快速优化光诱导系统以控制哺乳动物基因表达

诱导型基因表达系统等合成生物学工具为生物学研究做出了重大贡献。它们以可调、可逆和精确的方式调节基因表达的能力可以改善对蛋白质生产^的控制 1,2,3,4,5,6，细胞形态 7,8,9,10,11,12，代谢途径 13,14,15^，16,17,18 以及生物制造和治疗应用的其他靶点。化学诱导系统可能具有残余^19,20 或脱靶效应。由于额外的下游纯化工艺，化学添加剂也可能非常昂贵且难以在工业上扩大规模21,22,23。光诱导基因表达系统可以为生物制造实践提供可扩展且精确的方法24,25,26,27。

许多光诱导基因表达系统已被开发为有用的合成生物学工具，用于各种应用28,29,30,31,32,33,34,35,36和蓝色35,37,38，红色/远红^12,39，⁴⁰，或绿色⁴¹ 灯。在基于CRISPR的光遗传学基因调控的情况下，改变递送的单个引导RNA（gRNA）的量会影响内源基因⁴²的mRNA表达，并且需要针对不同的细胞系进行优化。还可以使用反式激活蛋白，例如 VP64 37,42,43,44^、VP16 39,40,44,45,46、p65⁴⁴，或它们的融合 47，从而增加光遗传学系统的模块化。为了研究复杂且相互交织的生物学途径 12,40,48,49,50,51,52,53，可以测试这些已知成分的不同组合。此外，不同的细胞系可以在同一系统⁵²的诱导中表现出差异。不同的诱导水平会导致基因表达不足或基因表达精确控制的敏感性不足，需要严格的测试才能在新型或更具生物学相关性的细胞系中找到最佳的光遗传学系统。随着光遗传学基因调控的步伐不断加快和适用性不断扩大，必须快速表征这些不同的系统。

目前表征光遗传学工具的方法要么使用基因的稳定表达，要么瞬时表达^12,54。生成稳定表达的细胞系并优化系统动力学以实现最大表达可能非常耗时，因此成本高昂。瞬时表达可以快速获得有价值的见解，尤其是在测试多组分光遗传学系统时。在这里，我们使用了蓝光激活的CRISPR-dCas9效应器（LACE）³⁷系统，该系统由隐花色素2（CRY2）和隐花色素相互作用的碱性螺旋环螺旋N端（CIBN）组成。它已被用于控制哺乳动物细胞中的基因表达，例如HEK293T（人胚胎肾细胞）^37,38、CHO-DG44（中国仓鼠卵巢细胞）⁵⁵和C2C12（小鼠成肌细胞）³⁸。其模块化特性非常适合通过瞬态表达和高通量方法快速表征系统性能。例如，像 LACE 这样的多组分系统可能需要优化质量比以改善诱导，这是光遗传学系统表征中通常不采用的步骤。

该协议详细介绍了两个质粒LACE（2pLACE）³⁸系统的快速优化和表征。在此设置中，2pLACE 控制荧光报告基因 eGFP（增强型绿色荧光蛋白）在HEK293T细胞中的表达。使用 OptoPlate-96 在黑色玻璃底 96 孔板中进行激活，OptoPlate-96 是由 Lukasz Bugaj 及其同事设计和构建的 3D 打印 LED 阵列 56,57,58,59。该方案专门优化了双质粒系统不同质量比的最大表达。它还包括用户友好的代码，用于控制不同的光强度，以研究系统的可调性及其完整的动态范围。流式细胞术用于数据收集和分析。用于生成 LED 阵列的质粒构建体和 3D 打印材料的协议可以在以前的出版物^54,56 中找到。这些方法突出了用于表征光诱导基因表达系统的快速、高通量管道。

