方法文章

使用微流控聚焦流动装置在室温下制备稳定的单分散磷脂包覆微泡

DOI：

10.3791/68796

⸱

2025年10月10日

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种在室温下使用微流控聚焦流动装置制备单分散磷脂包覆微泡的方法，包括如何配制磷脂包覆溶液。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单分散微泡在提高超声造影剂用于成像和治疗应用的效能方面已展现出显著潜力。这些微泡可通过微流控流动聚焦法直接制备，该方法可精确控制其尺寸。然而，在制备过程中防止微泡融合仍是关键挑战。尽管提高制备温度（例如 55 °C）可抑制融合，但此类条件会增加微流控装置设计的复杂性，并可能与靶向剂及药物偶联物不相容。本方案描述了一种在室温下制备单分散磷脂包覆微泡的方法，所制得的微泡稳定性与单分散性可至少维持 7 天。该方案还介绍了可重复使用的 PDMS 微流控芯片的制备过程，以及含有表面活性剂 Pluronic F68 的磷脂包覆液的配制方法。我们的研究结果表明，采用此方法制备的微泡在 7 天内能保持其尺寸和稳定性，支持其在未来临床环境中应用，特别是在需要稳定且可控的超声造影剂的场景中。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

超声造影剂（UCA）在临床超声成像和治疗应用中被广泛使用1,2,3。这些微泡通过静脉注射给药后，局限于血管系统内，作为血池显影剂发挥作用4,5。微泡表面包裹着一层稳定的外壳，可降低由拉普拉斯压力驱动的气体扩散，从而延长微泡的寿命3,6。当暴露于超声场时，由于气体核心的可压缩性，微泡开始振荡并产生强烈的回波信号7,8。当超声频率接近微泡的共振频率时，振荡最为显著，而共振频率受微泡尺寸和外壳特性的影响9,10,11。临床上批准使用的UCA通常由多分散性微泡组成，其尺寸分布较宽，直径一般在约0.5–10 µm范围内12,13,14。这种较宽的尺寸分布导致这些微泡在较宽频率范围内发生共振。由于临床超声探头通常工作在较窄的频率带宽内，因此仅有一部分UCA群体能够有效共振15。与多分散微泡相比，单分散微泡具有较窄的尺寸分布（例如，PDI 3~10%16,17），已被证明可显著提升诊断和治疗效果。在增强超声成像中，信号强度提高了两个到三个数量级18；通过次谐波信号进行无创压力检测的灵敏度几乎提高了一倍19,20,21；药物递送效率也提升了近一个数量级22。因此，制备具有窄尺寸分布从而具备一致声学响应的单分散微泡，是充分发挥其在超声成像和治疗应用中潜力的关键，特别是在需要精确控制微泡振荡的场景中。

单分散微泡可通过多种方法制备，例如倾析法23、机械过滤24以及对多分散微泡制剂进行离心25。然而，这些技术在实现精确的尺寸控制和高单分散性方面仍具有挑战性26。另一种更为可控的方法是利用微流控聚焦流动装置直接生成单分散微泡。在此过程中，气体流在微流控芯片上被两侧的水相脂质体液流聚焦，导致气体流可重复地断裂，从而实现以目标尺寸高速生成单分散微泡27。尽管聚焦流动法已广泛用于制备单分散液滴28,29，但由于难以防止微泡融合以及在尺寸、单分散性和浓度方面长期稳定性的维持较为困难，该方法在单分散微泡制备中的应用尚不普遍30。融合是指多个微泡合并为更大微泡的现象，会影响微泡的单分散性。已有研究表明，提高生产温度可减少融合现象31，但这会增加微流控系统设计的复杂性，并可能不适用于含有靶向剂或药物偶联物的配方。因此，在室温下制备单分散微泡将更具优势。同样重要的是这些单分散微泡的储存方法，因为磷脂包覆的微泡在储存过程中往往会收缩、破裂并逐渐失去其单分散性32。确保微泡在数天内的长期储存稳定性，对于推动单分散微泡技术向临床应用转化至关重要。

