使用全安装组织成像对肠粘液进行三维定量

Summary

本研究提出了一种 3D 成像方法，使用全安装肠组织和多光子显微镜来量化分泌的粘液，从而能够对氨基甲酰氯胆碱等刺激做出反应的粘液动力学进行精确的体积分析和可视化。

Abstract

粘液通过促进消化、形成抵御微生物的屏障和调节肠道内的免疫反应，在维持肠道稳态方面发挥着关键作用。它的分泌受到各种内在和外在因素的调节，包括微生物感染和炎症。虽然传统的粘液分析方法依赖于相对定量，例如测量组织学切片中的粘液厚度，但这些方法对肠腔内分泌粘液的实际体积和空间分布的了解有限。在这里，我们提出了一种使用全安装肠组织和多光子显微镜对粘液进行绝对三维定量的详细方法。该方案包括结扎肠袢的制备，用氨基甲酰氯胆碱处理作为杯状细胞激活的刺激，组织固定和用于成像的染色。使用多光子显微镜，我们获取管腔表面的 Z 堆叠图像。这些在 Imaris 软件中进行处理，以量化分泌粘液的体积和空间分布。我们证明氨基甲酰氯氯在 30 分钟内强有力地诱导回肠和结肠组织中的粘液分泌。分泌的粘液以零星和不连续的方式出现在整个管腔中，这强调了体积分析相对于传统二维方法的重要性。该协议使研究人员能够获得绝对定量数据并 原位可视化粘液分布，为研究生理和病理条件下的肠道粘液动力学提供了强大的工具。

Introduction

哺乳动物胃肠道的粘膜环境是高度动态的，支持多样化微生物群落的定植。肠上皮由各种特殊细胞组成，这些细胞协同吸收营养、维持屏障完整性并与免疫系统进行交流¹。其中，杯状细胞储存粘蛋白颗粒，并在稳态条件下将粘液分泌到管腔中。这种粘液形成一个关键的物理屏障，防止微生物与上皮层直接接触，调节组织炎症，维持肠道稳态^2,3。粘液分泌失调会损害屏障功能，并与炎症和肿瘤发生有关 4,5,6,7。

肠粘液分泌可由内在因素（例如神经递质乙酰胆碱）和共生物的微生物成分触发 ^8,9。鉴于肠道环境的复杂性，影响杯状细胞粘液分泌的许多因素仍未被探索。因此，定量管腔粘液的精确方法对于研究不同刺激如何影响分泌动力学至关重要。传统方法主要依赖于相对定量：例如，在离体肠外植体系统^10,11中使用荧光或木炭颗粒测量粘液厚度，或评估染色组织切片中管腔微生物与上皮细胞之间的距离^12,13。虽然这些方法便于相对比较，但它们可能无法捕获分泌粘液的完整分布或三维结构，特别是因为分泌粘液并不总是均匀地覆盖上皮细胞。

在这项研究中，我们提出了一种使用全安装肠组织对管腔粘液进行三维可视化和绝对定量的方法。这种方法需要使用适当的固定剂进行新鲜组织固定，以保持结构完整性和形态，然后使用共聚焦或多光子显微镜进行荧光染色和成像。通过将测试剂直接施用于深度麻醉小鼠的结扎肠袢，然后立即固定，该方法保留了天然粘液结构并允许分析分泌动力学。与成像深度主要受组织厚度限制的切片组织相比，全安装组织（无脂质）的成像深度达到约 200-300 μm，受到光散射和组织混浊的限制。使用这种技术，我们表明氨基甲酰氯胆碱 （CCh） 是一种乙酰胆碱类似物，其受体在杯状细胞¹⁴ 上表达，可强有力地诱导快速粘液分泌。值得注意的是，分泌的粘液沿着上皮形成连续层，在管腔内形成不连续结构，这些特征在传统组织切片中很难检测到。该协议为量化肠粘液的三维分布和比较各种刺激的粘液诱导潜力提供了一个强大的平台。

Protocol

所有动物实验均经长庚大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。长庚大学的动物设施获得了实验动物护理评估和认证协会 （AAALAC） 的认可。在这些研究中没有观察到动物健康问题。

