清（FBS）以及青霉素-链霉素（终浓度100 U/mL）。
3. 消化液的配制
   1. 将胶原酶/透明质酸酶（终浓度3000 U/mL胶原酶，1000 U/mL透明质酸酶）与含丙酮酸钠和高糖的DMEM培养基按1:10比例混合。将混合液以每管1 mL分装至1.5 mL微量离心管中。分装后于-20 °C保存，并在冰上解冻使用。
   2. 将DNA酶I（10,000 U/mL）和分散酶（Dispase，5 U/mL）分别分装成单次使用量。
   3. 待一份胶原酶/透明质酸酶与DMEM的混合液解冻后，加入DNA酶I（10 µL，100单位）和分散酶（25 µL，0.1单位）。
      注意：该消化液也可用于消化不超过0.5 g的肿瘤组织。
4. 基底膜基质（BMM）的处理
   1. 长期储存BMM应置于-80 °C。为避免反复冻融，建议将BMM以每管1 mL分装至1.5 mL离心管中。解冻时可将分装管置于冰上2小时，或在4 °C过夜。
      注意：BMM在室温（RT）下会凝固。因此，建议始终将BMM管置于冰上或冷藏管架上。移液时应使用已在-20 °C冰箱中预冷至少2小时的吸头。

2. 小鼠输卵管上皮细胞的分离

1. 在37 °C下解冻一份BMM、预热TrypLE Express酶，并预热一块24孔板（将培养板置于培养箱中24小时以获得最佳效果）。随后准备操作区域：体视显微镜下用于解剖和清洗组织的工具、含冷PBS + P/S的培养皿，以及温热的消化液混合物。
2. 采用二氧化碳窒息法处死雌性C57BL/6J小鼠。根据IACUC要求，实施二次处死方法（颈椎脱位）。
3. 解剖并取出卵巢和输卵管，转移至含有DMEM + P-S、置于4 °C的无菌培养皿中。在体视显微镜下，使用精细镊子和剪刀去除卵巢上残留的脂肪组织，并将输卵管（漏斗部及远端壶腹部的一部分）从卵巢和子宫上分离。
   注意：操作过程中应避免工具接触小鼠皮肤或毛发，以防微生物污染。
4. 将组织转移至含有完全消化液的离心管中，用精细剪刀将输卵管剪切成小块（<0.5 mm）。在37 °C下孵育40–50分钟。
5. 消化完成后，以350 × g离心5分钟，弃去上清液。加入500 µL预热的TrypLE Express酶液，在37 °C下孵育15分钟。
6. 用含3% FBS的DMEM（2D培养基）500 µL终止消化反应。将混合物经70 µm细胞滤网过滤至新的微量离心管中，以350 g离心5分钟，弃去上清液。
7. 将细胞沉淀（根据所用输卵管数量不同，可能 barely visible）重悬于12.5 µL类器官小鼠培养基中，短暂冰上孵育。与37.5 µL冰上预冷的BMM混合，将全部体积（50 µL）接种至预热的24孔板各孔底部。
8. 将培养板置于37 °C环境中至少20分钟，但不超过48小时，以使BMM凝固。转移培养板至培养箱时需小心，避免扰动形成的凝胶穹顶结构。
9. 沿孔壁轻轻加入500 µL预热的MOM至每个孔中。切勿将培养基直接加至凝胶穹顶上，以免造成损伤或脱落。盖上培养板盖子，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。

