超声心动图引导下靶向且可靠的干细胞心肌内注射在心肌梗死大鼠模型中的应用

摘要

本文详细介绍了一种采用29 G x 88 mm针头在心肌梗死大鼠模型中进行超声心动图引导下心肌内注射的优化方案。该技术可确保将治疗剂直接、稳定、精确且可重复地递送至梗死周围区域。

摘要

超声心动图引导的心肌内注射（EGI）是一种在临床前心肌梗死（MI）模型中递送干细胞治疗的微创技术。与传统的开胸方法相比，EGI具有更高的临床可转化性、更低的侵入性，并能最小化对动物生理状态的影响。尽管EGI在小鼠模型中已得到广泛应用，但由于解剖结构和技术上的挑战，其在大鼠模型中的应用仍较为有限。特别是，在梗死及梗死周围区域，左心室前壁（LVAW）变薄使得心肌内安全且准确的注射变得复杂，因为壁厚可能低于常用27 G或28 G针头的斜面长度，从而增加心室穿孔或注射失败的风险。为克服这一局限，我们优化了使用29 G Spinocan针头在大鼠MI模型中实施EGI的实验方案。这种直径更小、长度更长的针头能够精确靶向较薄的心肌组织，最大限度减少组织损伤并提高注射准确性，且不受LVAW厚度的影响。该技术可与标准的经胸超声心动图平台兼容，无需开胸手术，从而支持在同一动物个体上进行纵向研究。我们改进的方法可实现将治疗剂稳定、可重复地递送至梗死区邻近的存活心肌组织——这正是再生治疗最有效的区域。通过提升安全性和靶向精度，该方法增强了临床前心脏研究的可转化价值，并有助于在不同实验室之间建立标准化的操作流程。

引言

心血管疾病仍然是全球发病率和死亡率的首要原因，其中心肌梗死（MI）是导致急性和慢性心脏疾病的重要因素¹。尽管药物治疗和介入治疗已取得进展，但成人人类心脏的再生能力有限，常导致不良重构并进展为心力衰竭^2,3。因此，基于干细胞的治疗策略因其修复受损心肌、维持心脏功能和改善临床预后的潜力而受到广泛关注⁴。

稳健的临床前模型对于评估这些疗法的安全性、有效性及递送策略至关重要。在小型动物模型中，大鼠具有多项优势，包括适中的心脏尺寸、已充分表征的心肌梗死建模技术，以及具有临床转化意义的心脏重构反应⁵。传统上，在大鼠心肌梗死（MI）模型中，干细胞的注射通常通过开胸手术实现，从而可直接观察注射部位⁶。然而，该方法具有侵入性，会引入显著的操作风险，并限制了在纵向研究中进行重复干预的可能性。此外，该方法与临床常用的递送方式（如基于导管或经皮注射）缺乏一致性⁷。

超声心动图引导的心肌内注射（EGI）是一种微创替代方法，可在实时成像引导下实现治疗剂的靶向递送。尽管该技术在小鼠模型中已得到充分建....

方案

所有动物实验均经哈瑟尔特大学（UHasselt，比利时迪彭贝克）地方伦理委员会（动物实验伦理委员会，编号ID202308和ID202497）批准，并依照欧盟指令2010/63/EU执行。

1. 仪器设备设置

1. 开启超声成像平台、集成式加热平台、生理监测仪和凝胶加热器。
   注意：为了在 EGI 手术期间清晰且充分地显示左心室前壁，建议使用配备频率≥15 MHz线性阵列换能器的高频超声系统，其轴向分辨力约为75 µm。
2. 打开加热垫，以在去除大鼠胸部毛发期间维持其体温。
3. 选择合适的换能器，并启动三维电机，以确保换能器具有完整的活动范围。
   注意：除了使用动物平台导轨系统的微操纵器外，三维电机可实现高度精确的换能器调节，必要时有助于与注射针对齐。如有需要，也可在不使用三维电机的情况下进行该操作。
4. 成像前确保系统正确对齐。将控制动物平台的螺钉微操纵器设置为中性位置（即在其全部运动范围内居中）。将动物平台本身置于导轨系统的中央位置。调整换能器支架系统，使换能器正对动物平台中心的正上方。

2. 动物准备与麻醉

1. 称重大鼠，计算所需布托啡诺（0.04 mg/kg）的给药体积，用于镇痛。
2. 将大鼠放入与麻醉机相连的....

