方法文章

快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

DOI：

10.3791/68779

⸱

2025年11月4日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可诱导基因表达工具在人类健康和生物技术领域具有广阔的应用前景，但现有工具往往成本高昂、难以逆转，并存在不良的脱靶效应。光遗传学系统利用光响应蛋白调控调控因子的活性，从而实现通过“开关”控制基因表达。本研究优化了一种简化的光激活CRISPR效应系统（2pLACE），该系统可实现对哺乳动物基因表达的可调节、可逆且精确的控制。OptoPlate-96平台支持高通量筛选 通过 用于单细胞分析和2pLACE快速优化的流式细胞术。本研究展示了如何在HEK293T细胞中结合OptoPlate-96使用2pLACE系统，以确定最大化动态范围的最佳组分比例，并获得蓝光强度响应曲线。类似的工作流程可拓展至其他哺乳动物细胞以及其他光遗传系统和光照波长。这些进展提升了光遗传学工具在生物制造应用中的精确性、可扩展性和适应性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

诸如可诱导基因表达系统之类的合成生物学工具为生物研究做出了重要贡献。这类系统能够以可调节、可逆且精确的方式调控基因表达，从而改善对蛋白质合成1,2,3,4,5,6、细胞形态7,8,9,10,11,12、代谢通路13,14,15,16,17,18以及其他生物制造和治疗应用靶点的控制。化学诱导系统可能存在残留效应19,20或脱靶效应。此外，由于需要额外的下游纯化步骤，化学添加剂可能非常昂贵且难以实现工业规模放大21,22,23。光诱导基因表达系统则可为生物制造实践提供一种可扩展且精确的方法24,25,26,27。

许多光诱导基因表达系统已被开发为合成生物学中有用的工具，广泛应用于各种场景28,29,30,31,32,33,34,35,36，可利用的光波长包括蓝光35,37,38、红光/远红光12,39,40或绿光41。在基于CRISPR的光遗传学基因调控中，调节递送的单个向导RNA（gRNA）的量可影响内源基因的mRNA表达水平42，并且需要针对不同细胞系进行优化。转录激活蛋白如VP6437,42,43,44、VP1639,40,44,45,46、p6544或其融合蛋白47也可被使用，从而增强光遗传系统的模块化特性。为了研究复杂且相互关联的生物通路12,40,48,49,50,51,52,53，可以测试这些已知组件的不同组合。此外，相同的系统在不同细胞系中可能表现出不同的诱导效果52。不同的诱导水平可能导致基因表达不足或在精确控制基因表达方面灵敏度不够，因此需要进行严格的测试，以在新的或更具生物学相关性的细胞系中找到最优的光遗传系统。随着光遗传基因调控技术发展速度的加快及其应用范围的不断扩大，快速表征这些不同系统变得至关重要。

目前，表征光遗传学工具的方法通常采用基因的稳定表达或瞬时表达12,54。构建稳定表达的细胞系并优化系统动力学以实现最大表达水平可能耗时较长，因而成本较高。瞬时表达则能够快速提供有价值的实验结果，尤其适用于测试多组分光遗传学系统。本研究中，我们采用了蓝光激活的CRISPR-dCas9效应系统（LACE）37，该系统由隐花色素2（cryptochrome 2, CRY2）和隐花色素相互作用碱性-螺旋-环-螺旋N端结构域（cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix N-terminal, CIBN）组成。该系统已被用于调控多种哺乳动物细胞中的基因表达，包括HEK293T（人胚胎肾细胞）37,38、CHO-DG44（中国仓鼠卵巢细胞）55以及C2C12（小鼠成肌细胞）38。由于其模块化特性，LACE系统非常适合通过瞬时表达和高通量方法快速表征系统性能。例如，像LACE这样的多组分系统可能需要优化各组分之间的质量比例以提高诱导效率，而这一优化步骤在常规的光遗传学系统表征中通常未被采用。

