本文介绍了一种通过面部静脉穿刺使用采血针从实验小鼠采集血液的优化方案。我们结合该技术与流式细胞术分析，用于表征转基因、同源系及报告基因小鼠品系的细胞表型。该方法同样适用于血清细胞因子分析及糖尿病研究。
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摘要
摘要
本文介绍了一种使用采血针经小鼠面部静脉穿刺采集血液的优化方案，该方法快速、微创且成本低廉，是尾静脉采血和眼后静脉窦采血等常用技术的有效替代方案。该技术特别适用于需要多次重复采血的研究，例如小鼠表型分析、血清细胞因子检测以及糖尿病研究。本方案操作高效，所需专用设备极少，非常适合用于小鼠的高通量细胞分析。我们的主要应用是通过流式细胞术对转基因、同源系和报告基因小鼠进行表型分析，并以抗体染色和tdTomato报告基因小鼠为例进行了演示。本文详细阐述了从动物准备到样本分析的完整操作流程。关键步骤包括使用3 mm采血针采集血液、细胞裂解、染色以及流式细胞术分析。面部静脉穿刺在提高采血效率的同时，也有助于实现符合伦理的科研实践。这一实用且灵活的方法适用于涉及小鼠血液采集和细胞分析的多种实验方案。
引言
高效、可重复且创伤最小的采血方法对于许多小鼠研究至关重要，特别是需要多次采血的研究。本方案提供了一种简化的采血流程，通过面部静脉穿刺采集少量血液，随后进行红细胞裂解、抗体染色及流式细胞术分析。该工作流程适用于高通量应用，同时最大限度地减少了技术操作的复杂性。
许多采血方法，如眶后静脉采血或尾静脉切开，可能需要涉及加热、 麻醉1以及较长的抓持时间，这些操作可能对动物造成显著应激2。相比之下，使用采血针进行面部静脉穿刺提供了一种简单且快速的替代方案，有助于实现符合伦理且可重复的实验设计。该方法已在先前研究中得到验证，可作为小鼠微量采血的人道替代方法3。
我们通过转基 因报告小鼠（包括 TdTomato 报告小鼠和 MD4-IgHEL 小鼠）的免疫细胞表型分析来展示该方法。后者需要使用抗 CD19 和抗 IgMa 抗体进行染色，其中 IgMa 是一种 IgM 同种型。
尽管本方案是为血液细胞分析而设计，但通过省略红细胞裂解步骤，可轻松适用于其他用途，包括血清细胞因子分析、特异性抗体检测或葡萄糖浓度测定。总体而言，该技术在尽量减少动物痛苦的同时，提高了数据质量和实验效率，因而广泛适用于多种研究领域。
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方案
小鼠饲养于达特茅斯-希契科克医学中心的特定病原体阴性环境中，该机构为经AAALAC认证的单位，实验操作均依照机构动物护理与使用委员会批准的方案进行。
1. 材料准备
- 准备5 mL的培养管，每管加入1.5 mL的1×红细胞（RBC）裂解缓冲液（将10× RBC裂解缓冲液用无菌水稀释而成）。每只小鼠使用一管。
- 准备一盒3 mm采血针（每只小鼠使用一根）。
- 准备一盒纱布海绵（每只小鼠使用一块）。
- 准备移液管以及一个含有1× HBSS（含0.5 mM EDTA）的50 mL锥形管（适用于最多20只小鼠）。
注意：该缓冲液用于终止裂解反应。如果该缓冲液仅用于表型分析而无需后续进一步分析，则大多数pH为7.2–7.4的中性缓冲液均可替代HBSS使用。 - 准备一个冰桶、额外的1× RBC裂解缓冲液、备用的5 mL管和移液管。
2. 小鼠和管子的标记
- 为每个笼卡和小鼠标记与试管标签相对应的表型标识符，以帮助区分实验结果与对应的小鼠。常用的标识符包括在小鼠尾巴上使用不同颜色的永久性记号笔（例如红色、蓝色、绿色、黑色），这些颜色需与试管上的标记一致。
注意：表型分析时务必设置对照小鼠。对于报告基因小鼠，应设置无报告基因表达的阴性对照；对于转基因小鼠，应设置野生型小鼠作为对照。 - 将标记好的试管放入试管架中，并在附近放置冰桶，以便在采血后立即将试管存放于冰上。
- 打开实验所需的所有采血针。
- 打开实验所需的所有纱布垫。
3. 小鼠操作与样本采集
- 用惯用手抓住小鼠的尾巴，将其放置在金属喂食架或任何平坦的表面上。
- 用非惯用手的食指和拇指从尾部向颈部方向抓握小鼠背部皮肤以固定头部。
- 用其余手指固定尾巴，尽量减少小鼠的活动。
- 用惯用手取一支已打开的3 mm采血针。
- 找到口部外侧稍远处的小块无毛区域，并沿直线向耳朵方向划线，至与外眼角相交处停止（图1）。
- 在该交点处插入采血针，以确保获得充足的血液供应。
- 使用采血针的平坦侧缘收集一滴血液。
- 将带有血样的整个采血针放入已标记、含有红细胞裂解缓冲液的试管中。
- 轻轻振荡试管，确保整个样本充分混入缓冲液中。混合不充分可能导致凝血及数据质量下降。
- 使用纱布海绵对穿刺部位施加轻柔压力5–10秒。
- 将小鼠放回笼中。
- 保持血液与裂解缓冲液的比例大于1:10。
- 对每只额外的小鼠重复本节中的步骤。
4. 样品的裂解、制备与分析
- 裂解开始后等待 7-10 分钟，加入约 2 mL 含 0.5 mM EDTA 的 1x HBSS（或其他培养基）。
- 在 400 g 条件下离心 5 分钟。在此期间配制抗体混合液。
- 弃去上清液。
- 用镊子从管中取出采血针。
- 加入 30 µL 用于鉴定目标细胞群体的抗体混合液 。
注意：为对 MD4 IgHEL 小鼠进行表型分析，我们的抗体混合液包含 1 mL HBSS、25 μL IgMa PerCP cy-5.5 和 25 μL CD19 APC。 - 涡旋振荡 2-3 秒以重悬细胞，并在 4 °C 下孵育 25-30 分钟。
- 打开流式细胞仪，并根据实验需求设置流式图。