3. 小鼠输卵管上皮类器官的维持

1. 更换培养基
   1. 使用未过滤的无菌10 µL吸头，在将培养板倾斜45°的情况下，从孔底部吸取培养基。如果类器官穹顶从孔底脱落，请在脱落的穹顶位于孔底部时，小心地从孔顶部吸取培养基。
   2. 将750 µL预热至37 °C的MOM沿孔壁缓慢加入，加样枪头紧贴孔壁。
   3. 每2至3天更换一次培养基，或直至培养基颜色由粉红色变为黄色。若更换培养基后不到24小时即变黄，则表明类器官已准备就绪，可进行传代。
2. 类器官传代
   1. 移除培养基，并用500 µL冷（4 °C）PBS清洗每个孔。吸除PBS后，直接向BMM穹顶中加入500 µL冷（4 °C）细胞回收溶液以溶解BMM。持续吹打直至BMM完全溶解，然后将其转移至1.5 mL离心管中。
   2. 将离心管置于冰上30分钟，同时将培养板放回培养箱以保持温度。若使用新培养板，请确保其已在37 °C预热24小时。
      注意：若传代的BMM穹顶超过2个50 µL（例如在下文所述扩增过程中），为获得最佳效果，可能需要将冰上孵育时间延长至超过30分钟。
   3. 在4 °C条件下以350 g离心5分钟。小心吸除上清液，避免吸走沉淀，并用500 µL冷PBS洗涤。重复此步骤三次。
      注意：若无冷离心机，可在每次洗涤之间将离心管置于冰上或冷金属架上冷却。
   4. 最后一次洗涤后，在4 °C条件下以350 g离心5分钟，吸除上清液，并加入500 µL预热（37 °C）的TrypLE Express酶溶液。为避免因吹打导致细胞损失，可将离心管在细胞培养超净台的通风口格栅上来回轻拖，以混匀细胞。
   5. 将离心管在37 °C孵育30至60分钟。
      注意：孵育时间可根据类器官基因型和传代次数进行调整，部分类器官可能需要更长时间的消化才能获得单细胞悬液。
   6. 加入500 µL DMEM + 3% HI FBS终止细胞解离过程，并通过上下吹打混合，直至溶液均匀。
   7. 以350 × g离心5分钟，吸除上清液至剩余约20 µL体积。建议使用P20移液器手动移除残余上清液，而非使用真空抽吸装置，因为此步骤中容易误吸沉淀。
   8. 将细胞重悬于100 µL冷（4 °C）MOM中，并测定细胞浓度。根据需要进行细胞稀释并置于冰上保存。随后使用预先在-20 °C储存的移液枪头，将细胞悬液与冰冻BMM混合。
      注意：建议制备两个50 µL的BMM穹顶，细胞密度为2 × 10⁵ cells/mL，MOM与BMM体积比为1:4。因此，应准备25 µL细胞悬液（MOM中细胞浓度为8 × 10⁵ cells/mL）与75 µL BMM，总体积100 µL，分装为两个穹顶。如此操作，每个穹顶实际接种细胞数为1 × 10⁴个细胞。
   9. 将每个50 µL的BMM穹顶接种于预热的24孔板各孔中央。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中至少30分钟，使BMM凝固。随后如步骤3.1.2所述，加入500 µL 37 °C的MOM，并将培养板放回培养箱。
3. 扩增
   1. 为将类器官培养扩增至（预热的）6孔板，需准备五个50 µL的BMM穹顶，细胞密度为8 × 10⁵ cells/mL。将细胞重悬于总共62.5 µL MOM中，与187.5 µL冰冻BMM混合，将五个穹顶接种于同一孔内。
   2. 将培养板放入培养箱30分钟，使BMM凝固。随后如步骤3.1.2所述，加入2 mL 37 °C的MOM，并将培养板放回培养箱。根据需要更换培养基，直至细胞达到汇合状态。
      注意：为收集用于传代的细胞，应使用1 mL细胞回收溶液代替500 µL，并在冰上孵育45分钟而非30分钟。
4. 冷冻保存
   1. 为长期保存类器官，按步骤3.2.1–3.2.7进行传代操作。随后将细胞重悬于250 µL类器官冻存液（80% MOM、10% FBS和10%二甲基亚砜（DMSO））中，转移至冻存管。每支冻存管冻存1 × 10⁵个细胞。
   2. 将冻存管放入程序降温盒（如Mr. Frosty）中，置于-80 °C冰箱缓慢降温。长期保存时，应将细胞存于液氮或-150 °C超低温冰箱中。

