本文介绍了一种在进行分子或组织病理学分析切片前，通过向血管腔内灌注组织稳定凝胶以保存人类动脉结构的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
阻力血管包括小动脉和微动脉，在调节血压和组织灌注中发挥关键作用。这些血管的功能障碍可导致多种心血管疾病，如高血压、动脉粥样硬化和心力衰竭，以及神经血管疾病。对人类阻力血管的研究对于理解心血管疾病的机制和开发靶向治疗策略至关重要。本研究提出了一种创新的方法，通过将组织稳定凝胶灌注到血管腔内，以制备分离的人类阻力血管，从而保留其天然结构和细胞完整性。人类大网膜组织取自接受腹部手术的患者，通过精细的显微解剖分离出小阻力血管（直径为100-300 µm）。随后将血管套管化，在培养肌图仪腔室中加压，并用10%中性缓冲福尔马林固定。将组织稳定凝胶灌注入套管血管的腔内，使其凝固以保存三维结构。通过组织学、免疫组织化学和基因表达分析评估血管的保存情况。组织学切片显示血管结构完整性和天然架构保存良好，内皮层和平滑肌层清晰可辨。免疫组织化学染色显示CD31和α-平滑肌肌动蛋白等标志物的明确定位。In situ 杂交揭示了特定的基因表达模式，为分子机制提供了深入见解。这种腔内凝胶灌注的先进方法具有显著优势，能够在健康和疾病状态下实现对血管结构、重塑过程及细胞间相互作用的高级成像和全面分析。该方法有望改善血管疾病的临床诊断和治疗策略，从而为推动血管生物学研究提供有价值的工具。
引言
阻力血管调节血流和血压，在高血压、糖尿病和动脉粥样硬化等疾病状态下会发生显著改变1,2,3,4,5。研究人体阻力血管对于理解心血管疾病的病理机制并开发靶向治疗策略至关重要6,7,8,9,10。传统的血管研究方法常导致组织产生人工假象，并丧失三维结构的完整性10,11,12,13,14,15。为克服....
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方案
在进行以下实验之前，须确保使用人体组织及以下操作步骤已获得机构审查委员会（IRB）的批准。在美国国立卫生研究院（NIH）临床中心接受临床指征腹部手术的患者中收集大网膜组织，已获得NIH机构审查委员会的批准（NCT01915225）。所有参与者均签署了书面知情同意书。
1. 材料与仪器
- 有关本实验方案所需的所有试剂和材料信息，请参见材料表。如需更多详细信息，可根据需要查阅相应供应商提供的说明书和网站。
2. 人网膜组织的采集
- 从外科团队收集人网膜组织。
- 立即将组织放入预冷的标本容器中，容器内含冰冷的克雷布斯-亨塞尔特（Krebs Henseleit, KH）缓冲液（成分：118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、10 mM HEPES、2.0 mM CaCl2 和 11.1 mM 葡萄糖），并置于冰上。
- 确保组织完全浸没在缓冲液中，然后牢固盖紧容器盖子。
- 在组织采集后30分钟内，将密闭容器置于冰上运送至实验室，以....
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结果
人网膜组织取自接受临床指征腹部手术的患者。在解剖显微镜下，仔细地从周围脂肪和结缔组织中分离出小阻力动脉（直径为100-300 µm）（图1A-C）。分离后的动脉被清理干净，成功地套管并固定在培养肌动图装置的玻璃套管上以进行加压（图1D-F）。当加压至60-80 mmHg时，动脉保持其生理尺寸和张力，表明套管成功。在恒定压力60-80 mmHg下，使用10%中性缓冲福尔马林固定动脉，可保持动脉壁和细胞成分的结构完整性。动脉保留了天然的组织结构，内皮层和平滑肌层清晰可辨。活力检测实验显示，当暴露于60 mM KCl时，动脉发生收缩，洗脱后管径恢复至基线水平（图2A-C）。收缩程度达到或超过50%的动脉被视为具有活性。通过连接注射器的细玻璃移液器，将组织稳定凝胶无气.......
