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用于斑马鱼成像与心脏发育研究的定制3D打印模具

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DOI：

10.3791/68768

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2025年8月15日

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1Department of Biology, University of Mississippi

本文内容

摘要

本文介绍一种利用低成本的立体光刻3D打印机制造模具的方法，以促进斑马鱼胚胎成像研究中可重复的样品固定。通过该方法，我们已制备出用于斑马鱼胚胎心脏形态发生成像的模具。

摘要

胚胎固定是研究人员在进行成像实验时常遇到的技术难题之一。为了确保在整个成像过程中显微镜物镜能够稳定地观察到目标组织，胚胎必须以可重复的方式进行定向固定。为解决这一问题，研究人员可将胚胎包埋于黏性介质中，或制作专用的培养皿和模具，以在成像期间维持胚胎的特定朝向。本文介绍一种利用低成本的立体光刻（SLA）3D打印机制造可重复使用模具的方法，该模具可用于制备琼脂糖微孔，以便在成像过程中固定胚胎。这些琼脂糖微孔为多个胚胎的准确定向提供了可靠手段。本方法包含一个设计框架，可根据不同组织、生物种类及成像需求进行灵活定制。我们已应用该方法成功制备了适用于正置和倒置显微镜下斑马鱼心脏发育成像的模具。通过使用普遍可得的材料和设备，该方法使研究人员能够便捷地制作符合其特定固定需求的模具。

引言

在完整动物体内观察细胞动态对于理解先天性疾病病理以及发育和稳态的基本过程至关重要。这种观察涵盖多个空间尺度的成像，以识别整个生物体以及组织、细胞和亚细胞水平上的生理动态。用于观察细胞动态的成像方法包括对固定样本进行免疫荧光研究，以及对活体样本进行延时成像。这些成像方法要求将完整的样本以特定方向固定，以便显微镜物镜能够访问感兴趣的区域。

斑马鱼胚胎因其光学透明性、遗传可操作性、体外受精以及脊椎动物来源，是成像研究的理想模式生物。然而，以稳定且可重复的方式将斑马鱼胚胎以特定方向固定始终是一项持续存在的挑战。在观察斑马鱼胚胎心脏发育时，固定尤为困难，因为心脏形态发生过程发生在不同的平面上1。

为解决胚胎成像过程中固定所面临的挑战，已发展出多种方法。其中一种最简单的方法是将斑马鱼胚胎置于两张盖玻片之间，并在盖玻片之间加入胶带层，以防止压碎胚胎。该方法适用于倒置和正置显微镜的成像2。斑马鱼胚胎也可被固定在高黏性介质或凝胶中，例如甲基纤维素或0.1–0.8%的低熔点琼脂糖，以维持胚胎在特定方向上的姿态2,3,4。这些低通量方法适用于许多成像项目；然而，保持胚胎完整性并可重复地获得特定取向仍存在困难。为提高成像通量并简化固定操作，可在成像培养皿中使用凝固的琼脂糖制备具有规则间距的孔穴结构5,6,7,8。为了便于制作此类琼脂糖孔穴，已有研究设计出塑料模具9,10,11。尽管这些模具可用于沿标准背腹侧轴方向进行成像10,12，但它们通常针对特定成像需求设计，例如用于96孔板13或用于检测首次心跳14。在某些特殊情况下，已开发出完整的成像培养皿5,15,16。例如，一种由PDMS制成的微流控腔室（名为ZEBRA）可同时实现胚胎成像和化学物质暴露处理17。这些模具通常由硅胶或亚克力材料加工而成10,18,19。然而，随着相对廉价的三维（3D）打印机的出现，定制化模具的制作得以普及，从而可便捷地用于生成琼脂糖成像孔穴。

3D打印，也称为增材制造或分层制造，是指通过逐层添加并融合材料，从数字设计模型制造三维物体的过程20,21立体光刻（SLA）利用紫外光（UV）逐层固化光敏液态树脂22SLA 打印机成本效益高、速度快、精度高，且可与多种树脂配合使用，包括可提供光滑表面的树脂16该过程始于计算机辅助设计（CAD）软件，在其中可设计物体的数字模型。 从头合成 或基于已有设计进行修改。随后，数字模型被虚拟地切割为可打印的层状结构。利用这些数字层，3D打印机逐层构建目标物体。本文介绍了一种利用低成本商用SLA 3D打印机定制设计和制作成像模具的方法与框架。此外，我们还利用该框架制备了适用于倒置或直立显微镜下观察斑马鱼心脏发育不同阶段的模具，并开发了用于沿斑马鱼胚胎侧向、背向或腹向轴进行成像的模具。

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方案

本文所述的实验方案、实验操作及研究结果均依照动物福利法规和指南进行，并经密西西比大学机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 #24-008）。