本方案描述了一种在室温下利用流动聚焦式微流控平台制备磷脂包覆的单分散微泡的方法。该方法适用于脂质流速范围为13–42 µL/min的条件，且专为室温操作设计，因此适用于不具备微流控系统温控功能的实验室。本方案采用由1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[羰基-甲氧基聚乙二醇]（DPPE-PEG5000）和泊洛沙姆F68组成的磷脂配方，以确保微泡的稳定性和可重复性。方案中提供了详细的步骤，包括可重复使用的PDMS微流控芯片的制备、磷脂包覆溶液的配制，以及添加表面活性剂泊洛沙姆F68以防止在室温下生产过程中微泡发生聚并。此外，还详细说明了清洗微流控系统以防止喷嘴堵塞、调节气体压力和液体流速以控制微泡尺寸，以及收集和储存所制备微泡以实现长期稳定性的操作流程。该方法为在室温条件下精确控制尺寸、制备稳定的单分散微泡提供了一种实用的技术途径。

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方案

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1. 制备脂质膜

注意：用于制备单分散微泡的脂质混合物由 DSPC 和 DPPE-PEG5000 按 90:10 的摩尔比组成。选择 DSPC 作为主要脂质，是因为已有研究表明，它在对抗多分散33,34 和单分散微泡中气体溶解方面均具有更优的稳定性31。这种增强的稳定性被认为源于其相对较高的凝胶-液态晶体相变温度（55 °C）35，该温度高于其他常用脂质（如 DPPC，约 41 °C）35，从而在室温下形成更坚固且不易渗透的脂质壳层36。此处以配制 3 mL 磷脂包衣溶液为例进行说明。为达到 20 mg/mL 的终浓度磷脂溶液（此为制备单分散微泡的典型浓度16,17），共需 60 mg 磷脂。各磷脂组分所需的质量见表 1。

  1. 将磷脂粉末从 -20 °C 冰箱中取出，在室温下解冻 1 小时。
  2. 在不同的 2 mL 容量瓶中称取所需量的脂质粉末。
  3. 在通风橱中配制 100 mL 体积比为 90:10 的氯仿:甲醇溶剂混合物：使用 100 mL 玻璃量筒量取 90 mL 氯仿，转移至 250 mL 玻璃锥形瓶中；再用同一量筒量取 10 mL 甲醇，倒入已含有氯仿的 250 mL 玻璃锥形瓶中。用玻璃塞封闭锥形瓶，轻轻旋转混匀，直至溶液澄清。
    警告：氯仿和甲醇为有毒化学品。氯仿可能具有致癌性，并可引起呼吸道、皮肤和眼睛刺激。甲醇高度易燃，吸入、摄入或经皮肤吸收均有毒性，摄入后可能导致失明。操作氯仿/甲醇混合物时，务必在通风良好的通风橱中进行，避免吸入蒸气。穿戴适当的个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。处理甲醇时，确保无明火或其他点火源存在。溶剂废液应按照机构的危险废物处理规程进行处置。
  4. 为完全溶解第 1.2 步中称量的脂质粉末，向每个 2 mL 玻璃容量瓶中加入  mL 氯仿/甲醇混合溶剂，并迅速盖上玻璃瓶盖，防止溶剂挥发。
    注意：确保脂质粉末完全溶解。如有需要，可轻轻旋转容量瓶以促进溶解。
  5. 将各溶解后的脂质溶液依次倒入一个 30 mL 玻璃小瓶中，混合均匀。
  6. 在持续通入氩气的条件下蒸发溶剂，同时旋转小瓶，使脂质薄膜在玻璃表面均匀分布。
    注意：仅用氩气可能难以完全去除残留的微量溶剂。将小瓶置于通风橱中静置 2 小时，以进一步干燥。若无氩气，可使用氮气37 或在 6 °C 下操作的真空旋转蒸发仪31,38（即高于 DSPC 相变温度 55 °C35 的条件）来蒸发氯仿/甲醇溶剂。
  7. 溶剂蒸发后，将脂质混合物置于真空环境中，以去除任何残留的有机溶剂。用一层封口膜密封玻璃小瓶，并用针头刺若干小孔，以便在抽真空时允许空气流通。
    注意：使用封口膜的目的是防止在冻干过程中脂质从玻璃小瓶中飞散。
  8. 将小瓶置于真空冷冻干燥机中过夜，以去除任何残留的有机溶剂。
  9. 继续进行下一步操作，或将脂质薄膜在 -20 °C 保存至需要时使用。
    注意：本步骤及本实验方案其他部分均未使用离心步骤。