结果

通过注射精度验证 在- 和 离体 生物发光成像（BLI）
为评估EGI的成功率与效率，首先通过慢病毒载体将干细胞转导以表达萤火虫荧光素酶（Fluc），从而实现 体内 通过生物发光成像（BLI）进行示踪。BLI 确认在 86% 的病例中（n = 14）实现了精确的心肌内递送。 图3A 显示因针头拔出过快导致的部分渗漏，表现为邻近胸腔内出现弥散性发光。相比之下，在一次完全成功的心肌内注射后，在左心室中尖水平检测到强烈且局限的Fluc信号（图3B）。为了进一步确认心肌递送效果，立即对成功注射的动物进行全身成像 离体 离体心脏成像，沿三个横断面水平切分：心尖部、心尖-中段交界处和心室中段。 离体 成.......

讨论

随着以再生疗法修复心肌梗死后心脏功能的临床前研究不断进展，如何实现治疗剂的最佳递送仍面临诸多挑战¹²。与开胸手术相比，微创内窥镜心肌注射（EGI）技术因其更接近临床经皮递送方式、可改善动物福利，并允许在纵向研究中进行多次给药，正日益受到青睐^8,13。然而，目前针对大鼠模型的详细且标准化的操作方案仍十分缺乏，且在慢性梗死周边区域，左心室前壁（LVAW）显著变薄，进一步增加了操作难度¹⁴。本文中，我们通过对手术步骤进行精细优化，显著提高了大鼠心肌内注射的安全性、精确性和可重复性。

一般注意事项与关键步骤
在大鼠心肌内EGI操作过程中，精确控制麻醉并持续监测生理参数对于实验成功至关重要。在整个操作过程中，应将心率（HR）维持在300至450次/分钟之间，呼吸频率（RR）维持在30至50次/分钟之间，以确保在充分镇静与理想的成像声窗之.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
21?MHz MX250 换能器	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	与 Vevo 3100 系统兼容的高频超声换能器
3M Transpore 外科手术胶带	3M	1527	用于将动物的爪子固定在动物平台上
Aquasonic  100 超声传导凝胶	Parker Laboratories BV	01-08	确保换能器与动物皮肤之间良好的声学耦合，以获得最佳图像质量
Bupaq 0.3 mg/mL 犬猫用注射溶液	Richter Pharma AG	57446/4008	用于镇痛管理的阿片类镇痛药（丁丙诺啡）
ISOFLUTEK 1000	Alivira	/	基于异氟烷的吸入性麻醉剂
多瓶凝胶加热器 230 V	Parker Laboratories BV	83-03-20 CE (LCD)	将超声凝胶加热至体温，防止动物因低温引起不适
Signagel 电极凝胶	Parker Laboratories BV	15-25	涂抹于心电图电极上，以改善生理监测中的信号传导
SPINOCAN 29 G X 88 MM	Bbraun	4501900	用于精确心肌内注射的细径针头
Terumo 三件式注射器，预连接皮下针头	Terumo Europe N.V.	MDSS01S2516E	用于安装并固定 22 G 引导针和 29 G 注射针，实现对心肌组织的可控递送
THM150 生理监测仪	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	在操作过程中监测动物的心率、呼吸频率和体温等生命体征
Veet Minima Pure	Reckitt Benckiser	/	脱毛膏
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	高分辨率超声成像系统
Vidisic 羧甲基纤维素钠 980 2mg/g 眼用凝胶	Bausch + Lomb	/	涂抹于麻醉动物的眼睛，防止角膜干燥