1. 以 96 孔格式接种HEK293T细胞

1. 在生物安全柜中，收集漂白剂废物容器、血清移液器、移液器辅助剂、Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）、含有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 Dulbecco 修饰的 Eagle 培养基 （DMEM） 和含有汇合HEK293T细胞的 T-75 细胞培养瓶。将培养基预热至 37 °C。
2. 在 T-75 烧瓶中，通过倒置显微镜检查汇合度是否约为 80%-100%。
3. 在生物安全柜中，使用血清移液器从细胞培养瓶中吸出用过的培养基。避免接触烧瓶的表面或塑料。将用过的介质和吸气器丢弃在废物容器中。
4. 用约 10 mL DPBS 轻轻洗涤细胞，方法是将其吸入烧瓶的一角并在表面轻轻旋转。从烧瓶中吸出 DPBS，然后将洗涤液和吸气器丢弃在废物容器中。
5. 加入 1.5 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 以覆盖烧瓶表面并在室温下孵育 1 分钟。轻轻敲击烧瓶，将细胞从表面松开。
6. 将 8.5 mL 新鲜 DMEM 加入烧瓶中。用血清移液器重悬并混合细胞，直到所有聚集体都通过上下抽吸被分解。
7. 将 9 mL 细胞悬液收集到 15 mL 锥形管中。
   1. 将 9 mL 新鲜 DMEM 加入烧瓶中，并将其放入 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中
8. 使用血细胞计数器，将 10 μL 悬浮细胞与 10 μL 台盼蓝染料以 1：1 的比例混合，以计算细胞浓度。使用此值准备足够的细胞以接种在板上。
9. 在高性能 #1.5 黑色 96 孔玻璃底板的每个孔中接种 ~35,000 个细胞，并在 37 °C 和 5% CO₂ 的培养箱中 24 小时。

2. 2pLACE转染优化

1. 对于一个孔和 10% 的过量，将 11 μL 温无血清 DMEM （SFM） 等分到 1.5 mL 微量离心管中。
2. 使用 CRY2-eGFP：CIBN-gRNA 质粒质量比等于 1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2 和 9：1，每孔总 DNA 等分试样 110 ng 到 SFM 等分试样（表 1）。
3. 作为阳性对照，将相同质量的CMV-eGFP质粒等分到不同的SFM等分试样中。
4. 对于每个孔，等分 11 μL SFM 用于转染试剂稀释。
5. 以 DNA 和转染试剂的 1：3 质量 （μg） 与体积 （μL） 的比例制备转染试剂。
6. 将稀释的转染试剂加入稀释的DNA中，并在室温下孵育12分钟以生成转染复合物。
7. 向每个孔中加入~20μL转染复合物。确保它不接触井壁。
8. 用铝箔包裹板，并将其置于37°C和5%CO₂ 的培养箱中24小时。

3. 2pLACE 激活

1. 使用这些设置修改微控制器输入代码以照亮所需的孔（补充编码文件 1，第 147 - 158 行）。
   1. LED 强度：9.27 mW/cm² （补充编码文件 1，第 200 - 215 行）。
   2. 脉冲长度：1 秒（补充编码文件 1，第 280 - 290 行）。
   3. 脉冲频率：0.067 Hz（每 15 秒）（补充编码文件 1，第 264 - 278 行）。
      注意： 波长设置由安装的 LED 类型决定。
2. 用 70% 乙醇喷洒 OptoPlate 的 3D 打印盖子，然后让它在生物安全柜中干燥。
3. 打开暗室红光灯，将96孔板放入生物安全柜中，用干燥的3D打印盖子。
   注意：可以选择使用荧光显微镜查看CMV-eGFP细胞以估计转染效率。
4. 取96孔板并将其放在LED阵列上以构建LED阵列装置。确保板卡入到位。
5. 将微控制器、LED 和风扇端口连接到电源。
6. 小心地用 70% 乙醇喷洒电线并擦干。
7. 将LED阵列设备放入37°C和5%CO₂ 的培养箱中24小时。确保 LED 按预期打开，并且在培养箱密封时电线没有拉紧。

