本研究介绍了一种利用完整肠组织和多光子显微镜进行三维成像的方法，用于定量分析分泌的黏液，从而实现对氯化氨甲酰胆碱等刺激物作用下黏液动态变化的精确体积分析和可视化。
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本文内容
摘要
摘要
黏液在维持肠道稳态中发挥关键作用，包括促进消化、形成抵御微生物的屏障以及调节肠道内的免疫反应。其分泌受到多种内在和外在因素的调控，如微生物感染和炎症。尽管传统的黏液分析方法依赖于相对定量，例如通过组织学切片测量黏液层厚度，但这些方法难以准确反映肠道腔内分泌黏液的实际体积和空间分布。本文介绍一种利用全组织肠道样本和多光子显微镜进行黏液绝对三维定量的详细方法。该方案包括结扎肠段的制备、使用氯化氨甲酰胆碱刺激杯状细胞活化、组织固定及染色成像等步骤。通过多光子显微镜获取肠腔表面的Z轴层扫图像，并利用Imaris软件对分泌黏液的体积和空间分布进行定量分析。我们证实，氯化氨甲酰胆碱可在30分钟内显著诱导回肠和结肠组织的黏液分泌。分泌的黏液在肠腔内呈散在且不连续分布，凸显了三维体积分析相较于传统二维方法的重要性。本方案使研究人员能够获得黏液分泌的绝对定量数据并实现其分布的可视化 关键词：黏液分泌，肠道稳态，杯状细胞，氯化氨甲酰胆碱，多光子显微镜，三维定量，全组织样本，Imaris软件 原位为研究生理和病理条件下的肠道黏液动态提供了强有力的工具。
引言
哺乳动物胃肠道的黏膜环境高度动态，支持多种微生物群落的定植。肠上皮由多种特化细胞组成，这些细胞协同作用以吸收营养物质、维持屏障完整性，并与免疫系统进行通讯1。其中，杯状细胞在稳态条件下储存黏蛋白颗粒并将其分泌到管腔中。这种黏液形成了一道关键的物理屏障，可防止微生物直接接触上皮层，调节组织炎症反应，并维持肠道稳态2,3。黏液分泌的失调会损害屏障功能，并与炎症及肿瘤发生相关4,5,6,7。
肠道黏液分泌可由内在因素（如神经递质乙酰胆碱）以及共生微生物的微生物组分触发8,9鉴于肠道环境的复杂性，影响杯状细胞黏液分泌的许多因素仍有待探索。因此，建立一种精确量化管腔内黏液的方法，对于研究不同刺激如何影响黏液分泌动态至关重要。传统方法主要依赖于相对定量，例如利用荧光颗粒或炭颗粒测量黏液层厚度 离体 肠道外植系统10,11，或评估染色组织切片中管腔微生物与上皮之间的距离12,13尽管这些方法适用于相对比较，但可能无法捕捉分泌型黏液的完整分布或三维结构，尤其是因为分泌型黏液并不总是均匀覆盖上皮层。
本研究介绍了一种利用完整肠组织进行管腔黏液三维可视化及绝对定量的方法。该方法需使用适当的固定剂对新鲜组织进行固定，以保持其结构完整性和形态特征，随后通过共聚焦或双光子显微镜进行荧光染色与成像。通过将测试试剂直接注入深度麻醉小鼠的结扎肠段，随后立即固定，该方法可保留黏液的天然结构，并实现对分泌动力学的分析。与切片组织相比，后者成像深度主要受限于组织厚度，而完整肠组织（未经脱脂处理）的成像深度可达约200–300 µm，其限制因素为光散射和组织不透明性。利用该技术，我们发现氯化氨甲酰胆碱（CCh）——一种在杯状细胞上表达受体的乙酰胆碱类似物14——可强烈诱导黏液快速分泌。值得注意的是，分泌的黏液不仅在上皮表面形成连续层，还在管腔内形成不连续结构， 这些特征在传统组织切片中难以检测。本实验方案为定量分析肠道黏液的三维分布以及比较不同刺激物的黏液诱导能力提供了可靠的平台。
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方案
所有动物实验均经中国台湾长庚大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。长庚大学的动物设施已获得实验动物照护评估与认证协会（AAALAC）的认证。在这些研究中未观察到任何动物健康问题。
1. 固定底物的制备
- 将琼脂糖粉末与ddH2O混合，配制成4%（w/v）浓度的溶液，置于可微波加热的烧瓶中，微波加热2-3分钟，直至沸腾且无细小气泡。
注意：溶液体积取决于样品数量；6 cm培养皿约需10 mL。 - 让琼脂糖溶液冷却至约60 °C，时间约为3分钟。小心地将琼脂糖倒入6 cm培养皿中，直至液面高度达到培养皿的一半（6 cm培养皿约需10 mL）。