4. 对小鼠FTE来源类器官进行遗传修饰以建立新型细胞系

1. 通过离心转导法进行转导（慢病毒或逆转录病毒）
   1. 将25 µL MOM与75 µL BMM混合，置于冰上（4 °C，以确保BMM充分冷却）后，加入一个预冷的孔中 "湿润" 在48孔板中（每孔）加入BMM，37 °C孵育30至60分钟，使BMM凝固，然后接种细胞。
   2. 从类器官（步骤 3.2.5）中获取单细胞，并接种约 2 × 10⁴ 置于BMM上方，加入200 µL预热（37 °C）的MOM，于37 °C、5% CO₂条件下培养₂ 48 小时。
   3. 以所需的浓度加入病毒。通过实验确定感染复数（MOI）；建议MOI低于30%。
      注意：类器官相较于二维细胞系更难感染，即使在高病毒滴度下也预期感染复数（MOI）较低。将细胞在 600 × g 32 °C 下孵育 60 分钟。离心接种结束后，将培养板放回培养箱。
   4. 8小时后，移除培养基，然后在细胞上加入25 µL MOM与75 µL BMM的混合液 "三明治" 在BMM中培养，使类器官能够在三维环境中自然生长。将培养板放入培养箱中孵育30–60分钟，使BMM凝固。随后加入250 µL预热至37 °C的MOM。
   5. 待细胞长至融合后，按步骤3.2所述进行传代，将全部细胞悬液接种至24孔板中的2个孔内。
      注意：若使用抗生素筛选，建议在初次离心感染后48小时直接在48孔板中进行筛选。若进行荧光激活细胞分选（FACS），建议按照上述方法在6孔板中进一步扩增细胞，以获得足够数量的细胞。在进行流式检测前过滤样品时，也建议采用较长的胰蛋白酶消化时间（1小时），以确保获得单细胞悬液。
2. 基于电穿孔的CRISPR-Cas9转化
   注意：关于核糖核蛋白（RNP）复合物的浓度与制备，请参阅 IDT 同源定向修复指南（第 9–11 页）²²然而，对于基因敲除实验应省略HDR Enhancer V2，因其仅推荐用于需要同源重组的基因组编辑。
   1. 制备来自类器官的单细胞悬液（步骤 3.2.7）。用 PBS 洗涤并测定细胞浓度。转移含有 10 数量级细胞的悬液⁴ 数量级（1 × 10⁴ 至 9 × 10⁴ 细胞）转移至1.5 mL离心管中。
   2. 350 × 离心 g 5分钟。弃上清，加入10 µL基因组编辑缓冲液重悬。如果 >1 × 10⁴ 细胞用于电穿孔时，需准备足量的细胞悬液以进行连续电穿孔，确保每10 µL中含有1 × 10⁴ 至 9 × 10⁴ 细胞
   3. 使用电穿孔移液系统吸取10 µL细胞悬液，确保不引入气泡。在以下条件下进行电穿孔：电压1200 V，脉冲持续时间20 ms，共4次脉冲。将细胞置于含有冷MOM的离心管中。
   4. 细胞电穿孔后，将整个悬液在350 × g条件下离心 g 5分钟。将沉淀重悬于预冷的MOM和BMM（1:4比例）中，制备足够量以供每轮电穿孔接种一个穹顶（每1个10电穿孔1个穹顶）⁴ 细胞）
   5. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂ 至少30分钟，以使BMM凝固。按照步骤3.1.2中所述，加入500 µL预热至37 °C的MOM，然后将培养板放回培养箱中。
3. 挑选单克隆细胞
   1. 为获得源自单个细胞的克隆，按上述方法传代细胞，但每孔接种50至100个细胞（4 × 10³ 至 8 × 10³ 细胞/mL，于与BMM混合前的细胞悬液中。
   2. 每3天更换一次MOM。检查类器官是否正常生长，并记录哪些类器官与其他类器官分离良好。
   3. 当类器官生长至可辨识的大小（约500 µm）时，使用光学显微镜挑选出4-5个彼此分离充分的较大类器官。
      注意：类器官应能被肉眼观察到，但建议使用细头标记笔在培养板底部类器官所在区域周围画圈标记，以方便识别。
   4. 在超净工作台中，使用20 µL移液器轻轻将枪头插入BMM，吸取单个类器官（吸取体积约为12.5 µL）。将类器官转移至含有500 µL MOM的1.5 mL收集管中。
   5. 350 × g 离心 g 5分钟。弃去上清液，加入500 µL TrypLE Express酶重悬。37 °C孵育30分钟。
   6. 用500 µL含3% FBS的DMEM（2D培养基）终止细胞解离反应，于350 × g 孵育5分钟。极其小心地吸除上清液，将沉淀重悬于12.5 µL预冷的MOM培养基中，再与37.5 µL冰冻的BMM培养基混合，将全部悬液作为单个50 µL液滴接种于24孔板中，具体操作如上所述。
   7. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中₂ 至少30分钟，以使BMM凝固。按照步骤3.1.2所示，加入500 µL预热至37 °C的MOM，然后将培养板放回培养箱中。
   8. 每3-4天更换一次培养基，当细胞形成合胞体并达到汇合时进行传代。

