方法文章

由小鼠输卵管上皮细胞建立类器官系用于高级别浆液性卵巢癌建模

DOI：

10.3791/68753

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2025年8月6日

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1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

本文内容

摘要

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该方案详细描述了高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）小鼠模型的建立方法 体外 和 体内从小鼠输卵管类器官的建立，到通过基因改造模拟人类高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的遗传特征，再到将其移植至同系小鼠卵巢囊腔中 体内 肿瘤的形成

摘要

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在真实环境中有效模拟疾病对于增进我们对多种病理机制的理解至关重要。在这方面，类器官相较于传统的二维模型能够提供更为逼真的环境 体外同样，同源小鼠模型还允许研究人员研究更完整的肿瘤-宿主相互作用，例如与免疫系统之间的相互作用， 体内在此，我们提供了一项完整的实验方案，用于从小鼠体内分离输卵管上皮细胞——高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的起源细胞，并将其建立为原代类器官培养物，以及其后续的 体外 培养与维持。随后，我们描述如何利用遗传工程技术，例如慢病毒或逆转录病毒介导的基因过表达，以及CRISPR-Cas9基因敲除，对这些细胞系进行修饰，将其转化为癌前类肿瘤体。我们还报道了如何利用它们进行 体外 验证，通过提取遗传物质和免疫荧光染色进行。最后，我们说明如何将这些肿瘤类器官有效注射至高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的原位——卵巢囊，以启动肿瘤形成。

引言

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高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）仍是一种认知不足且致死率极高的疾病。长期以来，缺乏能够真实反映HGSOC生物学特性及治疗反应的体外（in vitro）和体内（in vivo）模型，严重阻碍了该领域的进展。例如，多项（甚至可能是大多数）研究使用的细胞系并不具备HGSOC的关键基因组/遗传特征，导致其研究结果的相关性受到质疑1,2,3,4。以常用的ID8同源小鼠模型为例，该模型来源于卵巢表面上皮（OSE），且Trp53为野生型5。相比之下，大多数甚至全部HGSOC起源于输卵管上皮（FTE）6，且HGSOC几乎普遍存在TP53突变或失活7。研究人员随后尝试通过在该模型中引入Trp53突变加以修正5，但由于Trp53突变是HGSOC发病过程中的早期事件，这一改造可能在该细胞系的转化过程中介入过晚，因此很可能无法真实模拟HGSOC的正常发生发展过程。

在过....

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方案

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所有动物组织采集和操作均在纽约州纽约市亚历山大生命科学中心和纽约大学朗格尼医学中心珀尔马特癌症中心的机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准下，遵循伦理规范进行。

1. 材料准备

  1. 小鼠类器官培养基（MOM）的配制
    1. 通过混合表1中的成分来制备基础培养基。
      注意：培养基在4 °C下可稳定保存长达一个月。
  2. 二维培养基（2D 培养基）的配制
    1. 在含丙酮酸钠和高糖的DMEM培养基中加入重组小鼠表皮生长因子（EGF，终浓度50 ng/mL）、胰岛素-转铁蛋白-硒（终浓度分别为胰岛素10 mg/L、转铁蛋白5.5 mg/L、硒6.7 µg/L）、3%热灭活胎牛血清（FBS）以及青霉素-链霉素（终浓度100 U/mL）。
  3. 消化液的配制
    1. 将胶原酶/透明质酸酶（终浓度3000 U/mL胶原酶，1000 U/mL透明质酸酶）与含丙酮酸钠和高糖的DMEM培养基按1:10比例混合。将混合液以每管1 mL分装至1.5 mL微量离心管中。分装后于-20 °C保存，并在冰上解冻使用。
    2. 将DNA酶I（10,000 U/mL）和分散酶（Dispase，5 U/mL）分别分装成单次使用量。
    3. 待一份胶....

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结果

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生成和验证高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）的工作流程示意图见图1。该过程始于从雌性C57BL/6J野生型小鼠中提取输卵管组织（图2A）。建议起始时取用较大块的组织，以确保充分采集。使用解剖显微镜可精确分离远端输卵管，同时去除周围组织（如脂肪和卵巢）。如图2B所示，卵巢最初被脂肪覆盖，但在清创后，其黄色外观和椭圆形状变得更加清晰。随后小心地解开并修剪输卵管，以分离远端部分，并为后续消化做准备（图2B）。

从小鼠输卵管上皮组织（FTE）制备得到单细胞悬液后，应立即将其接种于BMM培养基中，以促进类器官的形成。我们建议将来自同一只小鼠的两条输卵管中提取的细胞接种至同一个类器官凝胶滴中，以最大化获得的克隆数量。根据操作者的熟练程度，可获得从数个到数百个不等的类器官。细胞收获量过低可能导致培养启动失败，其原因可能包括组织解离速度、修剪精度、剪切程度以及消化.......