- 将带盖的培养皿置于密闭环境中静置20-30分钟，直至琼脂糖完全凝固。
2. 固定材料的制备
- 准备新的铜丝，并将其剪成5 mm长的段。每份组织需要6-8段铜丝。
3. 乙酰胆碱溶液的配制
- 将结晶型 CCh 溶解于无菌 PBS 缓冲液中，配制成终浓度为 10 µM 的溶液（每个肠段环用 200 µL）。
4. 注射用麻醉剂的制备
- 配制麻醉剂储备液时，将2,2,2-三溴乙醇溶解于2-甲基-2-丁醇中。
- 使用无菌生理盐水稀释储备液，使终工作液中含2,2,2-三溴乙醇30 mg/mL和2-甲基-2-丁醇3%（v/v）。
- 充分涡旋约1分钟，直至溶液中无沉淀残留（最大转速：8）。
- 将储备液避光保存于4 ˚C，避免降解；配制后1个月应弃置。
- 麻醉前，将储备液加入无菌PBS中并充分混匀，确保均匀分散，每只小鼠给药剂量为250 mg/kg。
注意：2,2,2-三溴乙醇具有神经毒性，2-甲基-2-丁醇具有挥发性且气味刺激。操作时应使用适当的个人防护装备。废弃物应收集于密闭容器中，并按照所在机构的危险化学品废弃物处理规程进行处置。
5. 通过肠段注射进行肠道接种
- 通过腹腔注射 200 µL 三溴乙醇（2,2,2-tribromoethanol，每只小鼠 250 mg/kg）对 6–8 周龄小鼠进行麻醉，并将小鼠置于加热垫上以维持其体温。通过夹趾反应确认麻醉深度。
- 用酒精对皮肤表面消毒后 ，使用手术剪在小鼠左下腹部做切口，并在麻醉状态下暴露盲肠。
- 识别回肠或近端结肠，将肠段置于无菌纱布上，用动脉夹固定两端，形成一个长度为 3 cm 的闭合肠袢。
- 用无菌 PBS 冲洗纱布上的肠段。
- 在麻醉状态下，向结扎的肠袢内注射不超过 200 µL 的无菌 PBS 或 CCh 试剂。
注意：在整个处理过程中，应定期用生理盐水冲洗暴露的肠段以保持湿润。需持续监测麻醉深度（夹趾反应）及生命体征。
6. 组织收获、固定与染色
- 处理30 min后，通过颈椎脱位法处死 小鼠，并取出肠段。
- 使用镊子夹住肠段，并在无菌PBS中轻轻冲洗。
- 沿纵轴方向轻轻剪开肠段，并用无菌PBS冲洗组织。
- 将组织展平，并用铜丝片段将其固定在6 cm培养皿中的琼脂糖上。
- 在培养皿中加入10 mL 4%多聚甲醛溶液，于4 ˚C固定组织12–24 h。
- 用PBS至少洗涤组织3次，以去除残留的多聚甲醛。
- 将组织浸入10 mL封闭缓冲液（PBS中添加0.4% Triton X-100和3%牛血清白蛋白[BSA]）中，于4 ˚C孵育12–24 h。
- 在封闭缓冲液中加入麦芽凝集素（WGA，1:200）和鬼笔环肽（Phalloidin，1:500），于4 ˚C、120 rpm振荡孵育12–24 h进行染色。
注意：为减少染料消耗，可将组织锚定在3 cm培养皿中已凝固的琼脂糖上，浸入2 mL染色缓冲液中进行染色。
警告：多聚甲醛具有吸入性危害。操作时应使用适当的个人防护装备，例如在通风橱内操作。废弃时，应将废液收集于密封容器中，并按照所在机构的危险化学废物处理规程进行处置。
7. 通过多光子显微镜进行图像采集
- 用 PBS 至少洗涤 3 次以去除残留的染色缓冲液。
- 在 6 cm 培养皿中，将组织用铜丝固定于琼脂糖上，并加入 10 mL PBS。
- 使用配备高数值孔径物镜的多光子显微镜，对肠组织及与其相关的分泌黏液进行成像，获取 100 个光学切片（深度覆盖 99 µm）。将多光子显微镜的激发光源设置为 750 nm 波长，使用 BP500-550 nm 和 BP565-610 nm 带通滤光片收集发射信号。扫描速度设置为 8。
注意：在多光子显微镜中，最大扫描速度为 9，数值越高表示采集速度越快。扫描速度取决于显微镜的性能。当使用用于获取三维图像堆栈的成像平台时，我们推荐将扫描速度设为 8，以在采集时间与图像质量之间取得平衡。
8. 图像分析与黏液定量（图1）
- 为测量每个黏液颗粒（在WGA通道中）的体积，通过将文件拖放到Imaris中来打开图像堆栈 Arena 页面。点击表面 单击图标以启动表面创建工作流程。按照标准步骤对z轴堆栈中的颗粒体积进行分割和定量。具体参数和处理步骤详见 图1.