本方案详细描述了双质粒LACE（2pLACE）系统的快速优化与表征方法38。在该体系中，2pLACE调控增强型绿色荧光蛋白（eGFP，enhanced green fluorescent protein）在HEK293T细胞中的表达。实验在黑色玻璃底96孔板中进行，使用由Lukasz Bugaj及其同事设计并构建的OptoPlate-96装置——一种3D打印的LED阵列56,57,58,59。本方案重点优化了双质粒系统在不同质粒质量比条件下的最大表达水平。同时提供了用户友好的控制代码，用于调节不同光强，以研究该系统的可调性及其完整的动态响应范围。数据的采集与分析采用流式细胞术。质粒构建体的制备以及LED阵列3D打印材料的相关方案可参见先前发表的文献54,56。这些方法展示了一条快速、高通量的表征光诱导基因表达系统的流程。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 以96孔板形式接种HEK293T细胞

  1. 在生物安全柜中，准备一个含漂白剂的废液容器、血清移液管、移液器、杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）、含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），以及一个长满HEK293T细胞的T-75细胞培养瓶。将培养基预热至37 °C。
  2. 在T-75培养瓶中，通过倒置显微镜观察，确认细胞融合度约为80%–100%。
  3. 在生物安全柜中，使用血清移液管吸除细胞培养瓶中的废弃培养基，避免接触瓶壁或塑料表面。将废液和移液管弃入废液容器中。
  4. 用约10 mL的DPBS轻柔清洗细胞：将DPBS加入培养瓶的一角，轻轻旋转瓶体使其覆盖整个表面。随后吸除DPBS，并将洗涤液和移液管弃入废液容器中。
  5. 加入1.5 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖培养瓶表面，在室温下孵育1分钟。轻敲培养瓶以松动细胞。
  6. 向培养瓶中加入8.5 mL新鲜DMEM。使用血清移液管反复吹打，重悬并混匀细胞，直至所有细胞团块完全分散。
  7. 取9 mL细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。
    1. 向原培养瓶中加入9 mL新鲜DMEM，放入37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养
  8. 使用血细胞计数板，将10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝染液按1:1比例混合，计算细胞浓度。根据该数值准备足够数量的细胞用于接种培养板。
  9. 在高性能#1.5黑色96孔玻璃底板的每孔中接种约35,000个细胞，每孔体积为100 µL，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养24小时。

2. 2pLACE 转染条件优化

  1. 对于一个孔并预留10%过量，取11 µL预热的无血清DMEM（SFM）加入1.5 mL微量离心管中。
  2. 按照CRY2-eGFP与CIBN-gRNA质粒质量比分别为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1的比例，将每孔总共110 ng的质粒DNA加入上述SFM中（表1）。
  3. 作为阳性对照，将等量的CMV-eGFP质粒分别加入不同的SFM管中。
  4. 对于每个孔，另取11 µL SFM用于转染试剂的稀释。
  5. 按照DNA与转染试剂质量（µg）与体积（µL）之比为1:3的比例配制转染试剂。
  6. 将稀释后的转染试剂加入稀释的DNA中，室温孵育12分钟，形成转染复合物。
  7. 向每个孔中加入约20 µL转染复合物，注意避免接触孔壁。
  8. 用铝箔纸包裹培养板，置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24小时。

3. 2pLACE 激活

  1. 修改微控制器输入代码，使用以下设置来照亮目标孔（补充编码文件1，第147–158行）。
    1. LED强度：9.27 mW/cm2（补充编码文件1，第200–215行）。
    2. 脉冲时长：1 s（补充编码文件1，第280–290行）。
    3. 脉冲频率：0.067 Hz（每15 s一次）（补充编码文件1，第264–278行）。
      ​注意：波长设置由所安装LED的类型决定。
  2. 用70%乙醇喷洒OptoPlate的3D打印盖子，并在生物安全柜中晾干。
  3. 打开暗室红光灯，将96孔板放入生物安全柜中，并用已干燥的3D打印盖子替换原盖子。
    注意：可选择使用荧光显微镜观察CMV-eGFP细胞，以评估转染效率。
  4. 取96孔板并将其放置在LED阵列上，构建LED阵列装置。确保板卡扣到位。
  5. 将微控制器、LED和风扇接口连接至电源。
  6. 小心地用70%乙醇喷洒导线，然后擦干。
  7. 将LED阵列装置放入37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24小时。确保LED按预期点亮，并且在培养箱关闭时导线不处于紧绷状态。