5. 从类器官建立二维细胞系

1. 过渡至细胞培养
   1. 从单细胞悬液开始，如同类器官传代后的情况。
   2. 操作方式与接种6孔板相同（步骤3.3），但需使用预先冷却的（4 °C 预冷24小时）基质。将类器官接种于4 °C过夜保存的6孔板中，并在将培养板移入培养箱前，在无菌操作台中静置5–10分钟。
      注意：此步骤可使细胞轻柔沉降至培养板底部，以适应二维生长条件，同时仍可利用BMM中的细胞外基质（ECM）组分。
   3. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育30分钟，随后加入2 mL 37 °C预热的MOM培养基。根据需要更换培养基。
   4. 当类器官达到汇合状态时，按步骤3.2.1–3.2.7所述进行传代。在用PBS洗涤去除残留BMM后，向孔中加入2 mL预热的二维培养基。
      注意：BMM的去除不会影响已贴壁的细胞，这些细胞现在可在适应二维条件/培养基的同时自由侵入孔的其余区域。
   5. 当保留在BMM中的细胞已形成单细胞悬液后，取一半体积的细胞进行接种，重复步骤5.1.2；将另一半原孔中的细胞也加入，以增加接种细胞数量，从而加快达到汇合状态。
   6. 24小时后更换二维培养基，以去除未贴壁的细胞。
      注意：应存在大量未贴壁细胞，因为BMM中培养的细胞不适应塑料基底，不易贴附。
   7. 重复步骤5.1.4。随后将全部细胞重悬于4 mL二维培养基中，并将2 mL接种至之前使用的各孔中。每3–4天更换一次二维培养基。
2. 二维细胞培养扩增
   1. 当细胞达到约80%汇合度时，进行首次传代。
   2. 传代时，吸除培养基，用1 mL PBS洗涤一次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶。在37 °C孵育5–10分钟。
      注意：不同细胞系的贴壁特性可能不同，因此胰酶消化时间需相应调整。在进行下一步前，应在显微镜下确认细胞是否已完全脱落。用手轻轻敲击培养板有助于细胞脱落。
   3. 待所有细胞脱落后，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM终止消化反应，并在350 × g条件下离心5分钟。
   4. 首次扩增（80–100%汇合度）时，以1:1比例重新接种。重复步骤5.1.6，并每2–3天更换一次二维培养基。
   5. 第二次扩增（80–100%汇合度）时，将所有细胞重悬于10 mL 37 °C的二维培养基中，接种至100 mm培养皿。重复步骤5.1.6，并每2–3天更换一次培养基。
      注意：该过程耗时较长，可能长达一个月。若使用携带病毒整合基因以实现蛋白过表达的细胞系，建议在整个培养过程中持续添加筛选抗生素。若标记为荧光蛋白，则应尽早进行荧光激活细胞分选（例如，在100 mm培养皿扩增结束时进行）。
3. 冷冻保存
   1. 为保存这些细胞，按步骤5.2.1–5.2.3进行传代。随后将约1 × 10⁶个细胞重悬于1 mL二维冷冻培养基中（由80%二维培养基、10% FBS和10% DMSO组成），转移至冻存管。按照步骤3.5.2进行细胞储存。

