本文介绍一种利用低成本的立体光刻3D打印机制造模具的方法，以促进斑马鱼胚胎成像研究中可重复的样品固定。通过该方法，我们已制备出用于斑马鱼胚胎心脏形态发生成像的模具。
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本文内容
摘要
摘要
胚胎固定是研究人员在进行成像实验时常遇到的技术难题之一。为了确保在整个成像过程中显微镜物镜能够稳定地观察到目标组织，胚胎必须以可重复的方式进行定向固定。为解决这一问题，研究人员可将胚胎包埋于黏性介质中，或制作专用的培养皿和模具，以在成像期间维持胚胎的特定朝向。本文介绍一种利用低成本的立体光刻（SLA）3D打印机制造可重复使用模具的方法，该模具可用于制备琼脂糖微孔，以便在成像过程中固定胚胎。这些琼脂糖微孔为多个胚胎的准确定向提供了可靠手段。本方法包含一个设计框架，可根据不同组织、生物种类及成像需求进行灵活定制。我们已应用该方法成功制备了适用于正置和倒置显微镜下斑马鱼心脏发育成像的模具。通过使用普遍可得的材料和设备，该方法使研究人员能够便捷地制作符合其特定固定需求的模具。
引言
在完整动物体内观察细胞动态对于理解先天性疾病病理以及发育和稳态的基本过程至关重要。这种观察涵盖多个空间尺度的成像，以识别整个生物体以及组织、细胞和亚细胞水平上的生理动态。用于观察细胞动态的成像方法包括对固定样本进行免疫荧光研究，以及对活体样本进行延时成像。这些成像方法要求将完整的样本以特定方向固定，以便显微镜物镜能够访问感兴趣的区域。
斑马鱼胚胎因其光学透明性、遗传可操作性、体外受精以及脊椎动物来源，是成像研究的理想模式生物。然而，以稳定且可重复的方式将斑马鱼胚胎以特定方向固定始终是一项持续存在的挑战。在观察斑马鱼胚胎心脏发育时，固定尤为困难，因为心脏形态发生过程发生在不同的平面上1。
为解决胚胎成像过程中固定所面临的挑战，已发展出多种方法。其中一种最简单的方法是将斑马鱼胚胎置于两张盖玻片之间，并在盖玻片之间加入胶带层，以防止压碎胚胎。该方法适用于倒置和正置显微镜的成像2。斑马鱼胚胎也可被固定在高黏性介质或凝胶中，例如甲基纤维素或0.1–0.8%的低熔点琼脂糖，以维持胚胎在特定方向上的姿态2,3,4。这些低通量方法适用于许多成像项目；然而，保....
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方案
本文所述的实验方案、实验操作及研究结果均依照动物福利法规和指南进行，并经密西西比大学机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 #24-008）。
为了创建不同形状的琼脂糖小室，以便对胚胎进行成像时进行定向，我们设计了一种利用基座连接柱状凸起的结构（图1A）。这些柱状凸起的形状（见图1A中紫色箭头所指的凸起）可根据不同发育阶段的胚胎进行定制，并可针对特定组织进行优化。下文将描述如何定制这些凸起，以及如何利用该系统制备琼脂糖小室的实验方案。
1. 制作定制设计的成像模具
- 绘制标本或胚胎在理想方向上的初步示意图。需考虑期望的胚胎朝向，以及所用显微镜配备的是直立物镜还是倒置物镜。同时需考虑培养皿的尺寸、待固定的胚胎数量及其之间的间距。
- 使用显微镜结合FIJI等软件工具测量胚胎的尺寸（如长度、宽度和高度）23使用这些尺寸来确保胚胎能够放入由插销形成的孔中。
- 确定一个与胚胎几何形状相对应的形态。结合步骤1.2中的测量数据，使用计算机辅助设计（CAD）软件创建一个与样品形状和大小相近的插销结构。
注意：该形状可通过组合和重叠不同预设形状，在基础的CAD软件程序中....