2. 流动聚焦型微流控芯片的制备

注意：单分散微泡是使用聚焦流微流控芯片制备的，如图1A所示。微流控通道结构的示意图（包括喷嘴和出口尺寸）见补充图S1。用于制备这些模具的基于SU-8的光刻技术的详细制备方案此前已有描述37，并作为本方案的补充信息提供。PDMS芯片的制备过程如下所述。

  1. 按10:1的质量比混合PDMS基质（23. g）和固化剂（2.3 g），得到共25.5 g的PDMS混合物。
  2. 将母模放入培养皿中，并将PDMS混合物倒入其上。
  3. 在真空条件下（2~7 mbar）脱气40分钟，以去除混入的气泡。
    注意：对于较大体积的混合物，可能需要更长的脱气时间以确保完全去除气泡。
  4. 将模具置于75 °C的加热板上加热1小时。
    注意：对于较大体积的混合物，可能需要更长的固化时间。
  5. 让PDMS冷却至室温。使用手术刀沿固化后的PDMS边缘小心切割并剥离，以取出芯片。
  6. 将PDMS芯片裁剪至所需尺寸，并使用1 mm打孔器打出进样口/出样口孔。
  7. 用粘性胶带清洁PDMS芯片表面，以去除灰尘颗粒。
  8. 依次用异丙醇和去离子水清洗PDMS芯片和玻璃载片。
  9. 将PDMS芯片与玻璃载片置于空气等离子体清洗仪中，在60%功率（60 W）下处理1分钟，实现键合。
  10. 将键合后的芯片置于95 °C加热板上加热3分钟，以增强键合强度。
  11. 让PDMS芯片冷却至室温。完全制备好的芯片如图1C所示，喷嘴的显微明场图像如图1D所示。
  12. 将键合后的芯片再次放入等离子体清洗仪中，在80%功率（80 W）下处理5分钟，以恢复微流控通道表面的亲水性。
  13. 立即用Milli-Q水充满芯片，以保持其亲水性。
  14. 将芯片储存在室温下的Milli-Q水中，直至使用。

3. 磷脂包被溶液的制备

  1. 从 -20 °C 冰箱中取出制备好的脂质膜，在室温下解冻 1 小时。
  2. 向脂质膜（60 mg）中加入 3 mL 预热至 55 °C 的磷酸盐缓冲液（PBS），使最终脂质浓度为 20 mg/mL。将样品瓶置于 55 °C 水浴中孵育 40 分钟，每 15 分钟以中等速度（涡旋混合器 5 档中的第 3 档）涡旋一次。
    注意：此步骤旨在超声处理（步骤 3.5）前使脂质组分在 PBS 中初步溶解并均匀分散。该温度为 DSPC 的相变温度39，有助于部分溶解脂质并减少脂质聚集。尽管步骤 3.6 中的超声处理是实现溶液完全透明所必需的，但预先的热孵育可通过减少大尺寸脂质聚集体的形成并提高分散均匀性，从而实现更高效且可重复的超声处理。
  3. 向脂质混合物中加入 0.43 mL Pluronic F68 溶液，使其摩尔浓度达到 10%，即 DSPC : DPPE-PEG5000 : Pluronic F68 = 81 : 9 : 10 mol%。此后，样品应呈现与 图 2A 相似的外观，表现为浑浊溶液。
    注意：Pluronic F68 是一种表面活性剂，用于防止单分散微泡制备过程中的聚并16,40。若无 Pluronic F68，使用本方案所述的 Horizon 微流控装置37及脂质配方无法形成单分散微泡16。本脂质配方中未使用丙二醇，因已有报道指出该化合物会损害所制备单分散微泡悬液的单分散性和稳定性38。
  4. 如需制备荧光标记的单分散微泡，可在该步骤将脂溶性染料（如疏水性羰花青染料）加入混合物中。
  5. 将脂质混合物置于水浴中超声处理 20 分钟，超声功率设为 100%，水温维持在 55 °C。20 分钟后，脂质溶液应呈现与 图 2B 相似的状态，其浑浊程度较步骤 3.4 有所降低。此后每间隔 10 分钟继续超声处理一次，直至溶液完全澄清，如 图 2C 所示。
    注意：对于 图 2C 所示的澄清溶液，共需 30 分钟超声处理时间。可通过动态光散射仪等设备测定脂质体粒径，对脂质溶液进行表征。
  6. 在进行后续操作前，使脂质溶液冷却至室温。