为了创建不同形状的琼脂糖小室，以便对胚胎进行成像时进行定向，我们设计了一种利用基座连接柱状凸起的结构（图1A）。这些柱状凸起的形状（见图1A中紫色箭头所指的凸起）可根据不同发育阶段的胚胎进行定制，并可针对特定组织进行优化。下文将描述如何定制这些凸起，以及如何利用该系统制备琼脂糖小室的实验方案。

1. 制作定制设计的成像模具

  1. 绘制标本或胚胎在理想方向上的初步示意图。需考虑期望的胚胎朝向，以及所用显微镜配备的是直立物镜还是倒置物镜。同时需考虑培养皿的尺寸、待固定的胚胎数量及其之间的间距。
  2. 使用显微镜结合FIJI等软件工具测量胚胎的尺寸（如长度、宽度和高度）23使用这些尺寸来确保胚胎能够放入由插销形成的孔中。
  3. 确定一个与胚胎几何形状相对应的形态。结合步骤1.2中的测量数据，使用计算机辅助设计（CAD）软件创建一个与样品形状和大小相近的插销结构。
    注意：该形状可通过组合和重叠不同预设形状，在基础的CAD软件程序中创建，或直接设计该形状 从头合成 使用先进的CAD软件程序。此外，还可以修改我们预先设计的销钉之一（参见补充文件1）。如对柱销进行锥形处理，即 图1A，可帮助调整胚胎方向，以确保目标组织最接近物镜。
  4. 将 peg 设计与基座设计结合：
    1. 在 CAD 软件程序中，将一个自定义设计的销钉添加到预设基座之一上（补充文件 1）。然后，使用高级CAD程序中的工具，将 peg 复制并在基座上均匀排列，以实现高通量成像。仔细检查，确保所有 peg 距离基座的高度一致。
  5. 准备3D打印设计：
    1. 将定制模具设计或预设模具之一（补充文件 2) 导入切片软件，该软件将设计转换为3D打印机的指令。
    2. 在切片软件中，务必旋转设计，使其方向正确 确保关键部件（如销钉）远离打印机平台。对于使用熔融沉积成型（FDM）打印机打印的盖玻片支架，应将打印件水平放置。
      注意：旋转设计可防止翘曲，当精细部件靠近打印平台放置时，可能发生翘曲。
    3. 在切片软件中添加支撑结构，以确保模具的精细部分在打印过程中不会断裂。使用软件中的中等自动支撑放置功能，并结合手动调整，可确保支撑分布均匀且无较大间隙。采用100%的填充策略以制作实心模具。
    4. 通过使用包含所有模具的单个STL文件，或在切片软件中将多个单独的STL文件进行排布，可同时打印多个部件。
  6. 打印
    注意：由于SLA打印机具有可行性高、精度高以及可生成光滑表面的优点，因此是我们制作成像模具的首选3D打印机类型。而盖玻片支架则使用FDM打印机制造，因为FDM打印机打印出的成品比SLA打印机更轻且刚性更强。
    1. 从以下打印设置开始，并据此进行优化：0.05 mm 层高；5 层底部层数；2.5 s 曝光时间；35 s 底部曝光时间；5 mm 底部抬升高度和抬升距离；60 mm/min 底部抬升速度；80 提升速度：210 毫米/分钟；回缩速度：210 毫米/分钟。
      注意：打印设置可能需要用户根据树脂类型、室温及打印机型号进行优化。
  7. 打印完成后，将模具置于水中清洗，去除支撑结构，然后将模具放入组织培养罩内并用紫外光照射，以确保树脂完全固化。
    注意：彻底清洗和固化模具对于防止树脂剥落以及防止模具变形至关重要。
    操作未固化的树脂和清洗模具时应佩戴手套和实验服，因为未固化的树脂可能引起皮肤刺激。光固化（SLA）打印机使用紫外光固化树脂，紫外光可能对眼睛和皮肤造成伤害。确保打印舱已牢固封闭，并避免直视紫外光源。