- 排除小于 1,000 µm 的黏液颗粒3，主要是杯状细胞（图2A，B).
- 汇总每组分泌的黏液总量。
9. 统计分析
- 分析并比较每组的总体积。将黏液体积的数值输入列中，并使用非参数Mann-Whitney检验进行分析。
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结果
本方法中，我们通过多光子显微镜获取的全组织铺片图像堆栈，对肠道黏液的体积进行了定量分析。肠道组织经荧光标记的鬼笔环肽和麦芽凝集素（WGA）染色，分别用于显示细胞内的F-肌动蛋白和黏液15,16。在经PBS处理的回肠和结肠组织中，WGA+黏液主要位于上皮表面的杯状细胞内。给予氯化卡巴胆碱（CCh）后，两种组织的肠腔内均观察到黏液量增加。值得注意的是，分泌出的黏液并未在上皮表面形成连续层，而是零星分布在肠腔内（图3A）。为计算WGA+黏液的总体积，我们使用Imaris软件中的创建表面工具对图像堆栈中所有WGA+结构进行标记，以同时捕捉杯状细胞内的胞内黏液和分泌至肠腔的黏液（图3B）。
我们假设体积大于典型杯状细胞的WGA+结构代表已...
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讨论
本文介绍了一种利用全组织染色、多光子显微镜和Imaris软件分析对肠道黏液进行三维定量的方法。该方法能够观察肠道腔内黏液的不连续分布，并提供黏液体积的绝对测量值。
在离体组织培养系统中，刺激后也观察到黏液分布不连续的现象8。既往利用离体（ex vivo）组织外植体培养的研究中，黏液定量依赖于测量外源性微珠与组织表面之间的距离10,11。然而，该方法无法反映分泌黏液在刺激后呈散在、斑片状分布的特征。我们的方法克服了这一局限性，也可适用于离体组织培养系统，且此类系统的实验时长不受麻醉条件的限制。尽管如此，我们认为两种系统可互为补充。体内结扎肠段模型保留了肠道与其他系统（如神经系统和免疫系统）之间的生理联系，而这些系统已被证实会影响黏液分泌17。
通过将测试试剂注入结扎肠段的管腔内，我们...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢林口长庚纪念医院显微镜核心实验室提供的技术协助。同时感谢国立阳明交通大学影像核心设施提供的蔡司LSM 7 MP多光子显微镜服务，特别是陈佩君女士和吕咏瑜女士提供的技术支持。作者谨此感谢NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3和113-2628-B-182-002-MY3项目对本研究的支持（致YHT）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,2,2-三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 2-甲基-2-丁醇 | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| 6 cm 培养皿 | Alpha Plus | 16021-1 | |
| 琼脂糖 | Hispanagar | A02599 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | BioShop | ALB001 | |
| 卡巴胆碱氯化物 ≥98%（滴定法），结晶状 | SIGMA | SI-C4382-1G | |
| 铜丝（新的） | TOP TECH WIRE & CABLE INDUSTRIAL | IW00125 | 无绝缘层的铜丝 |
| 镊子 | Shineteh | ST-M110 | |
| 无菌纱布 | GMTH | May-40 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | ||
| 加热垫 | CONFORT | SY-666 | |
| IMARIS 10.0.0 | OXFORD INSTRUMENTS | ||
| 多聚甲醛 | BIOVOVAS | BL0415-1000 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | GENESTAR | BL0180-1000 | |
| 鬼笔环肽标记探针 | Invitrogen | A12379 | |
| 剪刀 | Shineteh | 02-1250.18 | |
| 吐温-100（Triton X-100） | Merck | 1.08603.1000 | |
| 麦胚凝集素（WGA）偶联物 | Biotium | 29027 | |
| 配备 W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC III 水浸物镜（数值孔径 NA 1.0）、Spectra-Physics Mai Tai HP 钛宝石飞秒激光器（无 DeepSee 模块）以及 500 nm–550 nm 和 565 nm–610 nm 带通探测器，激光波长为 750 nm 的蔡司 7MP 显微镜 | 用于通过高数值孔径物镜获取三维图像堆栈以进行深层组织成像的成像平台；双光子显微镜的激发光源，设定波长为 750 nm |
参考文献
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