6. 验证类器官品系

1. 从类器官中分离遗传物质
   1. 从单细胞悬液开始，以两倍常规细胞密度（1 × 10⁶ 个细胞/mL）接种两个类器官结构。第3天更换类器官培养基（MOM）。
   2. 第5天，吸除培养基，用PBS洗涤一次，然后直接向类器官结构中加入350 µL首选裂解缓冲液。室温孵育5分钟，或直至基底膜基质（BMM）完全溶解后，将裂解液转移至1.5 mL离心管中。
   3. 如需长期使用，将裂解液于-80 °C保存。否则，继续使用首选提取方法或商用试剂盒进行DNA和/或RNA的提取。
2. 免疫荧光（IF）染色
   1. 为准备细胞，按步骤3.2.1–3.2.5所述进行传代。将细胞重悬于37.5 µL MOM与112.5 µL预冷BMM的混合液中（足够制备三个50 µL的类器官结构，作为生物学重复）。继续执行步骤3.2.6，并在第3天和第5天更换培养基。
   2. 第7天，吸除MOM，并用500 µL PBS洗涤细胞。通过直接向每个类器官结构中加入500 µL预热（37 °C）的含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液进行单独固定。于37 °C孵育60分钟，直至BMM完全溶解。
   3. 使用宽口P1000移液器吸头（若无，可将普通P1000吸头尖端剪去约0.5 cm），收集含4% PFA的类器官，并将液体转移至1.5 mL离心管中。
      注：使用标准移液吸头会导致类器官破裂。
   4. 静置2至3分钟，使类器官沉降至管底。吸除4% PFA溶液（保留适量液体以避免吸走类器官），加入500 µL PBS洗涤类器官。重复此步骤两次，共洗涤三次。
      注：为保持类器官形态，建议采用静置沉降而非离心。
   5. 如需长期保存（4–6周），将类器官置于4 °C的PBS中。如需继续染色，使用含1% Triton-X的PBS在室温下透化30分钟，随后用PBS洗涤一次。
   6. 使用含0.2% Triton-X、4% FBS和1%小鼠血清的PBS在室温下封闭60分钟。用PBS洗涤一次后，保留100 µL液体于管中。
   7. 配制抗体染色工作缓冲液：含0.2% Triton-X、0.4% FBS和0.1%大鼠血清的PBS。该缓冲液适用于一抗和二抗染色。
   8. 为配制一抗染色液，计算所需浓度的两倍稀释度，确保每管中可加入100 µL抗体溶液至剩余的100 µL PBS中。例如，若目标稀释度为1:1000，则应配制100 µL的1:500溶液。
   9. 于4 °C孵育过夜。随后，用500 µL PBS洗涤三次。
   10. 按照步骤6.2.8的方法配制二抗染色液，在室温下孵育1小时。
       注：从本步骤开始，务必用铝箔或避光盒覆盖操作区域，以防止荧光抗体发生光漂白。
   11. 二抗染色完成后，用500 µL PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，尽可能吸除管内液体，为封片做准备。使用20 µL移液器以避免吸走类器官。
   12. 使用宽口或剪切过的移液吸头，加入20 µL所选封片剂，并充分混匀，避免产生气泡。
   13. 将含类器官的封片液滴加至矩形盖玻片上。用镊子将圆形盖玻片覆盖于液滴上，避免产生气泡，并于室温避光条件下过夜干燥。若同一载玻片需放置多个样本，可重复此步骤。
   14. 在圆形盖玻片上方直接再加入20 µL封片剂。然后，将矩形盖玻片翻转180°，覆盖于显微镜载玻片上，形成封片"三明治"结构。于室温避光条件下干燥至少8小时。
       注：从底部至顶部，载玻片的结构应依次为：显微镜载玻片、圆形盖玻片、类器官、矩形盖玻片。此结构可提供最佳成像条件。