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讨论
医学成像、外科技术及研究方法的进步加深了我们对三维血管结构的理解，彻底改变了诊断、手术规划和科研工作17,18,19,20。尽管取得了这些进展，由于人体阻力动脉结构精细且复杂，其离体后三维结构的保存仍具挑战性，这给血管的分离与成像带来困难，限制了对其解剖和生理特征的全面研究。为解决这一问题，我们开发了一种先进的管腔内凝胶灌注方法，可有效保持离体人体阻力动脉的天然结构和细胞完整性。
该技术可保持天然动脉的生理尺寸和结构特性，良好地保存了内皮层和平滑肌层的清晰结构以及血管壁的三维组织架构，便于进行详细的组织病理学检查和高级成像分析。利用该方法对组织切片进行成像，显示出保存完好的细胞及细胞外成分，能够清晰呈现不同类型细胞之间的空间关系。免疫组织化学染色揭示了特定蛋白质的明确定位和表达模式，为细胞组成及其相互作用提供了重要信息。此外，保.......
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披露
NIAID GenAI 被用于生成稿件的初步提纲和初稿，最终内容由人类作者全面撰写、审阅和编辑，以确保准确性和连贯性。
致谢
本研究由美国国家过敏与传染病研究所内部研究部门资助，项目编号AI001150，授予HCA。我们感谢前实验室成员Steven Brooks博士，以及当前疟疾功能基因组学部门的实验室成员Mohamed Ibrahim、Mary Jackson和Jian Wu，他们在实验过程中协助拍摄了图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% 聚焦酸性酒精 | StatLab | SL89-1 | |
| 10% NBS | Leica Biosystems | 3800598 | |
| 4K 显微镜 HDMI 相机 | Hitech Instruments, Inc. | HT-XP4K8MA | |
| 抗体稀释液-减少背景 | Dako | S3022 | |
| 全自动组织处理仪 | Leica Biosystems | HistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005 | |
| Bond 脱蜡液 | Leica Biosystems | AR9222 | |
| Bond 抗原修复液 1 | Leica Biosystems | AR9961 | |
| Bond 抗原修复液 2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
| Bond 聚合物增强检测系统 | Leica Biosystems | DS9800 | |
| Bond 聚合物红染检测系统 | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Bond 洗涤液 (10x) | Leica Biosystems | AR9590 | |
| 套管包（玻璃），80–100 μm | DMT | 产品编号：300407 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| 解剖皿，大号（派热克斯玻璃），93 mm | Living Systems Instrumentation | SKU: DD-90 | |
| 解剖皿，小号 | Living Systems Instrumentation | SKU: DD-50 | |
| 解剖显微镜 | Hitech Instruments, Inc. | ZEISS SteREO Discovery.V8 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 货号：11295-10 | |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 货号：11252-00 | |
| EcoMount | BioCare Medical | EM897L | |
| 伊红 | IHC World | IW-3100B | |
| 苏木精 | BioCare Medical | Cathe-MM | |
| 成像相机 | Olyumpus | DP28 | |
| 成像显微镜 | Olyumpus | BX51 | |
| Krebs Henseleit 缓冲液（含 2 mM 氯化钙） | Boston BioProducts, Inc. | SKU: C-10625N-200mL | |
| Krebs-Henseleit 缓冲液（无钙） | Boston BioProducts, Inc. | SKU: C-9906W-200mL | |
| 封片介质 | ThermoFisher Scientific | 4111 | |
| 肌动描记室及装置 | DMT | 202/204CM | |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Thermofisher Scientific | 10010023 | |
| PPIB | ACDBio | 313908 | |
| RNAscope 2.5 LS 试剂盒-红色 | ACDBio | 322150 | |
| 染色机 | Leica | Leica Bond RX 自动化系统 | |
| 不锈钢解剖针 | Living Systems Instrumentation | SKU: PIN-0.1MM | PIN-0.2MM | PIN-#3 | PIN-VP-1 | |
| Surgipath Paraplast 包埋剂 | Leica Biosystems | 39601006 | |
| 组织保护胶 | StatLab | TissueGuard/SKU: TG12 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 2 mm 刃口 | Fine Science Tools | 货号：15000-03 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 mm 刃口 | Fine Science Tools | 货号：15000-08 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口 | Fine Science Tools | 货号：15000-00 | |
| α-SMA | Abcam | ab5694 |
参考文献
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: Roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38 (3 Pt 2), 581-587 (2001).
- Mulvany, M. J. Small artery remodelling in hypertension. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 11....
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重印与许可