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结果
上述方案用于设计斑马鱼心脏发育不同阶段的成像模具，包括心脏融合、心管形成、心脏弯曲及心室形成等阶段。由于心脏发育并不沿胚胎主要解剖轴进行，因此针对不同发育阶段定制了不同形状的固定柱，以实现胚胎的准确定位。例如，在受精后48小时（hpf），斑马鱼心脏位于胚胎前部，相对于球形卵黄的位置需要倾斜的胚胎朝向，这一取向通过在模具V2中设计具有锥形边缘的固定柱得以实现。图1A，B）。利用模具V2制备用于倒置共聚焦显微镜成像的琼脂糖凝胶孔，我们采用了 Tg(myl7:egfp) 转基因25 比较野生型胚胎与严重突变型胚胎的心脏形态 pdgfrask16/sk16 突变胚胎26 在48 hpf时显示心脏分裂（cardia bifida）图1C，D）。为了利用直立式体视显微镜观察心脏发育早期事件（如心脏融合和管腔形成）.......
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讨论
在本实验方案中，我们介绍了一种设计3D打印模具的方法，该模具可制备琼脂糖小孔，从而有助于胚胎或组织在成像研究中的固定。这些模具可用于直立式或倒置式显微镜成像，利用这些定制模具制备的琼脂糖小孔可广泛应用于多种成像实验，包括对固定胚胎的免疫荧光研究以及对活体胚胎的延时成像。
该方法使用一种包含两个部件的模具：一个内部带有固定柱的柱塞形基底模具和一个外部环形模具。我们已在这些模具中整合了若干关键设计特征。其中最重要的特征是位于内模底部的固定柱。这些固定柱的形状可进行定制，以形成不同形状的琼脂糖孔，从而帮助胚胎以可重复的方式定向，便于成像。其他设计特征包括在琼脂糖孔一端压印模具名称，形成不对称结构，使每个孔均可被唯一识别。在内模底部周围增加了凹槽，以促进熔融琼脂糖在固定柱周围的填充。熔融琼脂糖应无黏性且透明，但需冷却至足以用移液器操作而不产生气泡的温度。此外，虽然将固定柱完全接触盖玻片的设计有利于倒置显微镜观察（因其可使胚胎尽可能贴近盖玻片），但该设计对正置显微镜并无帮助。因此，针对正置显微镜，我们设计了一种在底边带有凸缘的独立内模，可防止固定柱完全沉到底部（示例见
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Bloomekatz实验室的成员，特别是Sasmitha Singh和Allison Holmes，以及GlyCORE影像中心（由P20GM130460资助）、密西西比大学IDEA实验室、Yiwei Han博士及其研究团队，以及密西西比大学糖科学与发育生物学研究领域的各位同仁。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R15HD108782、P20GM130460）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SLA 3D 打印机 | Elegoo | MARS 2 PRO | |
| 琼脂糖 | Apex Bioresearch; Genesee Scientific | 20-102QD | 可使用其他品牌替代 |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk Inc. | https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ | 计算机辅助设计（CAD）软件——更高级 |
| Axio-Zoom 直立式显微镜 | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Chitubox | CBD-Tech | https://www.chitubox.com/ | 切片软件 |
| 盖玻片底培养皿（60 mm 培养皿，底部孔径 30 mm） | Cellvis | D60-30-1.5N | |
| F59 肌球蛋白重链（所有快速亚型） | DHSB | F59 | 1:50 稀释 |
| FDM 耗材丝 | Bambu | PLA 耗材丝 | |
| FDM 打印机 | Bambu | Bambu X1 Carbon FDM | 0.4 mm 挤出喷嘴 |
| 镊子 | Fisher | 16-100-121 | 其他品牌也可能适用 |
| 山羊抗小鼠 Alexa 488 | ThermoFisher | #A28175 | 1:300 稀释 |
| Imaris | Andor | 10.2 | 软件 |
| 倒置共聚焦显微镜 | Leica | Leica SP8 X | |
| 低熔点琼脂糖 | Gold Biotechnology | 目录号：A-204-25 | 其他品牌也可能适用 |
| 移液器泵 | Bel-Art | F37898 | |
| SLA 打印机用树脂 | Elegoo | Elegoo P05BB028 | 可水洗光敏聚合物树脂 V2.0 |
| 蓖麻凝集素（RCA-120） | Vector labs | #RLK-2200（凝集素试剂盒） | 1:300 稀释 |
| TinkerCAD | Autodesk Inc. | https://www.tinkercad.com/ | 计算机辅助设计（CAD）软件——基础版 |
| 三卡因 S | Western Chemical, Inc. | ANADA #200-226 | |
| 麦胚凝集素（WGA） | Vector labs | #RLK-2200（凝集素试剂盒） | 1:300 稀释 |
| 宽口玻璃巴斯德移液管 | Duran Wheaton Kimble (DWK) | 63A53WT |
参考文献
- Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish b....
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