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方法文章

体外管腔内凝胶灌注：一种用于人阻力动脉显微分析的先进技术方法

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DOI：

10.3791/68773

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2025年8月19日

 ,  ,  ,  , 
1Physiology Unit, Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, 2Surgical Oncology Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Infectious Disease Pathogenesis Section, National Institute of Allergy and Infectious Diseases

本文内容

摘要

本文介绍了一种在进行分子或组织病理学分析切片前，通过向血管腔内灌注组织稳定凝胶以保存人类动脉结构的实验方案。

摘要

阻力血管包括小动脉和微动脉，在调节血压和组织灌注中发挥关键作用。这些血管的功能障碍可导致多种心血管疾病，如高血压、动脉粥样硬化和心力衰竭，以及神经血管疾病。对人类阻力血管的研究对于理解心血管疾病的机制和开发靶向治疗策略至关重要。本研究提出了一种创新的方法，通过将组织稳定凝胶灌注到血管腔内，以制备分离的人类阻力血管，从而保留其天然结构和细胞完整性。人类大网膜组织取自接受腹部手术的患者，通过精细的显微解剖分离出小阻力血管（直径为100-300 µm）。随后将血管套管化，在培养肌图仪腔室中加压，并用10%中性缓冲福尔马林固定。将组织稳定凝胶灌注入套管血管的腔内，使其凝固以保存三维结构。通过组织学、免疫组织化学和基因表达分析评估血管的保存情况。组织学切片显示血管结构完整性和天然架构保存良好，内皮层和平滑肌层清晰可辨。免疫组织化学染色显示CD31和α-平滑肌肌动蛋白等标志物的明确定位。In situ 杂交揭示了特定的基因表达模式，为分子机制提供了深入见解。这种腔内凝胶灌注的先进方法具有显著优势，能够在健康和疾病状态下实现对血管结构、重塑过程及细胞间相互作用的高级成像和全面分析。该方法有望改善血管疾病的临床诊断和治疗策略，从而为推动血管生物学研究提供有价值的工具。

引言

阻力血管调节血流和血压，在高血压、糖尿病和动脉粥样硬化等疾病状态下会发生显著改变1,2,3,4,5。研究人体阻力血管对于理解心血管疾病的病理机制并开发靶向治疗策略至关重要6,7,8,9,10。传统的血管研究方法常导致组织产生人工假象，并丧失三维结构的完整性10,11,12,13,14,15。为克服这些局限性，本文介绍一种创新的人体阻力血管离体制备方法，即向血管腔内灌注凝胶，从而维持其接近ex vivo和/或in vivo状态下的原有结构。

这种管腔内凝胶灌注技术可维持动脉的天然结构，从而更准确地反映其生理状态。通过稳定血管结构，该方法有助于详细观察动脉重塑、细胞结构、微结构域、异型细胞连接以及不同细胞层间的基因/蛋白表达。该技术在研究健康与疾病状态下细胞类型特异性组分方面具有显著优势。

该技术已在我们最近的研究中成功应用16，证明其在保持人类阻力动脉结构和分子完整性方面具有显著效果，有助于实现高级成像和全面分析。此项应用的成功促使我们记录下这一详细实验方案，供他人使用。

在本方法学论文中，我们描述了分离人阻力动脉并将其灌注生物相容性组织稳定凝胶（Tissue Guard Gel）的实验方案。本文详细阐述了该实验方法，并展示了其在评估动脉结构以及研究不同细胞层中基因和蛋白质表达模式中的应用。通过提供一种全面且可重复的人阻力动脉制备技术，我们旨在推动心血管生物学研究，提高实验结果的可重复性，并为心血管疾病的新型诊断与治疗策略提供支持。

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方案

在进行以下实验之前，须确保使用人体组织及以下操作步骤已获得机构审查委员会（IRB）的批准。在美国国立卫生研究院（NIH）临床中心接受临床指征腹部手术的患者中收集大网膜组织，已获得NIH机构审查委员会的批准（NCT01915225）。所有参与者均签署了书面知情同意书。

1. 材料与仪器

  1. 有关本实验方案所需的所有试剂和材料信息，请参见材料表。如需更多详细信息，可根据需要查阅相应供应商提供的说明书和网站。

2. 人网膜组织的采集

  1. 从外科团队收集人网膜组织。
  2. 立即将组织放入预冷的标本容器中，容器内含冰冷的克雷布斯-亨塞尔特（Krebs Henseleit, KH）缓冲液（成分：118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、10 mM HEPES、2.0 mM CaCl2 和 11.1 mM 葡萄糖），并置于冰上。
  3. 确保组织完全浸没在缓冲液中，然后牢固盖紧容器盖子。
  4. 在组织采集后30分钟内，将密闭容器置于冰上运送至实验室，以保证组织活性。
    注意：配制缓冲液时，务必使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4。