注意：如果目的是进行表型分析，则染色后无需离心细胞。 - 使用移液管向每个样本中加入 150-25 µL HBSS 或其他培养基。如需使用，可加入 DAPI 至终浓度 1. µg/mL（使用 10 µL 含 DAPI 的培养基）。
- 在上机检测前，对每个样本涡旋振荡 2-3 秒。
- 以 8,000-10,000 个事件/秒的速度采集数据，若裂解效果良好，目标采集细胞数为 100,000 个。
- 分析所采集的数据，结果如 图 2 和 图 3 所示。
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结果
通过流式细胞术，图2展示了利用上述方案制备的野生型（WT）和PF4-Cre TdTomato报告小鼠的裂解血液样本。第一组流式图显示了侧向散射光（SSC，反映细胞颗粒度）与前向散射光（FSC，指示细胞大小）的关系。细胞碎片和血小板位于坐标轴原点附近，而淋巴细胞较颗粒更丰富的中性粒细胞更小。碎片与活细胞之间的明显分离表明红细胞裂解有效且样本完整性良好。可通过将报告基因通道的荧光强度与前向散射光（FSC）作图来评估报告小鼠。正如图2所示，PF4-Cre小鼠在细胞碎片区域显示出TdTomato+血小板，而野生型小鼠则无此现象。
在此样本中，无需使用抗体，进一步凸显了通过一致的血液处理和加工所能实现的清晰度和分辨率。
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讨论
这种优化的面部静脉采血方案为其他常用方法（如尾静脉采血或眶后静脉采血）提供了一种高效且简便的替代选择。尽管该方案简单直接，但仍需严格遵循几个关键步骤。其中最重要的一步是正确确定穿刺部位4。选择脸颊上的适当位置进行穿刺，可确保获得充足的血流，同时将小鼠的不适感降至最低。立即将血液样本加入预冷的裂解缓冲液中也至关重要，这可以防止血液凝固并维持细胞完整性。将裂解后的样本在400 × g 条件下离心5分钟，对于有效分离并回收可用于分析的活细胞十分关键。
经过多年使用，已引入多种改进措施以提高数据质量和可重复性。在整个操作过程中将所有培养基和样品保持在冰上，可显著提高细胞保存效果，并减少流式细胞术分析过程中的拖尾现象5。时间控制也至关重要。若裂解时间少于7分钟，红细胞可能无法完全裂解；反之，若裂解 超过10分钟，则可能导致细胞过度死亡。抗体染色方案也可能需要根据所使用的特定抗原或荧光染料进行微调。尽管存在这些变量，血液采集和制备的核心步骤在不同实验需求下仍保持一致。若需...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号：R35 HL155458（C.V.J.）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| APC 抗小鼠 CD19 抗体 | Biolegend | 152410 | CD19 APC |
| Centrifuge 5810 R，无转子，120 V，50/60 Hz | Eppendorf | 22625501 | 离心机 |
| Dermacea 纱布海绵 8 层 2" x 2" | Covidien | 441211 | 纱布海绵 |
| 一次性刻度移液管 | Fisherbrand | 13-711-91am | 转移移液管 |
| ErgoOne 单通道移液器（200 µL） | USA Scientific | 7100-2200 | 移液器 |
| 乙二胺四乙酸（0.5 M 溶液/pH 8.0） | Fisherbrand | BP2482-100 | EDTA 5 M |
| FACSymphony A3 细胞分析仪 | BD Biosciences | 660937 | 流式细胞仪 |
| Fisherbrand 模拟旋涡混合器 | Fisherbrand | 02-215-414 | 旋涡混合器 |
| Goldenrod 动物采血针 3 mm 无菌 5 盘装，每盘 200 支 | Goldenrod | GR 3MM | 3 mm 采血针 |
| Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11051-10 | 镊子 |
| Hank’s 平衡盐溶液，1X，不含钙和镁 | Corning | 21-021-CVR | HBSS |
| PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠 IgMa 抗体 | Biolegend | 408612 | IgMa PerCP cy-5.5 |
| RBC 裂解缓冲液（10x） | Biolegend | 420301 | RBC 裂解缓冲液 |
| 无盖圆底聚苯乙烯试管 | Fisherbrand | FB1496110 | 培养管 |
| Sharpie 永久性记号笔，凿尖头 | Sharpie | 38254PP | Sharpies |
| 经测试符合 USP 标准的无菌水 | Corning | 25-055-CI | 细胞培养级水 |
| TipOne 移液器吸头补充装（200 µL 天然斜面） | USA Scientific | 1111-1730 | 移液器吸头 |
参考文献
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
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重印与许可