4. 流式细胞术制备

1. 在红光环境中，取出 OptoPlate 并将板放入生物安全柜中
   注意：可以选择通过荧光显微镜观察细胞以目视确认光诱导。
2. 小心地从每个孔中吸出所有培养基。
3. 使用 30 μL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 分离细胞，并在室温下孵育 1 分钟。
4. 将每个孔与 100 μL 冷 FACS 缓冲液（PBS 中的 1% FBS）混合直至单细胞。
5. 将每个样品转移到 V 形底 96 孔板中。
6. 在室温下以 164 x g 离心 V 底 96 孔板 10 分钟。
7. 吸出 80 μL 上清液，不要干扰沉淀。
8. 加入 200 μL 冷 FACS 缓冲液以重悬沉淀。
9. 用铝箔包裹 V 底 96 孔板以实现轻质绝缘。
10. 将盘子放入装有冰块的聚苯乙烯泡沫塑料盒中进行运输。

5. 流式细胞术门控和数据收集

1. 使用背面的开关打开流式细胞仪，然后打开计算机上相应的流式细胞仪软件。
2. 运行系统启动程序并将 2 mL 去离子水装入样品加载器中（补充图 1A）。
3. 使用提供的QC磁珠运行质量控制（QC）（补充图1B）。
4. 确保流式细胞仪处于板采样模式（补充图1C）。
5. 设置并指定样品孔（补充图1D）。
6. 创建以下散点图和表格（补充图2A）。
   1. 侧向散射 （SSC-A） 与前向散射 （FSC-A）。
   2. SSC-H 与 SSC-A。
   3. SSC-A 与 FITC-A。
   4. FITC-A统计表（补充图2B）。
7. 将 V 型底板卡入细胞仪的板加载器中。
8. 选择未转染的孔并单击初始化，然后单击运行。确保体积采样率为 10 μL/min（补充图 2C）。
9. 调整 SSC 和 FITC 电压，以将感兴趣的群体集中在 SSC-A 与 FSC-A 图上（补充图 2C）。
   1. 创建一个多边形来门控感兴趣的健康细胞群（补充图2D）。
   2. 创建一个多边形，用于在 SSC-H 与 SSC-A 图上进行双峰判别。
   3. 调整FITC电压，将未转染的细胞放置在SSC-A与FITC-A图的左侧（补充图2D）。
10. 对剩余的未转染孔重复上述步骤并记录平均FITC-A数据。
11. 选择转染的 CMV-eGFP 孔，然后单击运行。
12. 调整 FITC 电压以捕获 SSC-A 与 FITC-A 图中的自发荧光和荧光细胞。
    1. 创建一个多边形，将荧光细胞与非荧光细胞进行门控，同时参考未转染细胞中的初始门（补充图2E）。
13. 以 60 μL/min 自动记录样品，直到达到 200 秒和/或事件达到 10,000 次（补充图 2F）。
14. 将 Mean FITC 导出为 CSV 文件并分析数据。
15. 通过每日清洁选项清洁流式细胞仪（补充图2G）。

6. LED亮度优化

1. 编辑微控制器脚本以测试所需的 LED 强度（补充编码文件 1，第 200-215 行）。
   注意：相对于微控制器脚本中值的等效 LED 强度在其他地方报告³⁸。使用不同的 LED 时可能需要进行自我校准。
2. 确保脚本在（补充编码文件 1，第 200-215 行）中包含以下值，如 表 2 所示，并将代码上传到微控制器。
3. 重复步骤 1-5。

采用先前文献 37,38,55 中的工作流程元素，我们添加了来自 OptoPlate-96 的高通量同步照明，并展示了快速优化哺乳动物细胞中光诱导基因表达系统的管道（图 1）。

对于诱导型基因表达系统，除了绝对开和断（泄漏）表达外，高动态范围也是一个关键的性能标志。通过转染细胞的荧光成像，可以定性观察光激活细胞和避暗细胞之间eGFP表达的差异（图2）。与 5：5 的比率相比，1：9 的比率明显导致最大 eGFP 表达较低。还可以观察到 5：5 比例的泄漏增加。组成型表达 eGFP （CMV-eGFP） 转染细胞和未转染细胞的荧光成像是有价值的阳性和阴性对照，可分别将转染效率以及系统的诱导表达和渗漏表达置于背景中。使用荧光成像使用户可以快速查看和验证蓝光基因表达的成功转染和激活，从而在流式细胞术之前提供有价值的检查点。然后可以使用流式细胞术来量化平均荧光强度 （MFI） 和动态范围。