3. 人类小阻力动脉的显微解剖

  1. 到达实验室后，用冷的KH缓冲液冲洗大网膜组织，以去除多余的血液。
  2. 在冰上的培养皿中，用冷缓冲液选择组织中血管较丰富的区域进行解剖。
  3. 在解剖显微镜下，根据位置和分支模式识别出小阻力动脉（直径为100-300 µm）。
  4. 小心地将已识别的动脉从周围的脂肪和结缔组织中分离出来。使用精细镊子和显微剪刀剪除并移除周围组织，注意不要损伤动脉。
  5. 在整个解剖过程中，将分离出的动脉保持在冷缓冲液中，以维持其活性并防止任何酶解降解。
    注意：解剖前确保解剖区域清洁。确认显微镜物镜刻度和/或相机软件已正确校准，以便在不同放大倍数下准确测量血管直径。通常，静脉清晰可见，动脉位于静脉旁边或周围。动脉管壁比静脉厚。当从周围组织中分离后，动脉能保持完整血管管状结构；而静脉管壁较薄，因管腔内含有血液常显得更亮，且一旦从组织中分离出来更易破损。

4. 培养肌图仪腔室的制备

  1. 准备一个带有两根玻璃套管的血管肌动描记室，用于离体动脉的套管插管和加压。
  2. 准备一个5 mL注射器，连接干净的毛细管，并用新鲜的KH缓冲液充满。将毛细管连接到套管的一端，并用KH缓冲液充满，确保无气泡残留。
  3. 用冷缓冲液填充腔室，并将其置于冰上以维持低温。
    注意：可使用一种自制的小型培养皿，内含两根套管，设计用于模拟肌动描记室。

5. 动脉插管与加压

  1. 使用精细镊子或内径大于动脉的转移移液管，小心地将解剖好的动脉转移至肌动图仪腔室中。
  2. 用尼龙缝合线（11/0 缝线，7 股）预先打好四个活结，并在插管前将其中两个套在每根套管上。
  3. 用精细镊子将动脉近端滑套至玻璃套管上，完成近端插管，并用两根尼龙缝合线固定。
  4. 使用注射器中的KH缓冲液轻轻冲洗已插管的动脉，以清除残留血液。
  5. 以类似方式对动脉远端进行插管并固定。
  6. 将腔室放置于连接压力和温度控制器的肌动图仪装置上。
  7. 将温度设定为 37 °C。
  8. 将初始管腔内压力设为 10 mmHg。
  9. 每 10 分钟以 10 mmHg 的增幅逐步升高管腔内压力，直至达到 60 mmHg。通过连接至培养肌动图系统的压力调节器，确保压力始终保持稳定。
  10. 根据需要使用微调定位器纵向拉直加压后的动脉，使其长度接近生理状态水平。
  11. 在计算机显示器上运行 MyoVIEW 或其他适用软件，利用数字卡尺实时监测动脉的内径和外径。
  12. 让动脉平衡 45 分钟，以达到稳定的直径，确保其维持正常的生理尺寸和张力。
  13. 使用血管收缩剂（如 60 mM KCl 或去氧肾上腺素）或血管舒张剂（如乙酰胆碱）检测动脉活性，并记录动脉直径的变化。
    注意：使用注射器时施加过大的压力可能损伤动脉，因此冲洗时务必小心。应使用最少的缓冲液并轻柔操作。或者，可在对动脉加压的同时利用灌注缓冲液冲洗出动脉内的血液。动脉加压可升至 80 mmHg，平衡时间最长可达 1 小时。

6. 动脉固定

  1. 平衡后，使用10%中性缓冲福尔马林对血管腔内和腔外进行过夜固定。保持60 mmHg的恒定压力，以确保固定过程维持血管壁和细胞成分的结构完整性。
  2. 固定后，用PBS对血管腔内和腔外进行冲洗，以去除血管及腔室中残留的固定剂。
    注意：根据研究目的和分析的兴趣区域，可在存在药理学试剂（如血管扩张剂或血管收缩剂）的情况下对安装的血管进行固定。在此阶段，血管可在4 °C的PBS中保存最多48小时。也可使用4%多聚甲醛固定血管。

