该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立,到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的遗传特征,再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内 肿瘤的形成
方法文章
该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立,到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的遗传特征,再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内 肿瘤的形成
在真实环境中有效模拟疾病对于增进我们对多种病理机制的理解至关重要。在这方面,类器官相较于传统的二维模型能够提供更为逼真的环境 体外同样,同源小鼠模型还允许研究人员研究更完整的肿瘤-宿主相互作用,例如与免疫系统之间的相互作用, 体内在此,我们提供了一项完整的实验方案,用于从小鼠体内分离输卵管上皮细胞——高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的起源细胞,并将其建立为原代类器官培养物,以及其后续的 体外 培养与维持。随后,我们描述如何利用遗传工程技术,例如慢病毒或逆转录病毒介导的基因过表达,以及CRISPR-Cas9基因敲除,对这些细胞系进行修饰,将其转化为癌前类肿瘤体。我们还报道了如何利用它们进行 体外 验证,通过提取遗传物质和免疫荧光染色进行。最后,我们说明如何将这些肿瘤类器官有效注射至高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的原位——卵巢囊,以启动肿瘤形成。
高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)仍是一种认知不足且致死率极高的疾病。长期以来,缺乏能够真实反映HGSOC生物学特性及治疗反应的体外(in vitro)和体内(in vivo)模型,严重阻碍了该领域的进展。例如,多项(甚至可能是大多数)研究使用的细胞系并不具备HGSOC的关键基因组/遗传特征,导致其研究结果的相关性受到质疑1,2,3,4。以常用的ID8同源小鼠模型为例,该模型来源于卵巢表面上皮(OSE),且Trp53为野生型5。相比之下,大多数甚至全部HGSOC起源于输卵管上皮(FTE)6,且HGSOC几乎普遍存在TP53突变或失活7。研究人员随后尝试通过在该模型中引入Trp53突变加以修正5,但由于Trp53突变是HGSOC发病过程中的早期事件,这一改造可能在该细胞系的转化过程中介入过晚,因此很可能无法真实模拟HGSOC的正常发生发展过程。
在过去十年中,研究人员尝试通过构建更接近真实的高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)模型来改善这一状况。例如,通过基因工程小鼠模型(GEMMs),在缪勒管谱系细胞中引入相关突变,通常借助 Cre 重组酶系统来调控发病过程,从而在 in vivo8,9,10 条件下更好地模拟疾病。然而,这些模型通常构建复杂,且可能存在 Cre 泄漏、Cre 效应或"旁效应"11,12,13 等其他问题。在此背景下,同源性类器官模型似乎为希望在 in vitro 和 in vivo 条件下更准确模拟该疾病的科研人员提供了一种稳健的折中方案14,15,16,17,18,19。事实上,目前大多数可用且被广泛使用的 HGSOC 模型均为二维模型,但它们无法充分模拟细胞外基质(ECM)的复杂性,而 ECM 是影响细胞生物学行为的关键因素。类器官是由干细胞来源的自组织三维组织,能够在培养皿中重现器官早期的结构与功能复杂性20。其构建通常通过将具有多能性的单个细胞悬浮于基底膜基质(BMM)(如 Matrigel21)中实现。In vitro 条件下,这些模型相较于二维模型能更准确地再现 in vivo 环境。同时,由于其同源性特征,这些模型可被移植至具有完整免疫系统的小鼠体内,从而更真实地重建疾病的发生与发展过程14,15。这一优势明显优于患者来源的异种移植模型(PDX),后者虽然具有最接近真实的肿瘤遗传背景,但必须移植到免疫缺陷小鼠模型中才能实现移植。
在本实验方案中,我们描述了如何建立同基因型高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)类器官模型。该流程包括从小鼠输卵管上皮(FTE)组织中分离并建立原始野生型类器官培养体系,通过基因工程手段构建具有疾病相关基因型的类器官,最终将其移植回卵巢囊腔以生成完全发育的肿瘤。我们还补充了几项常用实验的附加方案,例如免疫荧光(IF)染色 体外 类器官及细胞系的二维转化,用于大规模细胞生产,例如用于注射。本方案面向希望构建具有可控遗传背景的HGSOC同基因型类器官模型的研究人员,旨在更真实地研究HGSOC生物学特性 体外 肿瘤微环境中的条件及其相互作用 体内.
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所有动物组织采集和操作均在纽约州纽约市亚历山大生命科学中心和纽约大学朗格尼医学中心珀尔马特癌症中心的机构动物护理与使用委员会(IACUC)批准下,遵循伦理规范进行。
1. 材料准备
2. 小鼠输卵管上皮细胞的分离
3. 小鼠输卵管上皮类器官的维持
4. 对小鼠FTE来源类器官进行遗传修饰以建立新型细胞系
5. 从类器官建立二维细胞系
6. 验证类器官品系
7. 小鼠肿瘤模型的建立
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生成和验证高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的工作流程示意图见图1。该过程始于从雌性C57BL/6J野生型小鼠中提取输卵管组织(图2A)。建议起始时取用较大块的组织,以确保充分采集。使用解剖显微镜可精确分离远端输卵管,同时去除周围组织(如脂肪和卵巢)。如图2B所示,卵巢最初被脂肪覆盖,但在清创后,其黄色外观和椭圆形状变得更加清晰。随后小心地解开并修剪输卵管,以分离远端部分,并为后续消化做准备(图2B)。
从小鼠输卵管上皮组织(FTE)制备得到单细胞悬液后,应立即将其接种于BMM培养基中,以促进类器官的形成。我们建议将来自同一只小鼠的两条输卵管中提取的细胞接种至同一个类器官凝胶滴中,以最大化获得的克隆数量。根据操作者的熟练程度,可获得从数个到数百个不等的类器官。细胞收获量过低可能导致培养启动失败,其原因可能包括组织解离速度、修剪精度、剪切程度以及消化...