4. 微泡收集瓶的制备

注意：为了确保单分散微泡的长期储存，需要使用密封的医用小瓶作为收集瓶。

  1. 用橡胶塞密封一个5 mL玻璃药瓶，并向瓶内充入C4F10气体。随后，在药瓶口部压接铝盖，以确保气密性。收集瓶现已准备就绪，可供使用。

5. 微流控平台的制备

注意：如图3A所示，该系统包括Horizon微流控平台37（下文简称“微流控平台”）、用于控制的计算机、用于监测生产过程的高速相机、在高速成像期间提供照明的外部发光二极管（LED）光源，以及在生产过程中特定时间点触发高速成像的函数波形发生器。在开始微泡制备之前，必须对设备进行清洗，以降低喷嘴堵塞的可能性。清洗程序包括管路和微流控芯片的清洗。

  1. 管路清洗程序
    1. 打开位于右侧的微流控平台电源开关（图3A）。
      注：此处的"电源开关"指Horizon平台的主电源控制单元，用于启动系统的内部微控制器、泵和传感器。
    2. 将一个装有70%乙醇的4 mL玻璃小瓶放入微流控平台P泵腔的左侧（图3）。以100 µL/min的流速启动液体流动，使液体入口管路被小瓶中的70%乙醇冲洗。5分钟后停止液体流动，结束冲洗。
      注：P泵指集成在微流控系统内的压力控制气体输送单元。此步骤仅用于清洗管路；此时管路不应连接至微流控芯片。该过程可去除流体系统中可溶于乙醇的灰尘和污染物。
    3. 将装有乙醇的小瓶更换为装有Milli-Q水的小瓶。
    4. 以100 µL/min的流速用Milli-Q水冲洗管路5分钟，以清除系统中残留的乙醇。
  2. 芯片清洗程序
    1. 打开微流控平台的内部LED光源开关。
    2. 将PDMS芯片插入芯片支架中。
    3. 将歧管置于芯片上方，并使用可调节旋钮固定。
    4. 使用镊子将气体、液体和出口管路连接至PDMS芯片。连接方式如图3B所示。确保出口管路通向一个小瓶，以收集清洗过程中产生的废液。
    5. 调节平台位置，使芯片喷嘴位于物镜视野范围内。
    6. 使用1000 mbar的气体压力和100 µL/min的液体流速，用Milli-Q水清洗芯片5分钟。先启动气体流动，再启动液体流动。
      注：此步骤用于清洗喷嘴上游的微流控芯片部分。
    7. 先停止液体流动，再停止气体流动。
    8. 按照（图3C）所示重新连接气体和出口管路。
    9. 再次使用Milli-Q水进行清洗，持续5分钟，气体压力为1000 mbar，液体流速为50 µL/min。先启动气体流动，再启动液体流动。
      注：此设置用于清洗喷嘴下游的微流控芯片部分。
    10. 先停止液体流动，再停止气体流动。PDMS芯片现已准备就绪，可用于微泡制备。

6. 高速成像系统的设置

注意：为了监测和控制单分散微泡的生成，建议将高速相机与微流控平台集成，因为微泡的生成速率将高于每秒105个。高速相机可实现对芯片内微泡尺寸和生成速率的测量，同时可监测微泡在芯片内的聚并现象。

  1. 在安装平台上方安装LED光源（图3A），以在高速成像期间照亮微流控芯片。
  2. 将高速相机连接至微流控平台的侧向成像端口。
  3. 使用外部函数波形发生器，在整个微气泡生成过程中以10 s间隔触发高速记录。通过标准BNC电缆将波形发生器的TTL触发输出连接至高速相机的外部触发输入，以确保同步采集。此监控用于评估生成过程中气相细丝的形态以及微气泡尺寸的稳定性。
    注意：连续监控至关重要，因为在生成过程中可能发生堵塞。此外，高速图像序列可用于提取芯片内微气泡尺寸分布的时间分辨数据。该10 s间隔可根据用户需求进行调整。

