超声心动图引导下靶向且可靠的干细胞心肌内注射在心肌梗死大鼠模型中的应用

摘要

本文详细介绍了一种采用29 G x 88 mm针头在心肌梗死大鼠模型中进行超声心动图引导下心肌内注射的优化方案。该技术可确保将治疗剂直接、稳定、精确且可重复地递送至梗死周围区域。

摘要

超声心动图引导的心肌内注射（EGI）是一种在临床前心肌梗死（MI）模型中递送干细胞治疗的微创技术。与传统的开胸方法相比，EGI具有更高的临床可转化性、更低的侵入性，并能最小化对动物生理状态的影响。尽管EGI在小鼠模型中已得到广泛应用，但由于解剖结构和技术上的挑战，其在大鼠模型中的应用仍较为有限。特别是，在梗死及梗死周围区域，左心室前壁（LVAW）变薄使得心肌内安全且准确的注射变得复杂，因为壁厚可能低于常用27 G或28 G针头的斜面长度，从而增加心室穿孔或注射失败的风险。为克服这一局限，我们优化了使用29 G Spinocan针头在大鼠MI模型中实施EGI的实验方案。这种直径更小、长度更长的针头能够精确靶向较薄的心肌组织，最大限度减少组织损伤并提高注射准确性，且不受LVAW厚度的影响。该技术可与标准的经胸超声心动图平台兼容，无需开胸手术，从而支持在同一动物个体上进行纵向研究。我们改进的方法可实现将治疗剂稳定、可重复地递送至梗死区邻近的存活心肌组织——这正是再生治疗最有效的区域。通过提升安全性和靶向精度，该方法增强了临床前心脏研究的可转化价值，并有助于在不同实验室之间建立标准化的操作流程。

引言

心血管疾病仍然是全球发病率和死亡率的首要原因，其中心肌梗死（MI）是导致急性和慢性心脏疾病的重要因素¹。尽管药物治疗和介入治疗已取得进展，但成人人类心脏的再生能力有限，常导致不良重构并进展为心力衰竭^2,3。因此，基于干细胞的治疗策略因其修复受损心肌、维持心脏功能和改善临床预后的潜力而受到广泛关注⁴。

稳健的临床前模型对于评估这些疗法的安全性、有效性及递送策略至关重要。在小型动物模型中，大鼠具有多项优势，包括适中的心脏尺寸、已充分表征的心肌梗死建模技术，以及具有临床转化意义的心脏重构反应⁵。传统上，在大鼠心肌梗死（MI）模型中，干细胞的注射通常通过开胸手术实现，从而可直接观察注射部位⁶。然而，该方法具有侵入性，会引入显著的操作风险，并限制了在纵向研究中进行重复干预的可能性。此外，该方法与临床常用的递送方式（如基于导管或经皮注射）缺乏一致性⁷。

超声心动图引导的心肌内注射（EGI）是一种微创替代方法，可在实时成像引导下实现治疗剂的靶向递送。尽管该技术在小鼠模型中已得到充分建立，但在大鼠模型中的应用仍较为有限。EGI在小鼠中的发展远比在大鼠中更为成熟，主要原因在于心血管研究历史上长期以小鼠作为主要的临床前模型⁸。此外，小鼠体型更小、心脏解剖结构更适宜，有利于超声引导操作的优化⁹。相比之下，大鼠胸壁较厚且呼吸运动更显著，导致操作过程中难以获得稳定、高分辨率的成像图像¹⁰。

高频超声技术的进步使得在大鼠中实施经心肌内注射（EGI）成为可能，从而提高了其临床相关性。然而，心肌梗死区域左心室前壁（LVAW）的变薄仍是啮齿类动物EGI面临的主要挑战。在大鼠中，心肌壁厚度常减少至1 mm以下，而标准的27 G或28 G注射针斜面长度为1.25–1.5 mm，增加了心室穿孔或细胞输送方向不准确的风险。为克服这一局限性，我们采用29 G × 88 mm Spinocan针改进了大鼠的EGI技术。此类针具的斜面长度为1 mm，可实现向梗死区及梗死周边区变薄心肌精准且无创的细胞递送。该操作在高分辨率经胸超声心动图引导下进行，可实时显示解剖标志和针头行进路径。

