方法文章

使用微流控聚焦流动装置在室温下制备稳定的单分散磷脂包覆微泡

DOI：

10.3791/68796

⸱

2025年10月10日

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

本文内容

摘要

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本文介绍了一种在室温下使用微流控聚焦流动装置制备单分散磷脂包覆微泡的方法，包括如何配制磷脂包覆溶液。

摘要

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单分散微泡在提高超声造影剂用于成像和治疗应用的效能方面已展现出显著潜力。这些微泡可通过微流控流动聚焦法直接制备，该方法可精确控制其尺寸。然而，在制备过程中防止微泡融合仍是关键挑战。尽管提高制备温度（例如 55 °C）可抑制融合，但此类条件会增加微流控装置设计的复杂性，并可能与靶向剂及药物偶联物不相容。本方案描述了一种在室温下制备单分散磷脂包覆微泡的方法，所制得的微泡稳定性与单分散性可至少维持 7 天。该方案还介绍了可重复使用的 PDMS 微流控芯片的制备过程，以及含有表面活性剂 Pluronic F68 的磷脂包覆液的配制方法。我们的研究结果表明，采用此方法制备的微泡在 7 天内能保持其尺寸和稳定性，支持其在未来临床环境中应用，特别是在需要稳定且可控的超声造影剂的场景中。

引言

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超声造影剂（UCA）在临床超声成像和治疗应用中被广泛使用1,2,3。这些微泡通过静脉注射给药后，局限于血管系统内，作为血池显影剂发挥作用4,5。微泡表面包裹着一层稳定的外壳，可降低由拉普拉斯压力驱动的气体扩散，从而延长微泡的寿命3,6。当暴露于超声场时，由于气体核心的可压缩性，微泡开始振荡并产生强烈的回波信号7,8。当超声频率接近微泡的共振频率时，振荡最为显著，而共振频率受微泡尺寸和外壳特性的影响9,10,11。临床上批准使用的UCA通常由多分散性微泡组成，其尺寸分布较宽，直径一般在约0.5–10 µm范围内12,

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方案

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1. 制备脂质膜

注意：用于制备单分散微泡的脂质混合物由 DSPC 和 DPPE-PEG5000 按 90:10 的摩尔比组成。选择 DSPC 作为主要脂质，是因为已有研究表明，它在对抗多分散33,34 和单分散微泡中气体溶解方面均具有更优的稳定性31。这种增强的稳定性被认为源于其相对较高的凝胶-液态晶体相变温度（55 °C）35，该温度高于其他常用脂质（如 DPPC，约 41 °C）35，从而在室温下形成更坚固且不易渗透的脂质壳层36。此处以配制 3 mL 磷脂包衣溶液为例进行说明。为达到 20 mg/mL 的终浓度磷脂溶液（此为制备单分散微泡的典型浓度16,17），共需 60 mg 磷脂。各磷脂组分所需的质量见表 1。

  1. 将磷脂粉末从 -20 °C 冰箱中取出，在室温下解冻 1 小时。
  2. 在不同的 2 mL 容量瓶中称取所需量的脂质粉末。

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结果

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在本实验方案中，我们介绍了一种在室温下利用聚焦流动微流控芯片制备稳定且单分散微泡的方法。聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片通过在母模上浇铸成型制备，如图1所示。将PDMS芯片与玻片键合时采用等离子体处理。等离子体处理至关重要，因为它可使PDMS表面由疏水性转变为亲水性。这种亲水性对于在微泡生成过程中维持气相细丝的形状和位置十分关键，从而实现长时间稳定（持续数小时）地生成尺寸均一的单分散微泡（图5D）。具体而言，在亲水性芯片中，气相细丝通过毛细作用力锚定于气体入口通道的角落，从而在几何结构上保持稳定，维持稳定且对称的气相细丝断裂构型。若PDMS表面失去亲水性，则气相细丝（如图5E中白色箭头所示）不再锚定于气体入口通道的角落（如图5E中橙色箭头所示）。其结果是，气相细丝容易发生位置漂移45，这已知会改变气相细丝的几何形态并破坏断裂动力学45,

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讨论

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本方案详细描述了如何使用微流控聚焦流芯片在室温下制备和储存稳定的单分散微泡。这种单分散微泡可用于增强超声成像对比度18，非侵入式压力传感19以及微泡介导的药物递送22，两者 体外 和 体内.