1、固定基座的制备

1. 在微波烧瓶中将琼脂糖粉末与ddH₂O混合至浓度为4%（w / v）。微波炉加热 2-3 分钟，直到沸腾而没有微小气泡。
   注意：体积取决于样品的数量;一个 6 厘米的培养皿大约 10 毫升。
2. 让琼脂糖溶液在~3分钟内冷却至~60°C。小心地将琼脂糖倒入 6 厘米的培养皿中，直到液体高度达到培养皿的一半（对于 6 厘米的培养皿，大约 10 毫升）。
3. 将带盖的培养皿放在密闭区域 20-30 分钟，直到琼脂糖完全凝固。

2、固定材料的制备

1. 准备新的铜线并将它们切成 5 毫米的长度。每片纸巾需要6-8根金属丝。

3. CCh溶液的制备

1. 将结晶 CCh 溶解在无菌 PBS 缓冲液中，终浓度为 10 μM（一个肠袢为 200 μL）。

4、注射麻醉剂的制备

1. 要制备麻醉储备液，将 2,2,2-三溴乙醇溶解在 2-甲基-2-丁醇中。
2. 使用无菌PBS稀释储备液，使最终工作溶液含有30mg / mL的2,2,2-三溴乙醇和3%（v / v）2-甲基-2-丁醇。
3. 彻底涡旋~1分钟，直到溶液中没有沉淀残留（最大速率：8）。
4. 将储备液在4°C的避光处储存，以免降解;准备后 1 个月处理库存。
5. 麻醉前，将储备液吸入无菌PBS中并充分混合以确保均匀分散，达到每只小鼠250mg / kg的最终剂量。
   注意：2,2,2-三溴乙醇具有神经毒性，2-甲基-2-丁醇具有挥发性并具有刺激性气味。应使用适当的防护设备。处置时，将废物收集在密封容器中，并遵循机构的危险化学废物处置程序。

5. 通过环注射进行肠道接种

1. 腹腔注射200μL2,2,2-三溴乙醇（每只小鼠250mg / kg）麻醉6-8周龄的小鼠，并将小鼠放在加热垫上以维持其体温。
2. 用酒精消毒皮肤表面后，用手术剪刀在小鼠的左下腹部切开一个切口，并在麻醉下暴露盲肠。
3. 识别回肠或近端结肠，将肠袢放在无菌纱布上，并使用动脉夹固定两端，形成一个 3 厘米长的闭环。
4. 用无菌PBS冲洗纱布上的器官。
5. 在麻醉下将体积不超过 200 μL 的无菌 PBS 或 CCh 试剂注射到结扎的肠袢中。

6. 组织采集、固定和染色

1. 治疗30分钟后，通过颈脱位对小鼠实施安乐死，并收获肠袢。
2. 使用镊子固定肠袢并在无菌 PBS 中轻轻冲洗。
3. 轻轻地纵向切开肠袢，并在无菌PBS中冲洗组织。
4. 压平组织并使用铜线段将其固定在 6 厘米培养皿中的琼脂糖上。
5. 用 10 mL 4% 多聚甲醛溶液将组织固定在培养皿中 12-24 小时。
6. 用PBS洗涤组织至少3次以去除残留的多聚甲醛。
7. 将组织浸入10mL封闭缓冲液（补充有0.4%Triton X-100和3%牛血清白蛋白[BSA]的PBS）中，在4°C下在培养皿中12-24小时。
8. 在封闭缓冲液中用小麦胚芽凝集素（WGA，1：200）和鬼笔环肽（1：500）染色组织，在培养皿中以120 rpm在4°C下摇动12-24小时。
   注意：为了尽量减少染料消耗，可以将组织锚定在浸入2mL染料缓冲液中的3cm培养皿中的固化琼脂糖上进行染色。
   注意：多聚甲醛会造成吸入危险。在处理过程中应使用适当的防护设备，例如在通风橱中作。处置时，将废物收集在密封容器中，并遵循机构的危险化学废物处置程序。

7. 多光子显微镜图像采集

1. 用PBS洗掉剩余的染色缓冲液至少3倍。
2. 在10mL PBS中的6cm培养皿中，用铜线将组织锚定在琼脂糖上。
3. 使用配备高数值孔径物镜的多光子显微镜获取肠道组织和相关分泌粘液的 100 个光学切片（覆盖 99 μm 深度）用于深部组织成像。使用波长设置为 750 nm 的多光子显微镜激发源。使用 BP500-550 nm 和 BP565-610 nm 带通滤光片收集发射信号。将扫描速度设置为 8。
   注意：对于多光子显微镜，最大扫描速度为 9，值越高表示采集越快。速度设置取决于显微镜的容量。当使用用于采集 3D 堆栈的成像平台时，我们建议扫描速度为 8，以平衡采集时间和图像质量。