7. 组织稳定凝胶的制备

  1. 使用前将组织稳定凝胶置于60 ± 5 °C加热，使其在管中完全液化。
  2. 将管置于室温（RT）下3–5分钟，使液态凝胶降温，随后将其置于40 °C加热块上保温10–15分钟，以维持凝胶的液态状态。
  3. 使用连接10–15英寸长毛细管的3 mL无菌注射器吸取液态凝胶，并立即进行以下灌注步骤。
    注意：凝胶可通过不同方法液化，务必遵循制造商的说明。

8. 管腔内凝胶灌注与包埋

  1. 将固定好的动脉连同灌注管一起置于含有 PBS 的腔室中，并维持在 37 °C。
  2. 将充满液体凝胶的毛细管远端连接至近端灌注管。
  3. 为避免灌注凝胶时气泡进入管腔，可将动脉近端从第一个灌注管上取下，以排出任何存在的气泡，并使凝胶充满灌注管。
  4. 将动脉重新套回灌注管上，轻柔地将凝胶注入动脉管腔，直至凝胶从远端灌注管流出。
  5. 立即用等体积的液体凝胶替换腔室中的 PBS，使凝胶液面升至腔室顶部。
  6. 断开温控装置，使装有动脉的腔室在室温下静置约 10 分钟，让凝胶在管腔内部及腔室外周完全固化。此步骤可确保动脉被凝胶完全包埋，从而保持其三维结构。
  7. 使用精细镊子松开尼龙缝线，轻柔地将灌注管从腔室中取出。
  8. 将包含动脉的整块固化凝胶从腔室转移至盛有 70% 乙醇的容器中。乙醇作为保存液，用于在进一步处理前维持样本完整性。
    注意：使用三通阀可在灌注凝胶前更方便地排除气泡。可通过使用洁净的移液器吸头轻轻触碰腔室中的凝胶来确认其是否已固化。

9. 组织病理学

  1. 在凝胶中横向切断动脉，并将这些样本放入组织处理机中，按照制造商的说明进行处理。
  2. 随后包埋组织以制备石蜡块。确保样本以"端面朝下"的方式包埋，使横切面朝下置于包埋块中。
  3. 使用切片机切割5 µm厚的轴向切片。将切下的切片转移至粘附载玻片上。
  4. 在60 °C下烘烤切片1小时，然后用二甲苯脱蜡，再通过梯度酒精洗涤进行再水化。
  5. 使用苏木精和伊红（HE）对切片进行染色，用于常规组织病理学检查，并在1%酸性酒精中分化。使用合适的显微镜在光学显微镜下观察切片，并使用兼容的相机采集图像。

10. 免疫组织化学

  1. 根据制造商的说明书，使用配备聚合物增强检测系统的自动化仪器进行染色。
  2. 将组织切片置于72 °C的脱蜡液中脱蜡30秒，随后用梯度酒精和洗涤液进行水化处理。
  3. 在表位修复液1中加热切片至100 °C，持续20分钟，进行热诱导表位修复；然后加入过氧化物酶阻断剂孵育5分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
  4. 用背景减少型抗体稀释液将一抗（如抗-CD31或抗-平滑肌肌动蛋白抗体）稀释至适当浓度后加入切片；随后加入辣根过氧化物酶聚合物孵育8分钟，再用显色剂溶液显色10分钟。最后用苏木精复染切片5分钟。

11. RNAScope 显色法 原位 杂交

  1. 根据制造商的说明书，使用自动化系统和合适的试剂盒以及聚合物精制红检测试剂盒进行染色。
  2. 将切片在 60 °C 下烘烤 30 分钟，然后在加热至 72 °C 的脱蜡溶液中脱蜡 30 秒。
  3. 用无水乙醇和洗涤液洗涤组织以完成再水化。
  4. 将切片在 95 °C 下用表位修复液 2 处理 15 分钟，并在 40 °C 下用酶溶液孵育 15 分钟。
  5. 使用针对目标基因的适当 RNAScope 探针对样本进行杂交。
  6. 使用中等表达的看家基因探针（例如，肽基脯氨酰异构酶 B）以确认 RNA 含量充足且完整性良好。

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结果

人网膜组织取自接受临床指征腹部手术的患者。在解剖显微镜下，仔细地从周围脂肪和结缔组织中分离出小阻力动脉（直径为100-300 µm）（图1A-C）。分离后的动脉被清理干净，成功地套管并固定在培养肌动图装置的玻璃套管上以进行加压（图1D-F）。当加压至60-80 mmHg时，动脉保持其生理尺寸和张力，表明套管成功。在恒定压力60-80 mmHg下，使用10%中性缓冲福尔马林固定动脉，可保持动脉壁和细胞成分的结构完整性。动脉保留了天然的组织结构，内皮层和平滑肌层清晰可辨。活力检测实验显示，当暴露于60 mM KCl时，动脉发生收缩，洗脱后管径恢复至基线水平（图2A-C）。收缩程度达到或超过50%的动脉被视为具有活性。通过连接注射器的细玻璃移液器，将组织稳定凝胶无气...