7. 小鼠肿瘤模型的建立

1. 准备细胞
   1. 在2D培养基中复苏一管选定的2D细胞。让细胞生长并扩增至150 mm培养皿。如果细胞带有抗生素筛选标记，在注射前需进行筛选，以确保获得纯度较高的目标细胞群体。
   2. 为进行5只小鼠的注射，将细胞扩增至两个150 mm培养皿。当培养皿中细胞融合度达到80%时，按照步骤5.2.2–5.2.3收集细胞。用1 mL Opti-MEM I低血清培养基重悬细胞，并测定细胞浓度。
      注意：每次注射含有4 × 10⁶个细胞；但建议额外准备一次注射量，以补偿注射器死体积造成的损失。因此，建议准备24 × 10⁶个细胞，而非20 × 10⁶个细胞。
   3. 将所有注射所需的细胞总体积置于一个1.5 mL离心管中。每剂注射液总体积为44 µL，由1份未添加补充物的Opti-MEM I中的细胞和1份冰冻BMM组成。例如，对于24 × 10⁶个细胞（6次注射），用132 µL Opti-MEM I和132 µL BMM重悬细胞。
   4. 充分混匀细胞，并置于冰上保存，直至开始注射。
2. 手术前准备
   1. 使用剃毛器或剃须膏对小鼠注射区域进行剃毛处理。
   2. 用冷PBS排出注射器（U-100胰岛素注射器，28 G）死体积中的气泡。
   3. 从1.5 mL离心管中取出细胞，缓慢吸取以制备五份每份40 µL的注射液，避免因针头内剪切力导致细胞裂解。制备完成后置于冰上，直至小鼠麻醉完成。
   4. 当所有注射准备工作完成后，将注射器放置于加热灯旁，使BMM升温并增加黏稠度，从而有利于注射和细胞植入。切勿将注射器直接置于加热灯下，否则BMM过度凝固将无法顺利通过注射器。通常应尽快操作，避免发生此情况。
3. 卵巢囊内注射（IBI）
   1. 使用氯胺酮（10 mg/mL）和赛拉嗪（1 mg/mL）混合溶液对C57BL/6J小鼠进行麻醉。按每10 g体重注射0.1 mL的剂量进行腹腔注射。
      注意：年轻雌性小鼠通常仅需注射0.2 mL，但年长个体可能需要更多剂量。该麻醉方案可维持20–40分钟，但不提供镇痛作用。
   2. 将小鼠放入已被加热灯预热的笼子中。
      注意：切勿将小鼠直接置于加热灯下，以免引起尾部坏死和高热，可能导致死亡。
   3. 待第一只小鼠完全麻醉后，使用70%乙醇对注射部位进行消毒。 采用无菌操作技术，在C57BL/6J小鼠腹部侧 flank 区域、大腿上方做一处<1 cm的切口。确保切口穿透表皮和皮下组织，到达卵巢囊区域。
   4. 小心地将卵巢（可通过附着的脂肪垫轻易识别）拉出。取一支已准备好的注射器，通过脂肪垫后方缓慢穿刺进入卵巢，并继续推进至输卵管囊内进行注射。
      注意：成功的注射可观察到输卵管囊因BMM注入而膨胀。混合液也可能渗漏至整个脂肪垫，此现象属正常。
   5. 小心地将卵巢复位至卵巢囊内，使用无编织缝线缝合肌肉层，随后使用外科缝钉闭合皮肤切口。
   6. 在小鼠苏醒前，皮下注射200 μL无菌生理盐水和0.1 mg/kg的丁丙诺啡作为镇痛剂，同时帮助小鼠术后保持良好水合状态。
   7. 将小鼠放回笼中，使用加热灯维持体温，直至其恢复半清醒状态（>15分钟）。此外，再次皮下注射200 μL无菌生理盐水和0.1 mg/kg丁丙诺啡作为镇痛处理。

结果

生成和验证高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的工作流程示意图见图1。该过程始于从雌性C57BL/6J野生型小鼠中提取输卵管组织（图2A）。建议起始时取用较大块的组织，以确保充分采集。使用解剖显微镜可精确分离远端输卵管，同时去除周围组织（如脂肪和卵巢）。如图2B所示，卵巢最初被脂肪覆盖，但在清创后，其黄色外观和椭圆形状变得更加清晰。随后小心地解开并修剪输卵管，以分离远端部分，并为后续消化做准备（图2B）。

从小鼠输卵管上皮组织（FTE）制备得到单细胞悬液后，应立即将其接种于BMM培养基中，以促进类器官的形成。我们建议将来自同一只小鼠的两条输卵管中提取的细胞接种至同一个类器官凝胶滴中，以最大化获得的克隆数量。根据操作者的熟练程度，可获得从数个到数百个不等的类器官。细胞收获量过低可能导致培养启动失败，其原因可能包括组织解离速度、修剪精度、剪切程度以及消化...