8. 图像分析和粘液定量（图1）

1. 要测量每个粘液颗粒的体积（在 WGA 通道中），请通过将文件拖放到 Arena 页面上来打开 Imaris 中的图像堆栈 。单击曲面图标 开始曲面创建工作流程。按照标准步骤对 z 堆栈中的颗粒体积进行分割和量化。具体参数和加工步骤详见 图1。
2. 排除小于1,000μm³的粘液颗粒，它们主要是杯状细胞（图2A，B）。
3. 总结每组分泌的粘液量。

9. 统计分析

1. 分析和比较每组的总体积。在 “列” 中输入粘液体积值，并使用非参数 Mann-Whitney 检验进行分析。

Results

在这种方法中，我们从通过多光子显微镜获取的全安装组织的堆叠图像中量化了肠粘液的体积。用荧光鬼笔环肽和小麦胚芽凝集素（WGA）染色肠道组织，分别观察细胞F-肌动蛋白和粘液^15,16。在用 PBS 处理的回肠和结肠组织中，WGA⁺ 粘液主要在上皮表面的杯状细胞内检测到。给予氨基甲酰氯胆碱 （CCh） 后，观察到两个组织的肠腔中的粘液量增加。值得注意的是，分泌的粘液没有在上皮上形成连续的层，而是零星分布在整个管腔中（图3A）。为了计算WGA⁺粘液的总体积，我们使用Imaris中的“创建表面”工具来标记堆叠图像中的所有WGA⁺结构，捕获细胞内杯状细胞粘液和分泌的管腔粘液（图3B）。

我们假设体积大于典型杯状细胞的 WGA⁺ 物体代表分泌...

Discussion

在这里，我们提出了一种使用全安装组织染色，多光子显微镜和Imaris软件分析的肠道粘液三维定量方法。该程序允许观察肠腔内粘液的不连续分布，并提供粘液量的绝对测量值。

在外植体组织^{培养系统中}也观察到刺激时粘液分布不连续8。在之前使用离体外植体培养物的研究中，粘液定量基于测量补充珠子与组织表面之间的距离^10,11。然而，这种方法不能捕获分泌粘液对刺激的分散、斑块状分布。我们的方法解决了这一限制，也可以适用于外植体组织培养系统，其中实验持续时间不受麻醉限制。尽管如此，我们建议这两个系统是相辅相成的。体内结扎袢系统维持肠道与其他系统（例如已知会影响粘液分泌的神经系统和免疫系统）之间的生理联系¹⁷。

通过将测试剂腔内输送到连...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-三溴甲醇	西格玛-奥尔德里奇	T48402
2-甲基-2-丁醇	西格玛-奥尔德里奇	240486
6厘米盘及nbsp;	Alpha Plus	16021-1
琼脂糖	西班牙语	A02599
BSA	生物商店	ALB001
氨甲酰胆碱氯化物 &98%（滴定），结晶	西格马	SI-C4382-1G
铜线（新）	顶级科技线 &有线工业	IW00125	没有绝缘层的铜线
钳子	希内特	ST-M110
纱布，无菌的	GMTH	1940年5月
GraphPad 棱镜 8	GraphPad 软件
加热垫	舒适	SY-666
IMARIS 10.0.0	牛津乐器
对甲醛	比奥沃瓦斯	BL0415-1000
PBS	基因星	BL0180-1000
Phalloidin标记探针	Invitrogen	A12379
剪刀	希内特	02-1250.18
特里顿 X-100	默 克	1.08603.1000
小麦胚芽凝集素（WGA）偶联物	生物体	29027
蔡司7MP，配备W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III水浸物镜（NA 1.0），Spectra-Physics Mai Tai HP ti蓝宝石飞秒激光器（无DeepSee模块），配备BP500 nm-550 nm和BP565 nm-610 nm探测器，激光波长750 nm			用于获取高NA物镜的3D叠片用于深层组织成像的成像平台;多光子显微镜的激发源，波长为750纳米