快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

摘要

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。

摘要

可诱导基因表达工具在人类健康和生物技术领域具有广阔的应用前景，但现有工具往往成本高昂、难以逆转，并存在不良的脱靶效应。光遗传学系统利用光响应蛋白调控调控因子的活性，从而实现通过“开关”控制基因表达。本研究优化了一种简化的光激活CRISPR效应系统（2pLACE），该系统可实现对哺乳动物基因表达的可调节、可逆且精确的控制。OptoPlate-96平台支持高通量筛选 通过 用于单细胞分析和2pLACE快速优化的流式细胞术。本研究展示了如何在HEK293T细胞中结合OptoPlate-96使用2pLACE系统，以确定最大化动态范围的最佳组分比例，并获得蓝光强度响应曲线。类似的工作流程可拓展至其他哺乳动物细胞以及其他光遗传系统和光照波长。这些进展提升了光遗传学工具在生物制造应用中的精确性、可扩展性和适应性。

引言

诸如可诱导基因表达系统之类的合成生物学工具为生物研究做出了重要贡献。这类系统能够以可调节、可逆且精确的方式调控基因表达，从而改善对蛋白质合成^1,2,3,4,5,6、细胞形态^{7,8,9,10,11,12}、代谢通路^{13,14,15,16,17<....}

方案

1. 以96孔板形式接种HEK293T细胞

1. 在生物安全柜中，准备一个含漂白剂的废液容器、血清移液管、移液器、杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），以及一个长满HEK293T细胞的T-75细胞培养瓶。将培养基预热至37 °C。
2. 在T-75培养瓶中，通过倒置显微镜观察，确认细胞融合度约为80%–100%。
3. 在生物安全柜中，使用血清移液管吸除细胞培养瓶中的废弃培养基，避免接触瓶壁或塑料表面。将废液和移液管弃入废液容器中。
4. 用约10 mL的DPBS轻柔清洗细胞：将DPBS加入培养瓶的一角，轻轻旋转瓶体使其覆盖整个表面。随后吸除DPBS，并将洗涤液和移液管弃入废液容器中。
5. 加入1.5 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖培养瓶表面，在室温下孵育1分钟。轻敲培养瓶以松动细胞。
6. 向培养瓶中加入8.5 mL新鲜DMEM。使用血清移液管反复吹打，重悬并混匀细胞，直至所有细胞团块完全分散。
7. 取9 mL细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
   1. 向原培养瓶中加入9 mL新鲜DMEM，放入37 °C、5% CO₂的培养箱中继续培养
8. 使用血细胞计数板，将10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝染液按1:1比例混合，计算细胞浓度。根据....

结果

借鉴先前文献中的工作流程元素^37,38,55，我们引入了来自OptoPlate-96的高通量同步光照，并展示了一种快速优化哺乳动物细胞中光诱导基因表达系统的流程（图1）。

对于可诱导的基因表达系统而言，除了绝对的开启和关闭（渗漏）表达水平外，高动态范围也是一个关键的性能指标。通过转染细胞的荧光成像，可以定性观察光照激活细胞与避光培养细胞之间eGFP表达的差异（图2）。从视觉上可见，1:9的比例相较于5:5的比例表现出较低的最大eGFP表达水平。同时也可以观察到，5:5比例下的渗漏表达有所增加。组成型表达eGFP（CMV-eGFP）的转染细胞以及未转染细胞的荧光成像，分别作为有价值的阳性和阴性对照，有助于评估转染效率以及系统在诱导状态和渗漏状态下的表达情况。利用荧光成像，用户可快速.......

讨论

本方案展示了在哺乳动物细胞中对多组分瞬时基因表达进行光遗传学控制的方法，可使其他研究人员利用荧光报告基因快速、同时地表征模块化光遗传学系统。

本研究中，优化了一个双质粒光诱导系统，用于在 HEK293T 细胞中表达 eGFP。为实现成功的共转染，必须优化细胞接种密度和质粒质量比，以获得最高的转染效率。这一点在干细胞培养中尤为重要，因为细胞汇合度过高可能诱导分化^62,63,64，若细胞培养物不均一，将导致数据分析结果不一致。当需要维持细胞的干性时，可能需以较低密度接种，并在转染前更换培养基，因为培养基成分也可能诱导细胞分化^65,66,67,68<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	VWR	10025-724
10 mL 试剂储液槽	VWR	77395-252
10 mL 血清移液管	VWR	75816-100
1000 μL 滤芯吸头	VWR	76322-154
15 mL 高性能离心管，平盖	VWR	89039-664
1931-C 光功率计	Newport	1931-C
2 mL 血清移液管	VWR	75816-104
20 μL 滤芯吸头	VWR	76322-134
200 μL 滤芯吸头	VWR	76322-150
50 mL 高性能离心管，平盖	VWR	89039-656
96 孔 V 型底板	BRANDplates	781661
A21，LED 红色灯泡	Bluex Bulbs	N/A	红光光源
Arduino IDE 软件	Arduino	N/A
II 级生物安全柜	NuAire	N/A
亮线血细胞计数板	Hausser Scientific	3110
细胞计数载玻片	BioRad	1450016
96 孔细胞培养板，#1.5H 玻璃底板	Cellvis	P96-1.5H-N
CytExpert 软件	Beckman Coulter	N/A
CytoFLEX 即用型日常质控荧光微球	Beckman Coulter	C65719	4 °C
CytoFLEX-S 流式细胞仪（4 个紫色，2 个蓝色，4 个黄绿色，3 个红色通道）	Beckman Coulter	C09766
杜尔贝科磷酸盐缓冲液粉末，无钙，无镁	Fisher Scientific	21600069	室温
Eppendorf Centrifuge 5804	Eppendorf	022622501	v 型底板离心步骤
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625501
Eppendorf Research plus，8 通道，可调体积，30 - 300 μL	Eppendorf	3125000052
Eppendorf Research plus，单通道，可调体积，100 - 1000 μL	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research plus，单通道，可调体积，2 - 20 μL	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus，单通道，可调体积，20 - 200 μL	Eppendorf	3123000055
通用实验室标签胶带	VWR	89097-920
Gibco DMEM 粉末，高糖	Fisher Scientific	12100061	4 °C
Gibco 台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15-250-061	室温
Gibco 优质热灭活胎牛血清	Fisher Scientific	A5256901	-20 °C
Gibco 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含 EDTA，动物来源，1×，酚红，500 mL	Gibco	25300062	-20 °C
HEK293T 细胞	ATCC	CRL-11268	-80 °C，液氮
实验室标记笔，Micronova	VWR	89205-944
金属台灯	Simple Designs	N/A	红光照明用台灯
OptoPlate-96	LABmaker	N/A
Pipet-aid XP	Drummond	4-000-101
质粒：CIBN-gRNA	N/A	N/A	-20 °C
质粒：CMV-eGFP	N/A	N/A	-20 °C
质粒：CRY2-eGFP	N/A	N/A	-20 °C
PolyJet DNA 体外转染试剂	Fisher Scientific	NC1536117	4 °C
T-75 细胞培养瓶	VWR	10062-860
水套式 CO2 培养箱	VWR	10810-884