7. 单分散微泡的制备与表征

  1. 开始生产前，按图示设置收集瓶 图 4A用一个针头穿过橡胶塞作为收集针，另一个针头穿过橡胶塞作为通气针，通气针尖端置于小瓶底部附近。在制备过程中，使用夹具将收集小瓶保持倒置状态。
    注意：通风针可确保收集过程中瓶内压力恒定。由于 C4F10 比空气重，不会自发逸出小瓶。
  2. 将制备好的磷脂溶液加入微流控平台的P泵中。
  3. 将芯片的喷嘴部分移至物镜视野范围内。
    注意：该微流控平台包含一个具有可调变焦和对焦功能的内置光学模块，以及一个用于连接高速相机的外部F型卡口耦合器。
  4. 启动微泡生成时，将气体压力设为800 mbar，液体流速设为40 µL/min。
    注意：该微流控平台集成了两条由流速控制的液体通道（左侧为1-5 µL/min，右侧为1-100 µL/min）和一条由压力控制的气体通道。在本方案中，使用了1-100 µL/min的液体通道和压力控制的气体通道。
  5. 一旦液体到达喷嘴，气流细丝断裂，通过出口释放出单分散微泡（图4A).
  6. 将高速录像设置为帧率 ≥ 200,000 fps，并利用高速录像测量所生成微泡的尺寸 通过 MATLAB 中的 imfindcircles 函数
  7. 调节气体压力和液体流速以控制微泡的大小。
    注意：调节流速和/或气体压力后，使用 MATLAB 脚本根据高速录像绘制芯片上的尺寸分布。将尺寸分布拟合为高斯分布，得到平均值 µ 和标准差 σ 可以推导出。 µ 代表所生成的单分散微泡在芯片上的尺寸。在生成初期，由于管路中残留的Milli-Q水会稀释脂质浓度，可能导致微泡发生聚并。一旦未稀释的脂质溶液到达喷嘴，该问题通常会随之消除。 表 2 在气体压力恒定为800 mbar的条件下，总结了不同液体流速所对应的微泡直径；不同的气体压力与液体流速组合可产生相似的微泡尺寸，但参数组合的差异也会影响微泡的生成速率。在气体流速恒定的情况下，微泡生成速率与液体流速呈正相关。41本方案中的微泡生成速率约为 ~105 每秒微泡数量，基于对高速录像的逐帧分析，该数值与先前报道的类似流动聚焦几何结构下的结果一致37.
  8. 一旦达到所需微泡尺寸，将出口管路连接至收集瓶以收集生成的微泡。
  9. 采集过程中，将高速录像设置为每10秒触发一次，以监测生产过程。
    注意：记录之间的间隔可根据具体需求进行调整。
  10. 收集到足够的微泡悬液后，从收集瓶上取下通气针和收集针。
  11. 停止液体流动，随后停止气体流动。
  12. 将收集的微泡直立存放于室温下，确保小瓶尽量避免机械震荡。
    注意：微泡溶液将呈现三层结构，如图所示 图5A：一层泡沫、一层单分散微泡层和上清液。最好将泡沫层保留在小瓶中，因为先前的研究报道过，与泡沫相关的气泡会逐渐收缩至单分散尺寸。16,38根据本方案制备的微泡尚未经过监管安全评估。然而，所用组分脂质（DSPC、DPPE-PEG5000）和表面活性剂（Pluronic F68）常见于美国食品药品监督管理局（FDA）批准的注射制剂中，被认为具有生物相容性42,43需要进一步的临床前评估以确定其用于医疗的安全性。
  13. 生产后2小时（即单分散微泡制备完成2小时后），使用颗粒表征仪对微泡的最终粒径和浓度进行表征。
    注意：通过流动聚焦法制备的单分散微泡需要约90分钟才能稳定至最终尺寸44因此，建议在使用微泡前至少进行2小时的稳定化处理。
  14. 将19 G针头连接至  毫升注射器，下文简称“提取注射器”。
  15. 将一根独立的19 G针头插入微泡试剂瓶中作为通气针。确保针尖位于瓶内顶部附近，以允许空气进入，并在提取微泡过程中维持瓶内压力。
  16. 轻轻摇动小瓶以混匀悬液。悬液将分为三层：上层为泡沫层，中层含有单分散微泡，下层为水相层。
  17. 迅速插入提取注射器，小心地将针尖置于单分散微泡层的中部，避免接触上层泡沫和下层水相沉淀层。抽取所需体积的微泡悬液后，将提取注射器从小瓶中取出。微泡提取完成后，移除通气针。