单分散微泡在制备后的稳定过程此前被报道至少需要90分钟44。此稳定过程中会形成明显的泡沫层，主要归因于奥斯特瓦尔德熟化效应44,47,48。该泡沫层由大量大尺寸气泡组成，部分气泡直径超过100 µm。尽管将高溶解性气体（如CO2）引入气核可能有助于减轻泡沫层的形成48，但该方法与所使用的微流控装置不兼容

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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本工作部分由欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号805308）资助，部分由荷兰科学研究组织（NWO）下属的应用与工程科学TTW（VIDI项目17543）资助，两项资助均授予K.K.。地平线微流控平台的开发获得了英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）基金（项目编号EP/I000623和EP/K023845）的支持。作者感谢利兹大学微泡联盟（http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/）提供的有益讨论，同时感谢Stuart Weston和Andrew Price在仪器概念设计及地平线微流控平台部件制造方面的帮助。用于制备PDMS芯片的主模具由利兹大学慷慨提供。作者感谢来自荷兰伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）生物医学工程系心脏病学部的Robert Beurskens，以及实验医学仪器部的Geert Springeling，在实验过程中提供的技术支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mm 活检穿孔器 Kai Medical143831
1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青（DiD）Thermo Fisher ScientificD307一种亲脂性羰花青染料
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[羰基-甲氧基聚乙二醇]（DPPE-PEG5000）LipoidCAS-No. 384835-61-4
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）LipoidCAS-No. 816-94-4
100 mL 玻璃量筒BLAUBRAND
2 mL 容量玻璃烧瓶BLAUBRAND
250 mL 玻璃锥形瓶BLAUBRAND
30 mL 玻璃小瓶 DWK Life SciencesSCERC40752700D0C2
70% 乙醇
75 °C 加热板 
胶带
铝盖 Sigma-aldrich27016
氩气 Linde Gas Benelux
C4F10 气体F2 Chemicals
氯仿Merck KGaA67-66-3
临床可用的 超声造影剂（即微泡）Bracco,
Plan-LesOuates, 瑞士		SonoVue图 6A。
采集和通气用 19G 针头100 Sterican4657799
Coulter 计数器 Multisizer 3Beckman Coulter颗粒表征仪器
自制超声造影剂（即单分散微泡）NAF1-10PF图 6A。制备方法见：Wang, Y. 等。Pluronic F68 对室温下制备的单分散磷脂包覆微泡尺寸稳定性及声学行为的影响。ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025)。
自制超声造影剂（即单分散微泡）NAF2-10 PF图 6A。制备方法见：Wang, Y. 等。Pluronic F68 对室温下制备的单分散磷脂包覆微泡尺寸稳定性及声学行为的影响。ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025)。
去离子水
外部 LED 光源GSVITECGS02370
冷冻干燥机Mertin Christ GmbHAlpha 1–2 LD plus
函数波形发生器 Agilent33220A
气密玻璃小瓶Sigma-aldrichZ113964-288EA
玻璃载片VWR631-1552
高速相机PhotronNova S16
Horizon 微流控平台英国利兹大学该平台可商业化获取，详细描述见：Abou-Saleh, R. H. 等。Horizon：用于治疗性微泡和纳米泡生产的微流控平台。Review of Scientific Instruments. 92 (7), 074105 (2021)。
MatlabThe MathWorksR2023a
甲醇Merck KGaA67-56-1
Milli-Q 水
PDMS 凝胶SYLGARDSYLGARD® 184
磷酸盐缓冲液（PBS 1x） Gibco10010023
等离子清洗机Henniker ScientificHPT-100
Pluronic F68Thermo Fisher Scientific24040032
橡胶塞SigmaZ166065-100EA
管路MasterflexMFLX06407-41PTFE 材质，内径 1/32" × 外径 1/16 "；25 英尺
镊子
涡旋振荡器 Sigma-aldrichZ654779
水浴超声仪EMAGEMMI 30HC

参考文献

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  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasou....

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PDMS Pluronic F68
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