光激活细胞后，用FACS缓冲液制备它们，并通过流式细胞术进行分析。HEK293T细胞约为11-15μm，导致FSC增益为500，SSC增益为125（补充图2C），以健康细胞群居中。较高的电压会导致分析碎片而不是健康的细胞群。我们的运行在第一个种群门 （P1） 中始终有超过 ~60% 的事件（图 3A-D）。一旦健康细胞群构成SSC-A与FSC-A图中的大部分事件，还可以检查事件密度以识别大多数细胞群（补充图3A）。然后，可以通过SSC-H与SSC-A图进行双峰鉴别，这对于可靠和可重复的结果至关重要60,61。在这个系统中，我们通常发现 P1 中超过 95% 的事件是单线态（图 3A-D）。在SSC-A与FITC-A图中，未转染的细胞通常位于图中心的左侧，并被门控以具有<0.1%的群体（图3A）。然后，eGFP阳性细胞将填充未转染样品中空的门，从而导致MFI的单细胞分析测量（图3B）。一旦收集阴性和阳性对照以设置适当的门和电压，就可以使用相同的门分析具有 2pLACE 的样品，以可靠地排除自发荧光细胞（图 3C，D）。在这里，eGFP 阳性细胞的群体百分比为 CMV-eGFP 的 ~99%，2pLACE 转染细胞的 ~57%。最终门也可以在PE-A通道上使用，以确保捕获高荧光细胞（补充图3B）。

选择测试的另一个比例是 3：7。作为验证步骤，在流式细胞术之前拍摄荧光显微镜图像，并观察到成功转染以用2pLACE诱导eGFP表达，预期低于CMV-eGFP（图4A）。收集2pLACE的流式细胞术数据后，可以将蓝光激活的基因表达与渗漏基因表达进行比较（图4B）。使用步骤 3.1 中列出的设置，我们能够观察到蓝光激活后表达增加 ~3 倍，与显微镜定性观察到的增加的荧光信号相匹配。此外，可以通过测量~60%健康单细胞的eGFP阳性群体百分比或亲本百分比来间接看到转染效率（图4C）。

完整地实施该协议可以确定最佳质量比（图5A）和光强度（图5B），以实现最大动态范围和可调表达。低于 6：4 的质量比表现出更大的动态范围 （3.5-4.5），而超过 6：4 的质量比由于背景增加和最大 eGFP 表达降低而表现出动态范围减小。对于最大表达和高动态范围，优选 3：7 的比例。低于 3：7 的比率显示出相似的倍数诱导，但总体最大表达量较低。使用我们之前校准的光强度值38 （表 2），可以表征相对于不同光强度的基因表达水平。光强度还控制 eGFP 的表达水平，其中 MFI 饱和为 ~3 mW/cm2。超过此值的光强度可能具有不同的MFI值，这可能是由于某些样品中的光漂白，如~9和11 mW/cm2所示。

图 1：测试光遗传学系统的高通量实验的一般管道。 将细胞接种到黑色96孔板中24小时。然后，用 DNA 和转染试剂的 12 分钟孵育期转染细胞。转染后 24 小时，将板置于 OptoPlate-96 上以激活蓝光。在所需的蓝光激活持续时间后，在红光环境中制备细胞用于流式细胞术。流式细胞术数据表示为eGFP阳性细胞在黑暗中或用蓝光处理的平均荧光强度图。 请点击此处查看此图的大图。

图 2：HEK293T 细胞中 2pLACE 在开启和关闭状态下的代表性荧光显微镜图像。 测试不同质量比的CRY2-eGFP：CIBN-gRNA的eGFP表达水平。将细胞暴露在蓝光下（ON）或在黑暗中保持（OFF）24小时。比例尺代表 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。

图 3：未转染 （UT）、CMV-eGFP 和 2pLACE HEK293T细胞的代表性流式细胞术散点图。 使用板加载器功能进行流式细胞术。（A）基于前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）对HEK293T细胞进行门控。SSC-A 与 FSC-A 图上的事件浓度可以使用等高线图（补充图 3A）进行可视化，以帮助对健康人群进行门控。使用线性门对 SSC-H 与 SSC-A 图进行双峰鉴别。最终图通过参考未转染的样品来门控荧光细胞。（B）细胞如（A）所示进行门控，在统计表中显示荧光群体和荧光强度（补充图2B）。（C，D）通过P3门分别门控2pLACE转染的细胞。洋红色群体代表所有eGFP阳性细胞（补充图3B）。 请点击此处查看此图的大图。