8. 清洁与关闭程序

注意：微泡制备完成后，必须对微流控平台和芯片进行彻底清洗，以确保其正常运行并允许芯片重复使用。以下步骤概述了清洗流程。

  1. 对于芯片，请按以下步骤操作：
    1. 将脂质瓶更换为 Milli-Q 水瓶。
    2. 使用 800 mbar 的气体压力和 40 µL/min 的液体流速冲洗微流控芯片 5 分钟。
    3. 先停止液体流动，再停止气体流动。
    4. 仅断开微流控芯片上的气体入口管路。
    5. 用 Milli-Q 水充满微流控芯片，以保持内部表面的亲水性。
    6. 停止液体流动，并断开芯片上所有其余管路。
    7. 将芯片储存于 Milli-Q 水中，直至后续使用。
  2. 对于微流控系统，请按以下步骤操作：
    1. 在微流控平台上，将 Milli-Q 水瓶更换为 70% 乙醇瓶。
    2. 以 100 µL/min 的流速用 70% 乙醇冲洗液体入口管路 5 分钟，以去除任何脂质残留物。
    3. 在 P-Pump1 中，将乙醇瓶更换为 Milli-Q 水瓶。
    4. 以 100 µL/min 的流速用 Milli-Q 水冲洗管路 5 分钟，以清除系统中任何残留的乙醇。此时系统已清洁完毕。
    5. 关闭微流控平台和高速相机系统。

9. 故障排除步骤

  1. 喷嘴堵塞
    注意：由于喷嘴尺寸较小（5 µm），在生产过程中可能发生堵塞。若发生堵塞，请按以下步骤清除。
    1. 立即停止液体流动，随后停止气体流动。
    2. 按照图3B所示装置重新连接管路。
    3. 将P-Pump1中装有磷脂的瓶替换为装有Milli-Q水的瓶。
    4. 施加1000 mbar的气体压力，并将液体流速设为100 µL/min，持续冲洗喷嘴5分钟。
      注意：大多数情况下，经过5分钟冲洗后堵塞即可清除。但如果堵塞仍然存在，则可能需要更换新的PDMS芯片。
    5. 堵塞清除后，按照图3C所示重新连接管路。
    6. 再次使用Milli-Q水冲洗芯片5分钟，气体压力为1000 mbar，液体流速为50 µL/min，以确保彻底清除残留物。
    7. 将P-Pump1中装有Milli-Q水的瓶换回装有磷脂的瓶，并恢复微泡生产。
      注意：如果在生产过程中持续发生堵塞，可能表明管路或微流控芯片清洗不充分。此时应将管路与芯片断开，并按照步骤5中所述的清洗程序进行操作。如果在整个系统彻底清洗后仍频繁发生堵塞，则可能提示微流控平台内部滤膜失效。更换新的滤膜可能解决该问题。
  2. 可根据需要重复使用微流控芯片。
    注意：如果芯片未妥善保存，可能会丧失亲水性。一旦发生这种情况，气相流股的断裂模式可能类似于图5E所示。此时建议更换为具有亲水性的新芯片，以确保微泡生产的稳定性和可靠性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在本实验方案中，我们介绍了一种在室温下利用聚焦流动微流控芯片制备稳定且单分散微泡的方法。聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片通过在母模上浇铸成型制备，如图1所示。将PDMS芯片与玻片键合时采用等离子体处理。等离子体处理至关重要，因为它可使PDMS表面由疏水性转变为亲水性。这种亲水性对于在微泡生成过程中维持气相细丝的形状和位置十分关键，从而实现长时间稳定（持续数小时）地生成尺寸均一的单分散微泡（图5D）。具体而言，在亲水性芯片中，气相细丝通过毛细作用力锚定于气体入口通道的角落，从而在几何结构上保持稳定，维持稳定且对称的气相细丝断裂构型。若PDMS表面失去亲水性，则气相细丝（如图5E中白色箭头所示）不再锚定于气体入口通道的角落（如图5E中橙色箭头所示）。其结果是，气相细丝容易发生位置漂移45，这已知会改变气相细丝的几何形态并破坏断裂动力学45,

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案详细描述了如何使用微流控聚焦流芯片在室温下制备和储存稳定的单分散微泡。这种单分散微泡可用于增强超声成像对比度18，非侵入式压力传感19以及微泡介导的药物递送22，两者 体外 和 体内.