本优化的经心外膜心肌内注射（EGI）方案提供了一种微创、可重复的方法，可在急性与慢性心肌梗死（MI）的大鼠模型中，不依赖左心室前壁（LVAW）厚度，实现治疗剂向梗死周围心肌的靶向递送。该方法可将药物注射至具有存活心肌的边缘区——这是实现治疗效果的关键部位，同时与开胸手术方法相比，显著减轻了手术负担并缩短了恢复时间。此外，该方案支持需要多次注射和随访成像的纵向研究，从而遵循“3R原则”（替代、减少、优化）减少实验动物使用数量¹¹。本方案可适用于递送药理学制剂、基因治疗药物、生物材料以及多种干细胞类型。通过在大鼠模型中标准化EGI操作，并与临床递送方式保持一致，该方法增强了不同实验室间研究的可重复性，提升了临床前心脏研究的转化价值。

方案

所有动物实验均经哈瑟尔特大学（UHasselt，比利时迪彭贝克）地方伦理委员会（动物实验伦理委员会，编号ID202308和ID202497）批准，并依照欧盟指令2010/63/EU执行。

1. 仪器设备设置

1. 开启超声成像平台、集成式加热平台、生理监测仪和凝胶加热器。
   注意：为了在 EGI 手术期间清晰且充分地显示左心室前壁，建议使用配备频率≥15 MHz线性阵列换能器的高频超声系统，其轴向分辨力约为75 µm。
2. 打开加热垫，以在去除大鼠胸部毛发期间维持其体温。
3. 选择合适的换能器，并启动三维电机，以确保换能器具有完整的活动范围。
   注意：除了使用动物平台导轨系统的微操纵器外，三维电机可实现高度精确的换能器调节，必要时有助于与注射针对齐。如有需要，也可在不使用三维电机的情况下进行该操作。
4. 成像前确保系统正确对齐。将控制动物平台的螺钉微操纵器设置为中性位置（即在其全部运动范围内居中）。将动物平台本身置于导轨系统的中央位置。调整换能器支架系统，使换能器正对动物平台中心的正上方。

2. 动物准备与麻醉

1. 称重大鼠，计算所需布托啡诺（0.04 mg/kg）的给药体积，用于镇痛。
2. 将大鼠放入与麻醉机相连的诱导室中，使用2.5%异氟烷（氧气流速为2 L/min）诱导麻醉。
3. 麻醉诱导完成后，将大鼠转移至加热垫上，以维持体温在37 ± 0.5 °C。通过将大鼠鼻部置于与麻醉系统连接的鼻罩中，持续输送1–3%异氟烷（氧气流速1–1.5 L/min）以维持适当的麻醉深度，并根据需要调整气体浓度。
4. 剃除大鼠胸部毛发，并使用脱毛膏清除残留毛发。脱毛后，交替使用合适的外科消毒剂（如聚维酮碘）和70%乙醇对注射部位进行消毒，重复3次。双眼涂抹眼用凝胶，防止角膜干燥。
5. 将预先计算剂量的布托啡诺经肌肉注射至后肢，以减轻与EGI相关的不适。
6. 将大鼠从加热垫转移至超声成像系统的动物平台。通过平台集成的鼻罩持续提供麻醉气体，维持1–3%异氟烷（氧气流速1–1.5 L/min）的稳定气流。为确保麻醉充分，进行足趾夹捏测试，确认无疼痛反射。将大鼠四肢固定于平台电极上，并涂抹少量电极凝胶以保证最佳信号质量。插入直肠温度探头以持续监测体温。
   注意：在整个成像和注射过程中，必须持续监测生理参数。心率（HR）、呼吸频率（RR）和体温必须保持在可接受范围内，以避免麻醉相关并发症。一般而言，HR应维持在250–400次/分钟，RR应至少为30次/分钟。若HR或RR低于上述阈值，应立即降低异氟烷浓度（例如从2–3%降至1–2%），并确认动物体位正确且未出现低体温。调整应逐步进行，并密切监测，直至参数恢复至目标范围。
7. 在此阶段，采集所需的基线或注射前图像。通常建议获取胸骨旁长轴（PSLAX）和短轴（SAX）的B模式与M模式图像，以及四腔心图像，用于基线功能与解剖评估。
   注意：常规成像可使用如图1A所示的系统设置进行。在注射操作时，需重新调整动物平台位置并相应调节探头。虽然注射过程中采用PSLAX B模式成像进行引导，但由于需精确对准针头，这些图像可能不适用于事后功能分析。