4. 流式细胞术样品制备

  1. 在红光环境下，取出 OptoPlate 并将培养板放入生物安全柜中
    注意：可选择通过荧光显微镜观察细胞，以直观确认光诱导效果。
  2. 小心吸去每个孔中的全部培养基。
  3. 使用 30 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，并在室温下孵育 1 分钟。
  4. 加入 100 µL 冷 FACS 缓冲液（含 1% FBS 的 PBS）混匀各孔，直至形成单细胞悬液。
  5. 将每个样品转移至 V 型底 96 孔板中。
  6. 将 V 型底 96 孔板在室温下以 164 × g 离心 10 分钟。
  7. 小心吸去 80 µL 上清液，避免扰动沉淀。
  8. 加入 200 µL 冷 FACS 缓冲液重悬沉淀。
  9. 用铝箔包裹 V 型底 96 孔板以避光。
  10. 将培养板放入装有冰的泡沫盒中进行运输。

5. 流式细胞术设门与数据采集

  1. 使用仪器背面的开关打开流式细胞仪，并在计算机上打开相应的流式细胞术软件。
  2. 运行系统启动程序，并在样品加载器中加入 2 mL 去离子水（补充图 1A）。
  3. 使用提供的质控微球（QC beads）进行质量控制（QC）检测（补充图 1B）。
  4. 确保流式细胞仪处于微孔板取样模式（补充图 1C）。
  5. 设置并指定样品孔位（补充图 1D）。
  6. 创建以下散点图和表格（补充图 2A）。
    1. 侧向散射（SSC-A）对前向散射（FSC-A）。
    2. SSC-H 对 SSC-A。
    3. SSC-A 对 FITC-A。
    4. FITC-A 统计表格（补充图 2B）。
  7. 将 V 型底微孔板卡入细胞仪的板加载器中。
  8. 选择一个未转染的样品孔，点击“初始化”，然后点击“运行”。确保样品流速为 10 µL/min（补充图 2C）。
  9. 调节 SSC 和 FITC 电压，使目标细胞群在 SSC-A 对 FSC-A 图中居中（补充图 2C）。
    1. 绘制多边形门控，圈选目标健康细胞群（补充图 2D）。
    2. 在 SSC-H 对 SSC-A 图中绘制多边形门控，用于排除双联体细胞。
    3. 调节 FITC 电压，使未转染细胞在 SSC-A 对 FITC-A 图中位于左侧（补充图 2D）。
  10. 对剩余的未转染孔重复上述步骤，并记录平均 FITC-A 数据。
  11. 选择一个 CMV-eGFP 转染的样品孔，点击“运行”。
  12. 调节 FITC 电压，使自体荧光细胞和荧光表达细胞均出现在 SSC-A 对 FITC-A 图中。
    1. 参考未转染细胞的初始门控，绘制多边形门控以区分荧光表达细胞与非荧光细胞（补充图 2E）。
  13. 以 60 µL/min 自动记录样品，直至运行时间达到 200 秒和/或采集事件数达到 10,000（补充图 2F）。
  14. 将平均 FITC 值导出为 CSV 文件并进行数据分析。
  15. 通过“日常清洗”（Daily Clean）选项对流式细胞仪进行清洗（补充图 2G）。

6. LED 强度优化

  1. 编辑微控制器脚本以测试所需的LED强度（补充编码文件1，第200-215行）。
    注意：关于微控制器脚本中数值对应的等效LED强度，可参考其他文献报道38。当使用不同LED时，可能需要进行自校准。
  2. 确保脚本中包含按表2设计的相应数值（位于补充编码文件1，第200-215行），并将代码上传至微控制器。
  3. 重复步骤1-5。

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结果

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借鉴先前文献中的工作流程元素37,38,55，我们引入了来自OptoPlate-96的高通量同步光照，并展示了一种快速优化哺乳动物细胞中光诱导基因表达系统的流程（图1）。

对于可诱导的基因表达系统而言，除了绝对的开启和关闭（渗漏）表达水平外，高动态范围也是一个关键的性能指标。通过转染细胞的荧光成像，可以定性观察光照激活细胞与避光培养细胞之间eGFP表达的差异（图2）。从视觉上可见，1:9的比例相较于5:5的比例表现出较低的最大eGFP表达水平。同时也可以观察到，5:5比例下的渗漏表达有所增加。组成型表达eGFP（CMV-eGFP）的转染细胞以及未转染细胞的荧光成像，分别作为有价值的阳性和阴性对照，有助于评估转染效率以及系统在诱导状态和渗漏状态下的表达情况。利用荧光成像，用户可快速...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案展示了在哺乳动物细胞中对多组分瞬时基因表达进行光遗传学控制的方法，可使其他研究人员利用荧光报告基因快速、同时地表征模块化光遗传学系统。