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讨论

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尽管肿瘤学研究取得了显著进展，高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）仍然是最侵袭性的妇科恶性肿瘤，也是所有卵巢癌中致死率最高的类型23,24随着妇科肿瘤学研究的发展，其所使用的模型也应不断进步。事实上，许多历史上沿用的卵巢癌模型细胞系已被发现存在多种缺陷，不适合用于该疾病的研究，原因包括基因组相关性不足、细胞来源差异，以及在模拟疾病特征方面的局限性 体内 条件2在这方面，类器官能更准确地模拟组织发育过程 体外 系统以及细胞-基质相互作用，已显示出优于传统的二维细胞培养技术14,15,25. 通过扩展该系统，使用同源小鼠细胞系可将此类模型重新引入具有完整免疫系统的小鼠体内，从而实现衔接 体外 和 体内 本方案重点在于建立野生型.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 R01(CA257507)。图示示意图使用 BioRender 软件绘制。我们感谢 Benjamin Neel 博士在本项目全过程中的支持，感谢 Shuang Zhang 博士开发了原始实验方案，以及 Kiyomi Araki 博士在方案优化过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不含钙、镁和碳酸氢钠的HBSS中的0.25%胰蛋白酶和0.1% EDTACorning25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
Advanced DMEM/F12Gibco12-634-028
老龄C57BL/6J（雌性）The Jackson Laboratory000664
AllPrep DNA/RNA Mini KitQIAGEN80204用于DNA/RNA提取
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Integrated DNA Technologies10008100
抗Ki67抗体Abcamab15580
AutoClip系统Fine Science Tools12020-00用于IBI术后伤口闭合
B-27补充剂（50倍浓度），无血清Gibco17-504-001
盐酸杀稻瘟菌素（10 mg/mL）50 mgInvivoGenant-bl-05
牛血清白蛋白Sigma AldrichA9647
Buffer RLT PlusQIAGEN1053393用于DNA/RNA提取前裂解细胞
细胞回收溶液Corning354253
胶原酶/透明质酸酶STEMCELL Technologies07912
CoraLite 594-鬼笔环肽（红色）ProteintechPF00003
盖玻片 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
盖玻片 24 mm ´ 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
CTS（细胞治疗系统）N-2补充剂GibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）Sigma AldrichD5025
Difco脱脂奶粉Becton Dickinson232100
DispaseSTEMCELL Technologies07913
含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEMCorning10013CV
重组DNase I，无RNaseRoche04716728001
杜氏磷酸盐缓冲液Sigma AldrichD8537
Dumont #5 - 陶瓷涂层镊子Fine Science Tools11252-50用于输卵管解剖
胎牛血清Corning35-010-CV在56 °C下热灭活60分钟
精细剪刀 - ToughCutFine Science Tools14058-09用于输卵管采集和IBI切口
遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL）Gibco10131027
GlutaMAX补充剂（100倍浓度）Gibco35-050-061
山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Cyanine3InvitrogenA10520
Graefe镊子Fine Science Tools11053-10用于组织操作
HEPES缓冲液Corning25060CI
人R-Spondin 1重组蛋白PeproTech120-38
胰岛素注射器，U-100 0.5 mL 0.36 mm（28 G）x 12.7 mm（1/2"）BDBD329461
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS -G）（100倍浓度）Gibco41-400-045
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓度）Gibco25-030-081
Matrigel GFR基底膜基质Corning356231BMM
小鼠EGF重组蛋白PeproTech315-09
小鼠FGF-basic重组蛋白PeproTech450-33
小鼠Noggin重组蛋白PeproTech250-38
小鼠Wnt-3a重组蛋白PeproTech315-20
N2补充剂Gibco17502048
N-乙酰半胱氨酸酰胺Sigma AldrichA0737
Neon NxT电穿孔系统InvitrogenNEON1S用于CRISPR-Cas9电穿孔
Neon NxT电穿孔系统10-μL试剂盒（含单通道电转管）InvitrogenN1025电穿孔耗材，包括基因组编辑缓冲液
烟酰胺Sigma AldrichN3376
正常小鼠血清Invitrogen10410
正常大鼠血清STEMCELL Technologies13551
Opti-MEM I减血清培养基Gibco31985070
PAX8多克隆抗体Proteintech10336-1-AP
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Gibco15-140-122
嘌呤霉素Sigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm ´ 75 mm ´ 1.0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Fisher BioreagentsBP151
TrypLE Express酶（1倍浓度），无酚红Gibco12-604-013
Vannas弹簧剪刀 - 4 mm切割刃Fine Science Tools15019-10用于输卵管解剖
Y27632STEMCELL Technologies72304Rho激酶（ROCK）抑制剂 

参考文献

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  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N.

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重印与许可

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标签

CRISPR Cas9

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