3. 超声心动图引导下的心肌内注射操作步骤

注意：从此时起，需要两名操作人员共同配合才能成功完成注射。操作员 A 负责操控动物平台并监测实时超声心动图图像，而操作员 B 应站在注射装置后方，以精确对齐针头与换能器。

1. 将一支22 G无菌引导针连接到1 mL注射器上，组装注射系统。将装有引导针的注射器放置在注射支架上，并固定注射夹。
   注意：29 G × 88 mm的注射针过于柔软，无法直接穿刺皮肤和肌肉层；必须使用引导针以辅助完成注射。
2. 调整探头与注射支架的位置，确保能够观察到针头。通过探头支架和固定夹调节探头位置，如有需要，可沿导轨旋转注射支架以实现适当的对齐。
3. 在不移动大鼠的前提下，旋转动物平台，使探头的切迹指向大鼠的右肩（图1B-D）。此设置可获得左心室清晰的胸骨旁短轴（PSLAX）B模式图像。确认引导针始终位于探头的运动视野范围内。若出现错位，应通过三维电机系统调整探头位置，而非调整注射支架。
4. 当针头与探头正确对齐后，利用动物平台导轨上的微操纵器螺钉进行成像微调。保持探头位置不变，以维持与针头的对齐状态。可能需要进一步旋转或平移动物平台，以优化图像质量。
5. 观察梗死区域。结合PSLAX B模式和M模式成像，评估梗死范围、局部室壁运动及室壁变薄情况，以判断注射位点的可行性。采用16节段室壁运动评分法识别无运动或严重运动减弱的区域，这些区域代表梗死核心。
6. 确定梗死周边区并选择目标注射位点。选择紧邻梗死核心、且舒张末期室壁厚度大于1 mm的运动减弱区域，以便以较小角度完全插入29 G针头的斜面。
7. 利用导轨系统将注射支架向动物平台推进。使用注射支架上的微操纵器螺钉，将针头精确对准探头正中央。
   注意：精确对齐至关重要。若针头未对准探头中心，则在注射过程中将无法观察到针头。
8. 使用注射支架上的“注射”微操纵器螺钉推进引导针，直至刺穿皮肤。在超声图像中确认针尖可见。若针头不可见，应使用“注射”微操纵器螺钉小心回撤针头，并重复步骤3.7重新对齐。
9. 在超声软件中启用针头引导功能，以确认针头行进路径。将引导针推进至预定目标区域，使针头斜面距离左心室前壁（LVAW）约1–2 mm（图2A）。
   注意：避免用引导针穿刺心肌，以防引起过度出血或心脏损伤。
10. 针头定位完成后，操作员A应牢固稳定引导针基部，确保超声屏幕上持续可见针头。同时，指示操作员B松开固定注射器的夹子，取下注射器，并准备含有注射物的注射器。指令操作员A保持引导针静止不动。
11. 将29 G × 88 mm的针头连接至含有注射物的注射器上（操作员B），并将注射器固定在注射支架上。手动将29 G × 88 mm针头穿过静止的引导针，如有需要，可在x轴平面（探头左右方向）使用微操纵器螺钉进行微调。手动推进，直至在超声图像中可见针头斜面出现在胸腔内。
    注意：由于29 G针头较柔软，在进入胸腔过程中可能发生弯曲。为减少弯曲，操作员A可稳定针杆外部，同时由操作员B将针头推进胸腔。
12. 当29 G × 88 mm针头穿过引导针并在超声图像中可见后，使用微操纵器螺钉进一步精确、安全地将其推进至左心室前壁（LVAW）心肌内。确认针头斜面完全位于心肌内部（图2B）。
    注意：由于29 G针头的斜面相对较长，而心肌壁厚度有限，必须确保整个斜面均嵌入心肌内。如有需要，可使用“冻结图像”功能验证位置。尽管超声深度校准有助于提高精度，但在本方案中，我们通过选择舒张末期室壁厚度>1 mm的注射位点，并在视觉上确认针尖接近但未穿透心内膜边界，来验证深度（图2B）。
13. 缓慢将注射物注入心肌内（操作员B）。成功的经心肌注射可在超声图像中观察到注射部位出现明亮/致密的强回声点，且该信号应与左心室前壁（LVAW）同步运动（图2C）。为减少注射物反流，注射完成后应等待约10秒再回撤针头。
14. 首先，从注射支架上取下带针头的注射器，以降低针刺伤风险。随后，小心将大鼠从动物平台上取下，置于加热垫上使其恢复。持续监测生命体征，直至完全从麻醉中恢复。