本研究中，优化了一个双质粒光诱导系统，用于在 HEK293T 细胞中表达 eGFP。为实现成功的共转染，必须优化细胞接种密度和质粒质量比，以获得最高的转染效率。这一点在干细胞培养中尤为重要，因为细胞汇合度过高可能诱导分化62,63,64，若细胞培养物不均一，将导致数据分析结果不一致。当需要维持细胞的干性时，可能需以较低密度接种，并在转染前更换培养基，因为培养基成分也可能诱导细胞分化65,66,67,68<...

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披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由转化研究所通过美国国家航空航天局（NASA）合作协定 NNX16AO69A 及良好食品研究所（Good Foods Institute）提供支持。本项目得到了加州大学戴维斯分校（UC Davis）流式细胞术共享资源实验室的支持，布里奇特·麦克劳克林（Bridget McLaughlin）、乔纳森·范戴克（Jonathan Van Dyke）和阿什莉·卡拉杰（Ashley Karajeh）提供了技术协助，经费来自美国国家癌症研究所 P30 CA093373（综合癌症中心）和 S10OD018223（贝克曼库尔特“Cytoflex”流式细胞仪）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管VWR10025-724
10 mL 试剂储液槽VWR77395-252
10 mL 血清移液管VWR75816-100
1000 μL 滤芯吸头VWR76322-154
15 mL 高性能离心管，平盖VWR89039-664
1931-C 光功率计Newport1931-C
2 mL 血清移液管VWR75816-104
20 μL 滤芯吸头VWR76322-134
200 μL 滤芯吸头VWR76322-150
50 mL 高性能离心管，平盖VWR89039-656
96 孔 V 型底板BRANDplates781661
A21，LED 红色灯泡Bluex BulbsN/A红光光源
Arduino IDE 软件ArduinoN/A
II 级生物安全柜NuAireN/A
亮线血细胞计数板Hausser Scientific3110
细胞计数载玻片BioRad1450016
96 孔细胞培养板，#1.5H 玻璃底板CellvisP96-1.5H-N
CytExpert 软件Beckman CoulterN/A
CytoFLEX 即用型日常质控荧光微球Beckman CoulterC657194 °C
CytoFLEX-S 流式细胞仪（4 个紫色，2 个蓝色，4 个黄绿色，3 个红色通道）Beckman CoulterC09766
杜尔贝科磷酸盐缓冲液粉末，无钙，无镁Fisher Scientific21600069室温
Eppendorf Centrifuge 5804Eppendorf 022622501v 型底板离心步骤
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus，8 通道，可调体积，30 - 300 μLEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus，单通道，可调体积，100 - 1000 μLEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus，单通道，可调体积，2 - 20 μLEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus，单通道，可调体积，20 - 200 μLEppendorf3123000055
通用实验室标签胶带VWR89097-920
Gibco DMEM 粉末，高糖Fisher Scientific121000614 °C
Gibco 台盼蓝溶液，0.4%Fisher Scientific15-250-061室温
Gibco 优质热灭活胎牛血清Fisher ScientificA5256901-20 °C
Gibco 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含 EDTA，动物来源，1×，酚红，500 mLGibco25300062-20 °C
HEK293T 细胞ATCCCRL-11268-80 °C，液氮
实验室标记笔，MicronovaVWR89205-944
金属台灯Simple DesignsN/A红光照明用台灯
OptoPlate-96LABmakerN/A
Pipet-aid XPDrummond4-000-101
质粒：CIBN-gRNAN/AN/A-20 °C
质粒：CMV-eGFPN/AN/A-20 °C
质粒：CRY2-eGFPN/AN/A-20 °C
PolyJet DNA 体外转染试剂Fisher ScientificNC15361174 °C
T-75 细胞培养瓶VWR10062-860
水套式 CO2 培养箱VWR10810-884

参考文献

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