2. 使用3D打印模具制备琼脂糖小孔的步骤

  1. 制备琼脂糖小孔
    1. 通过将2% (g/mL) 琼脂糖溶解于E3培养基（1.578 mM NaCl，0.169 mM KCl，0.249 mM CaCl2*2H2O，0.161 mM MgSO4*7H2O）中来制备琼脂糖小孔。将模具置于盖玻片底部培养皿的中央，箭头朝下指向小孔（见图2A，B）。沿成像模具周长的一半加入750 µL 2%熔融琼脂糖/E3（见图2C）。
      注意：熔融琼脂糖应无明显黏性，但温度需足够低以避免移液时产生气泡。我们使用底部为30 mm盖玻片的60 mm培养皿；对于适用于直立显微镜的模具，可使用标准60 mm培养皿。筛选模具的使用采用略有不同的方案（见下文）。
    2. 沿成像模具周长的另一半再加入750 µL 2%熔融琼脂糖/E3（见图2D）。
    3. 等待5–7分钟，使琼脂糖凝固，观察其从透明液体转变为不透明蓝色凝胶的过程（见图2E）。
    4. 在已凝固的中央琼脂糖周围边缘添加一层薄薄的熔融琼脂糖。
      注意：尽管此步骤并非严格必需，但它有助于将凝固的琼脂糖固定在培养皿上，防止因培养基作用导致其脱落。
    5. 将外圈（补充图S1B）套在琼脂糖模具组件上，箭头指向琼脂糖（见图2F）。
    6. 在轻轻按住外圈的同时，小心地垂直向上提起内模，使其与琼脂糖分离（见图2G）。
      注意：为避免破坏或损伤琼脂糖小孔，在按压外圈时不要用力过猛，向上提拉内模时不得扭转或偏移。
    7. 移除外圈，露出盖玻片底部培养皿中的琼脂糖小孔（图2H）。
    8. 在显微镜下检查琼脂糖小孔，确认其尺寸正确且制作良好。
      注意：在倒置显微镜上进行成像时，通常需要将小孔底部的一层薄琼脂糖揭去，可用镊子完成此操作。
  2. 使用筛选模具的改进方案
    1. 将熔融的2%琼脂糖/E3倒入培养皿中，直至约半满。
    2. 手持模具，使插脚朝上，将熔融的2%琼脂糖/E3移液至插脚上，直至完全覆盖（约3 mL）。
      注意：为避免引入气泡，移液器吸取熔融琼脂糖后仅释放其中的90%。
    3. 通过倾斜操作，先将一端、再将整个带插脚的模具（插脚朝下）放入盛有熔融琼脂糖的培养皿中（补充图S2）。
    4. 让琼脂糖静置5–7分钟使其凝固。
    5. 小心握住手柄，先撬起一端，再撬起另一端，从而将模具完整取出。

3. 使用或不使用低熔点琼脂糖在琼脂糖孔中固定胚胎

  1. 在固定胚胎前，先在含有 200 μg/mL 三卡因（tricaine）的溶液中去除卵膜并进行麻醉。
    注意：若需停止心脏跳动，需使用约 400 μg/mL 的三卡因溶液。
    1. 不使用低熔点琼脂糖时：在成像培养皿中加入含三卡因（200 μg/mL）的 1× E3 培养基，将已去卵膜并麻醉的胚胎放入培养皿中，用镊子将胚胎放置并调整方向至琼脂糖孔中，然后进行成像（见图 2I、J）。
      注意：由于镊子容易损伤胚胎，可改用胚胎拨针（embryo poker），即在毛细管或移液头中插入直径为 0.41 mm 的钓鱼线，并用瞬间胶固定24。
    2. 使用低熔点琼脂糖：
      注意：尽管模具可用于将胚胎置于特定方向，但使用低熔点琼脂糖固定胚胎可确保在成像过程中或在将已固定的胚胎培养皿转移至显微镜时胚胎不会发生漂移。以下步骤源自我们先前的方案6。
      1. 通过将 0.1–0.8% 的低熔点琼脂糖溶解于 5 mL E3 培养基中，并在水浴中加热至 65–70 °C 制备低熔点琼脂糖溶液。间歇性颠倒试管，直至琼脂糖完全溶解。将低熔点琼脂糖溶液分装至微量离心管中，并置于设定为 42 °C 的加热金属块上。让溶液在 42 °C 下平衡至少 1 小时。
        注意：通常建议使用新鲜配制的低熔点琼脂糖溶液。
      2. 使用宽口玻璃巴斯德移液管，将单个胚胎转移至含有低熔点琼脂糖溶液的离心管中。为避免向低熔点琼脂糖溶液中加入过多液体，仅转移胚胎及其周围少量液体。立即将处于低熔点琼脂糖中的胚胎转移至其中一个琼脂糖孔中。将低熔点琼脂糖溶液放回加热金属块上以备重复使用。
      3. 使用镊子或胚胎拨针（见步骤 3.1.1），将胚胎在孔中调整至适合成像的位置。
      4. 对其他孔重复步骤 3.1.2.2–3.1.2.3。若先前的孔开始变干，可用 p200 移液器在孔上添加少量 E3 培养基（约 50–100 μL）。
  2. 当所有孔中的胚胎均已固定且低熔点琼脂糖完全凝固后，使用移液器缓慢 向成像培养皿中加入三卡因/E3 溶液。
  3. 成像完成后，使用镊子小心地从孔中取出胚胎，并继续培养以确认成像过程未引起发育异常。
    注意：琼脂糖孔可从成像培养皿中移除，培养皿经冲洗后可重复使用。使用市售玻璃清洁剂清洗，再用 ddH2O 多次冲洗，有助于去除盖玻片上的盐沉积。尽管我们未观察到玻璃清洁剂残留导致的毒性，但研究人员应在自身实验室条件下验证该结果。