结果

通过注射精度验证 在- 和 离体 生物发光成像（BLI）
为评估EGI的成功率与效率，首先通过慢病毒载体将干细胞转导以表达萤火虫荧光素酶（Fluc），从而实现 体内 通过生物发光成像（BLI）进行示踪。BLI 确认在 86% 的病例中（n = 14）实现了精确的心肌内递送。 图3A 显示因针头拔出过快导致的部分渗漏，表现为邻近胸腔内出现弥散性发光。相比之下，在一次完全成功的心肌内注射后，在左心室中尖水平检测到强烈且局限的Fluc信号（图3B）。为了进一步确认心肌递送效果，立即对成功注射的动物进行全身成像 离体 离体心脏成像，沿三个横断面水平切分：心尖部、心尖-中段交界处和心室中段。 离体 成...

讨论

随着以再生疗法修复心肌梗死后心脏功能的临床前研究不断进展，如何实现治疗剂的最佳递送仍面临诸多挑战¹²。与开胸手术相比，微创内窥镜心肌注射（EGI）技术因其更接近临床经皮递送方式、可改善动物福利，并允许在纵向研究中进行多次给药，正日益受到青睐^8,13。然而，目前针对大鼠模型的详细且标准化的操作方案仍十分缺乏，且在慢性梗死周边区域，左心室前壁（LVAW）显著变薄，进一步增加了操作难度¹⁴。本文中，我们通过对手术步骤进行精细优化，显著提高了大鼠心肌内注射的安全性、精确性和可重复性。

一般注意事项与关键步骤
在大鼠心肌内EGI操作过程中，精确控制麻醉并持续监测生理参数对于实验成功至关重要。在整个操作过程中，应将心率（HR）维持在300至450次/分钟之间，呼吸频率（RR）维持在30至50次/分钟之间，以确保在充分镇静与理想的成像声窗之...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
21?MHz MX250 换能器	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	与 Vevo 3100 系统兼容的高频超声换能器
3M Transpore 外科手术胶带	3M	1527	用于将动物的爪子固定在动物平台上
Aquasonic  100 超声传导凝胶	Parker Laboratories BV	01-08	确保换能器与动物皮肤之间良好的声学耦合，以获得最佳图像质量
Bupaq 0.3 mg/mL 犬猫用注射溶液	Richter Pharma AG	57446/4008	用于镇痛管理的阿片类镇痛药（丁丙诺啡）
ISOFLUTEK 1000	Alivira	/	基于异氟烷的吸入性麻醉剂
多瓶凝胶加热器 230 V	Parker Laboratories BV	83-03-20 CE (LCD)	将超声凝胶加热至体温，防止动物因低温引起不适
Signagel 电极凝胶	Parker Laboratories BV	15-25	涂抹于心电图电极上，以改善生理监测中的信号传导
SPINOCAN 29 G X 88 MM	Bbraun	4501900	用于精确心肌内注射的细径针头
Terumo 三件式注射器，预连接皮下针头	Terumo Europe N.V.	MDSS01S2516E	用于安装并固定 22 G 引导针和 29 G 注射针，实现对心肌组织的可控递送
THM150 生理监测仪	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	在操作过程中监测动物的心率、呼吸频率和体温等生命体征
Veet Minima Pure	Reckitt Benckiser	/	脱毛膏
Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	/	高分辨率超声成像系统
Vidisic 羧甲基纤维素钠 980 2mg/g 眼用凝胶	Bausch + Lomb	/	涂抹于麻醉动物的眼睛，防止角膜干燥