讨论

尽管肿瘤学研究取得了显著进展，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）仍然是最侵袭性的妇科恶性肿瘤，也是所有卵巢癌中致死率最高的类型^23,24随着妇科肿瘤学研究的发展，其所使用的模型也应不断进步。事实上，许多历史上沿用的卵巢癌模型细胞系已被发现存在多种缺陷，不适合用于该疾病的研究，原因包括基因组相关性不足、细胞来源差异，以及在模拟疾病特征方面的局限性 体内 条件²在这方面，类器官能更准确地模拟组织发育过程 体外 系统以及细胞-基质相互作用，已显示出优于传统的二维细胞培养技术^14,15,25. 通过扩展该系统，使用同源小鼠细胞系可将此类模型重新引入具有完整免疫系统的小鼠体内，从而实现衔接 体外 和 体内 本方案重点在于建立野生型...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA	Corning	25053CI
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12-634-028
老龄C57BL/6J（雌性）	The Jackson Laboratory	000664
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	QIAGEN	80204	用于DNA/RNA提取
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3	Integrated DNA Technologies	10008100
抗Ki67抗体	Abcam	ab15580
AutoClip系统	Fine Science Tools	12020-00	用于IBI术后伤口闭合
B-27补充剂（50倍浓度），无血清	Gibco	17-504-001
盐酸杀稻瘟菌素（10 mg/mL）50 mg	InvivoGen	ant-bl-05
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A9647
Buffer RLT Plus	QIAGEN	1053393	用于DNA/RNA提取前裂解细胞
细胞回收溶液	Corning	354253
胶原酶/透明质酸酶	STEMCELL Technologies	07912
CoraLite 594-鬼笔环肽（红色）	Proteintech	PF00003
盖玻片 15CIR-1	Fisherbrand	12-545-83
盖玻片 24 mm ´ 40 mm-1	Fisherbrand	12-544-12
CTS（细胞治疗系统）N-2补充剂	Gibco	A1370701
DAPI	Roche	10236276001
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）	Sigma Aldrich	D5025
Difco脱脂奶粉	Becton Dickinson	232100
Dispase	STEMCELL Technologies	07913
含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM	Corning	10013CV
重组DNase I，无RNase	Roche	04716728001
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537
Dumont #5 - 陶瓷涂层镊子	Fine Science Tools	11252-50	用于输卵管解剖
胎牛血清	Corning	35-010-CV	在56 °C下热灭活60分钟
精细剪刀 - ToughCut	Fine Science Tools	14058-09	用于输卵管采集和IBI切口
遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL）	Gibco	10131027
GlutaMAX补充剂（100倍浓度）	Gibco	35-050-061
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Cyanine3	Invitrogen	A10520
Graefe镊子	Fine Science Tools	11053-10	用于组织操作
HEPES缓冲液	Corning	25060CI
人R-Spondin 1重组蛋白	PeproTech	120-38
胰岛素注射器，U-100 0.5 mL 0.36 mm（28 G）x 12.7 mm（1/2"）	BD	BD329461
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS -G）（100倍浓度）	Gibco	41-400-045
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓度）	Gibco	25-030-081
Matrigel GFR基底膜基质	Corning	356231	BMM
小鼠EGF重组蛋白	PeproTech	315-09
小鼠FGF-basic重组蛋白	PeproTech	450-33
小鼠Noggin重组蛋白	PeproTech	250-38
小鼠Wnt-3a重组蛋白	PeproTech	315-20
N2补充剂	Gibco	17502048
N-乙酰半胱氨酸酰胺	Sigma Aldrich	A0737
Neon NxT电穿孔系统	Invitrogen	NEON1S	用于CRISPR-Cas9电穿孔
Neon NxT电穿孔系统10-μL试剂盒（含单通道电转管）	Invitrogen	N1025	电穿孔耗材，包括基因组编辑缓冲液
烟酰胺	Sigma Aldrich	N3376
正常小鼠血清	Invitrogen	10410
正常大鼠血清	STEMCELL Technologies	13551
Opti-MEM I减血清培养基	Gibco	31985070
PAX8多克隆抗体	Proteintech	10336-1-AP
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15-140-122
嘌呤霉素	Sigma Aldrich	P8833
Selectfrost 25 mm ´ 75 mm ´ 1.0 mm	Fisherbrand	12-550-003
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151
TrypLE Express酶（1倍浓度），无酚红	Gibco	12-604-013
Vannas弹簧剪刀 - 4 mm切割刃	Fine Science Tools	15019-10	用于输卵管解剖
Y27632	STEMCELL Technologies	72304	Rho激酶（ROCK）抑制剂