单分散微泡在制备后的稳定过程此前被报道至少需要90分钟44。此稳定过程中会形成明显的泡沫层，主要归因于奥斯特瓦尔德熟化效应44,47,48。该泡沫层由大量大尺寸气泡组成，部分气泡直径超过100 µm。尽管将高溶解性气体（如CO2）引入气核可能有助于减轻泡沫层的形成48，但该方法与所使用的微流控装置不兼容

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分由欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号805308）资助，部分由荷兰科学研究组织（NWO）下属的应用与工程科学TTW（VIDI项目17543）资助，两项资助均授予K.K.。地平线微流控平台的开发获得了英国工程与物理科学研究理事会（EPSRC）基金（项目编号EP/I000623和EP/K023845）的支持。作者感谢利兹大学微泡联盟（http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/）提供的有益讨论，同时感谢Stuart Weston和Andrew Price在仪器概念设计及地平线微流控平台部件制造方面的帮助。用于制备PDMS芯片的主模具由利兹大学慷慨提供。作者感谢来自荷兰伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）生物医学工程系心脏病学部的Robert Beurskens，以及实验医学仪器部的Geert Springeling，在实验过程中提供的技术支持。 

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mm 活检穿孔器 Kai Medical143831
1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青（DiD）Thermo Fisher ScientificD307一种亲脂性羰花青染料
1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[羰基-甲氧基聚乙二醇]（DPPE-PEG5000）LipoidCAS-No. 384835-61-4
1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）LipoidCAS-No. 816-94-4
100 mL 玻璃量筒BLAUBRAND
2 mL 容量玻璃烧瓶BLAUBRAND
250 mL 玻璃锥形瓶BLAUBRAND
30 mL 玻璃小瓶 DWK Life SciencesSCERC40752700D0C2
70% 乙醇
75 °C 加热板 
胶带
铝盖 Sigma-aldrich27016
氩气 Linde Gas Benelux
C4F10 气体F2 Chemicals
氯仿Merck KGaA67-66-3
临床可用的 超声造影剂（即微泡）Bracco,
Plan-LesOuates, 瑞士		SonoVue图 6A。
采集和通气用 19G 针头100 Sterican4657799
Coulter 计数器 Multisizer 3Beckman Coulter颗粒表征仪器
自制超声造影剂（即单分散微泡）NAF1-10PF图 6A。制备方法见：Wang, Y. 等。Pluronic F68 对室温下制备的单分散磷脂包覆微泡尺寸稳定性及声学行为的影响。ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025)。
自制超声造影剂（即单分散微泡）NAF2-10 PF图 6A。制备方法见：Wang, Y. 等。Pluronic F68 对室温下制备的单分散磷脂包覆微泡尺寸稳定性及声学行为的影响。ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025)。
去离子水
外部 LED 光源GSVITECGS02370
冷冻干燥机Mertin Christ GmbHAlpha 1–2 LD plus
函数波形发生器 Agilent33220A
气密玻璃小瓶Sigma-aldrichZ113964-288EA
玻璃载片VWR631-1552
高速相机PhotronNova S16
Horizon 微流控平台英国利兹大学该平台可商业化获取，详细描述见：Abou-Saleh, R. H. 等。Horizon：用于治疗性微泡和纳米泡生产的微流控平台。Review of Scientific Instruments. 92 (7), 074105 (2021)。
MatlabThe MathWorksR2023a
甲醇Merck KGaA67-56-1
Milli-Q 水
PDMS 凝胶SYLGARDSYLGARD® 184
磷酸盐缓冲液（PBS 1x） Gibco10010023
等离子清洗机Henniker ScientificHPT-100
Pluronic F68Thermo Fisher Scientific24040032
橡胶塞SigmaZ166065-100EA
管路MasterflexMFLX06407-41PTFE 材质，内径 1/32" × 外径 1/16 "；25 英尺
镊子
涡旋振荡器 Sigma-aldrichZ654779
水浴超声仪EMAGEMMI 30HC

参考文献

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