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尽管肿瘤学研究取得了显著进展,高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)仍然是最侵袭性的妇科恶性肿瘤,也是所有卵巢癌中致死率最高的类型23,24随着妇科肿瘤学研究的发展,其所使用的模型也应不断进步。事实上,许多历史上沿用的卵巢癌模型细胞系已被发现存在多种缺陷,不适合用于该疾病的研究,原因包括基因组相关性不足、细胞来源差异,以及在模拟疾病特征方面的局限性 体内 条件2在这方面,类器官能更准确地模拟组织发育过程 体外 系统以及细胞-基质相互作用,已显示出优于传统的二维细胞培养技术14,15,25. 通过扩展该系统,使用同源小鼠细胞系可将此类模型重新引入具有完整免疫系统的小鼠体内,从而实现衔接 体外 和 体内 本方案重点在于建立野生型...
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作者声明无利益冲突。
本研究由美国国立卫生研究院资助,资助编号为 R01(CA257507)。图示示意图使用 BioRender 软件绘制。我们感谢 Benjamin Neel 博士在本项目全过程中的支持,感谢 Shuang Zhang 博士开发了原始实验方案,以及 Kiyomi Araki 博士在方案优化过程中提供的帮助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTA | Corning | 25053CI | |
| A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12-634-028 | |
| 老龄C57BL/6J(雌性) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| AllPrep DNA/RNA Mini Kit | QIAGEN | 80204 | 用于DNA/RNA提取 |
| Alt-R S.p. Cas9-GFP V3 | Integrated DNA Technologies | 10008100 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| AutoClip系统 | Fine Science Tools | 12020-00 | 用于IBI术后伤口闭合 |
| B-27补充剂(50倍浓度),无血清 | Gibco | 17-504-001 | |
| 盐酸杀稻瘟菌素(10 mg/mL)50 mg | InvivoGen | ant-bl-05 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A9647 | |
| Buffer RLT Plus | QIAGEN | 1053393 | 用于DNA/RNA提取前裂解细胞 |
| 细胞回收溶液 | Corning | 354253 | |
| 胶原酶/透明质酸酶 | STEMCELL Technologies | 07912 | |
| CoraLite 594-鬼笔环肽(红色) | Proteintech | PF00003 | |
| 盖玻片 15CIR-1 | Fisherbrand | 12-545-83 | |
| 盖玻片 24 mm ´ 40 mm-1 | Fisherbrand | 12-544-12 | |
| CTS(细胞治疗系统)N-2补充剂 | Gibco | A1370701 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| 来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I(DNAse I) | Sigma Aldrich | D5025 | |
| Difco脱脂奶粉 | Becton Dickinson | 232100 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 07913 | |
| 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM | Corning | 10013CV | |
| 重组DNase I,无RNase | Roche | 04716728001 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Dumont #5 - 陶瓷涂层镊子 | Fine Science Tools | 11252-50 | 用于输卵管解剖 |
| 胎牛血清 | Corning | 35-010-CV | 在56 °C下热灭活60分钟 |
| 精细剪刀 - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | 用于输卵管采集和IBI切口 |
| 遗传霉素选择性抗生素(G418硫酸盐)(50 mg/mL) | Gibco | 10131027 | |
| GlutaMAX补充剂(100倍浓度) | Gibco | 35-050-061 | |
| 山羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附二抗,Cyanine3 | Invitrogen | A10520 | |
| Graefe镊子 | Fine Science Tools | 11053-10 | 用于组织操作 |
| HEPES缓冲液 | Corning | 25060CI | |
| 人R-Spondin 1重组蛋白 | PeproTech | 120-38 | |
| 胰岛素注射器,U-100 0.5 mL 0.36 mm(28 G)x 12.7 mm(1/2") | BD | BD329461 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS -G)(100倍浓度) | Gibco | 41-400-045 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM(100倍浓度) | Gibco | 25-030-081 | |
| Matrigel GFR基底膜基质 | Corning | 356231 | BMM |
| 小鼠EGF重组蛋白 | PeproTech | 315-09 | |
| 小鼠FGF-basic重组蛋白 | PeproTech | 450-33 | |
| 小鼠Noggin重组蛋白 | PeproTech | 250-38 | |
| 小鼠Wnt-3a重组蛋白 | PeproTech | 315-20 | |
| N2补充剂 | Gibco | 17502048 | |
| N-乙酰半胱氨酸酰胺 | Sigma Aldrich | A0737 | |
| Neon NxT电穿孔系统 | Invitrogen | NEON1S | 用于CRISPR-Cas9电穿孔 |
| Neon NxT电穿孔系统10-μL试剂盒(含单通道电转管) | Invitrogen | N1025 | 电穿孔耗材,包括基因组编辑缓冲液 |
| 烟酰胺 | Sigma Aldrich | N3376 | |
| 正常小鼠血清 | Invitrogen | 10410 | |
| 正常大鼠血清 | STEMCELL Technologies | 13551 | |
| Opti-MEM I减血清培养基 | Gibco | 31985070 | |
| PAX8多克隆抗体 | Proteintech | 10336-1-AP | |
| 青霉素-链霉素(10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma Aldrich | P8833 | |
| Selectfrost 25 mm ´ 75 mm ´ 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151 | |
| TrypLE Express酶(1倍浓度),无酚红 | Gibco | 12-604-013 | |
| Vannas弹簧剪刀 - 4 mm切割刃 | Fine Science Tools | 15019-10 | 用于输卵管解剖 |
| Y27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | Rho激酶(ROCK)抑制剂 |
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