图4：HEK293T细胞中光诱导的eGFP表达的定性和定量分析。 （A）用2pLACE或CMV-eGFP质粒转染的HEK293T细胞的荧光显微镜图像。（B）在蓝光或黑暗条件下维持的细胞中eGFP的平均荧光强度（MFI）的定量。（C）通过流式细胞术门控分析测量的eGFP阳性细胞的百分比。门控导致 <0.1% 的未转染细胞落在 eGFP 阳性阈值范围内。流式细胞术数据表示平均值，误差线表示四次技术重复的标准差。 请点击此处查看此图的大图。

图5：2pLACE和蓝光强度的代表性质量比的流式细胞术。 （A）将CRY2-eGFP：CIBN-gRNA的各种质量比转染到HEK293T细胞中，然后使用与方案步骤3中报告的相同设置暴露在蓝光下或保持在黑暗中。每个条件是 3 个生物重复的平均值。（B）基因表达与蓝光强度的函数关系的代表性趋势。每个条件是 6 个技术重复的平均值。平均荧光强度通过表达 eGFP 的细胞的流式细胞仪门控进行量化。所有误差线均代表标准差。对于质粒比率，使用比较质粒比率的明暗的单因素 t 检验 计算 MFI 统计显着性。对于光强度，与黑暗 （OFF） 状态相比，使用单因素方差分析和 Tamhane 的 T2 事后检验计算统计显着性。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p <0.0001，*****p < 0.00001，ns 不显著。该图改编自 Garimella 等人 38。 请点击此处查看此图的大图。

表1：使用示例浓度的每孔CRY2-eGFP和CIBN-gRNA质粒的量。 体积量是每孔的，可以根据实验中的样品或重复次数进行修改。 请按此下载此表。

表 2：蓝光强度的推荐值。代码可在 补充编码文件 1 （第 215-228 行）中找到。等效强度值是使用先前使用光功率计报告的校准数据计算的。每个强度级别有 6 个技术重复。G 行和 H 行用于 CMV-eGFP 和未转染的对照孔。 请按此下载此表。

补充图 1：协议的步骤 5.1-5.5。 （A） 运行系统启动程序。（B）使用荧光团珠的质量控制标准化。（C） 从试管采样切换到载板模式。（D） 选择标示为样品孔的孔;本例选择了 35 个孔。 请点击此处下载此文件。

补充图2：协议的步骤5.6-5.14。 （A）设置光散射图：FSC-A与SSC-A用于健康细胞群门控，SSC-A与SSC-H用于双峰鉴别，SSC-A与FITC-A用于门控自发荧光和eGFP阳性细胞。（B）设置统计表以获取FITC-A数据以测量平均荧光强度。（C） 在要显示的事件选项卡中突出显示停止规则。确保缓慢的样品流速，弹出和加载板，初始化流式细胞仪探头，并调整采集电压。（D） 创建多边形以对每个种群进行门禁，如图所示。（E） 增加适当数量的井。（F） 设置和门完成后单击 自动录制 。（G） 收集完所有样本并导出统计数据后，单击“ 每日清洁 ”。 请点击此处下载此文件。

补充图3：捕获门内所有细胞的验证，由P4（洋红色）中的绿色事件可视化。 （A）eGFP阳性种群门内健康种群的等高线图（P3）。细胞主要集中在红色区域，向外减少。（B） 用于门控 P4 的 SSC-A 与 PE-A 图，提供额外的检查以确保在 FITC-A 图中考虑所有荧光事件。 请点击此处下载此文件。

补充编码文件 1：实现上述协议中描述的所有属性的 Arduino 代码示例。此文件使用 表 2 中推荐的 LED 强度值激活所有 LED 位置。 请点击此处下载此文件。

作者声明没有利益冲突。