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讨论

医学成像、外科技术及研究方法的进步加深了我们对三维血管结构的理解，彻底改变了诊断、手术规划和科研工作17,18,19,20。尽管取得了这些进展，由于人体阻力动脉结构精细且复杂，其离体后三维结构的保存仍具挑战性，这给血管的分离与成像带来困难，限制了对其解剖和生理特征的全面研究。为解决这一问题，我们开发了一种先进的管腔内凝胶灌注方法，可有效保持离体人体阻力动脉的天然结构和细胞完整性。

该技术可保持天然动脉的生理尺寸和结构特性，良好地保存了内皮层和平滑肌层的清晰结构以及血管壁的三维组织架构，便于进行详细的组织病理学检查和高级成像分析。利用该方法对组织切片进行成像，显示出保存完好的细胞及细胞外成分，能够清晰呈现不同类型细胞之间的空间关系。免疫组织化学染色揭示了特定蛋白质的明确定位和表达模式，为细胞组成及其相互作用提供了重要信息。此外，保...

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披露

NIAID GenAI 被用于生成稿件的初步提纲和初稿，最终内容由人类作者全面撰写、审阅和编辑，以确保准确性和连贯性。

致谢

本研究由美国国家过敏与传染病研究所内部研究部门资助，项目编号AI001150，授予HCA。我们感谢前实验室成员Steven Brooks博士，以及当前疟疾功能基因组学部门的实验室成员Mohamed Ibrahim、Mary Jackson和Jian Wu，他们在实验过程中协助拍摄了图像。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 聚焦酸性酒精StatLab SL89-1
10% NBSLeica Biosystems3800598
4K 显微镜 HDMI 相机Hitech Instruments, Inc.HT-XP4K8MA
抗体稀释液-减少背景DakoS3022
全自动组织处理仪 Leica BiosystemsHistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005
Bond 脱蜡液Leica BiosystemsAR9222
Bond 抗原修复液 1Leica BiosystemsAR9961
Bond 抗原修复液 2Leica BiosystemsAR9640
Bond 聚合物增强检测系统Leica BiosystemsDS9800
Bond 聚合物红染检测系统Leica BiosystemsDS9390
Bond 洗涤液 (10x)Leica BiosystemsAR9590
套管包（玻璃），80–100 μmDMT产品编号：300407
CD31Abcamab28364
解剖皿，大号（派热克斯玻璃），93 mmLiving Systems InstrumentationSKU: DD-90
解剖皿，小号Living Systems InstrumentationSKU: DD-50
解剖显微镜Hitech Instruments, Inc.ZEISS SteREO Discovery.V8 
Dumont #5 镊子Fine Science Tools货号：11295-10
Dumont #5SF 镊子Fine Science Tools货号：11252-00
EcoMountBioCare MedicalEM897L
伊红IHC WorldIW-3100B
苏木精BioCare MedicalCathe-MM
成像相机OlyumpusDP28
成像显微镜OlyumpusBX51
Krebs Henseleit 缓冲液（含 2 mM 氯化钙）Boston BioProducts, Inc.SKU: C-10625N-200mL
Krebs-Henseleit 缓冲液（无钙）Boston BioProducts, Inc.SKU: C-9906W-200mL
封片介质ThermoFisher Scientific4111
肌动描记室及装置DMT202/204CM
PBS（磷酸盐缓冲盐水）Thermofisher Scientific10010023
PPIB ACDBio313908
RNAscope 2.5 LS 试剂盒-红色ACDBio322150
染色机LeicaLeica Bond RX 自动化系统
不锈钢解剖针Living Systems InstrumentationSKU: PIN-0.1MM | PIN-0.2MM | PIN-#3 | PIN-VP-1
Surgipath Paraplast 包埋剂Leica Biosystems39601006
组织保护胶StatLab TissueGuard/SKU: TG12
Vannas 弹簧剪刀 - 2 mm 刃口Fine Science Tools货号：15000-03
Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 mm 刃口Fine Science Tools货号：15000-08
Vannas 弹簧剪刀 - 3 mm 刃口Fine Science Tools货号：15000-00
α-SMAAbcamab5694

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