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结果

上述方案用于设计斑马鱼心脏发育不同阶段的成像模具，包括心脏融合、心管形成、心脏弯曲及心室形成等阶段。由于心脏发育并不沿胚胎主要解剖轴进行，因此针对不同发育阶段定制了不同形状的固定柱，以实现胚胎的准确定位。例如，在受精后48小时（hpf），斑马鱼心脏位于胚胎前部，相对于球形卵黄的位置需要倾斜的胚胎朝向，这一取向通过在模具V2中设计具有锥形边缘的固定柱得以实现。图1A，B）。利用模具V2制备用于倒置共聚焦显微镜成像的琼脂糖凝胶孔，我们采用了 Tg(myl7:egfp) 转基因25 比较野生型胚胎与严重突变型胚胎的心脏形态 pdgfrask16/sk16 突变胚胎26 在48 hpf时显示心脏分裂（cardia bifida）图1C，D）。为了利用直立式体视显微镜观察心脏发育早期事件（如心脏融合和管腔形成）...

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讨论

在本实验方案中，我们介绍了一种设计3D打印模具的方法，该模具可制备琼脂糖小孔，从而有助于胚胎或组织在成像研究中的固定。这些模具可用于直立式或倒置式显微镜成像，利用这些定制模具制备的琼脂糖小孔可广泛应用于多种成像实验，包括对固定胚胎的免疫荧光研究以及对活体胚胎的延时成像。

该方法使用一种包含两个部件的模具：一个内部带有固定柱的柱塞形基底模具和一个外部环形模具。我们已在这些模具中整合了若干关键设计特征。其中最重要的特征是位于内模底部的固定柱。这些固定柱的形状可进行定制，以形成不同形状的琼脂糖孔，从而帮助胚胎以可重复的方式定向，便于成像。其他设计特征包括在琼脂糖孔一端压印模具名称，形成不对称结构，使每个孔均可被唯一识别。在内模底部周围增加了凹槽，以促进熔融琼脂糖在固定柱周围的填充。熔融琼脂糖应无黏性且透明，但需冷却至足以用移液器操作而不产生气泡的温度。此外，虽然将固定柱完全接触盖玻片的设计有利于倒置显微镜观察（因其可使胚胎尽可能贴近盖玻片），但该设计对正置显微镜并无帮助。因此，针对正置显微镜，我们设计了一种在底边带有凸缘的独立内模，可防止固定柱完全沉到底部（示例见

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Bloomekatz实验室的成员，特别是Sasmitha Singh和Allison Holmes，以及GlyCORE影像中心（由P20GM130460资助）、密西西比大学IDEA实验室、Yiwei Han博士及其研究团队，以及密西西比大学糖科学与发育生物学研究领域的各位同仁。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R15HD108782、P20GM130460）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SLA 3D 打印机ElegooMARS 2 PRO
琼脂糖 Apex Bioresearch; Genesee Scientific 20-102QD可使用其他品牌替代
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ 计算机辅助设计（CAD）软件——更高级
Axio-Zoom 直立式显微镜ZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/切片软件
盖玻片底培养皿（60 mm 培养皿，底部孔径 30 mm）CellvisD60-30-1.5N
F59 肌球蛋白重链（所有快速亚型）DHSBF591:50 稀释
FDM 耗材丝BambuPLA 耗材丝
FDM 打印机BambuBambu X1 Carbon FDM0.4 mm 挤出喷嘴
镊子Fisher16-100-121其他品牌也可能适用
山羊抗小鼠 Alexa 488ThermoFisher#A281751:300 稀释
ImarisAndor10.2软件
倒置共聚焦显微镜LeicaLeica SP8 X
低熔点琼脂糖Gold Biotechnology目录号：A-204-25其他品牌也可能适用
移液器泵Bel-ArtF37898
SLA 打印机用树脂ElegooElegoo P05BB028可水洗光敏聚合物树脂 V2.0
蓖麻凝集素（RCA-120）Vector labs#RLK-2200（凝集素试剂盒）1:300 稀释
TinkerCADAutodesk Inc. https://www.tinkercad.com/计算机辅助设计（CAD）软件——基础版
三卡因 S Western Chemical, Inc. ANADA #200-226
麦胚凝集素（WGA）Vector labs#RLK-2200（凝集素试剂盒）1:300 稀释
宽口玻璃巴斯德移液管 Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT

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