需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型

1.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/68797

⸱

2025年10月17日

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

本文内容

摘要

该方案旨在描述一种基于诱导化疗反应动力学的小鼠急性淋巴细胞白血病复发模型。

摘要

急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于未成熟淋巴样前体细胞的肿瘤，也是最常见的儿童恶性肿瘤之一。尽管儿童ALL的治愈率接近90%，但复发和药物耐药仍是临床面临的挑战。在此背景下，体内研究癌症生物学至关重要，而利用小鼠模型建立的患者来源异种移植瘤（PDX）被广泛用于此类研究。然而，来自复发样本的PDX——或与诊断期样本相比——并不能完全揭示白血病复发启动与进展的潜在机制。本实验方案通过在小鼠体内建立B-ALL PDX的复发模型，可在白血病细胞获得药物耐药性的整个过程中动态收集白血病细胞。将B-ALL PDX细胞移植至小鼠后，采用四种常用于ALL治疗的药物联合方案进行处理，这些药物分别代表不同的作用机制：地塞米松、长春新碱、L-门冬酰胺酶和柔红霉素。经过为期4周的缓解诱导阶段后，动物进入休止期并持续监测是否出现复发。治疗与复发的循环过程重复进行，直至复发时间逐渐缩短，以此作为体内药物耐药性增强的替代指标。为探究复发和耐药的潜在机制，在每次治疗周期前后均采集白血病细胞，用于表型和遗传学分析。为验证该模型的有效性，测试了多种儿童ALL样本，包括对治疗反应良好和不良的病例，其分类依据为糖皮质激素治疗7天后外周血中原始细胞的存在情况，以及在第15、33和78/96天检测的微小残留病（MRD）水平。小鼠模型中观察到的结果与患者临床数据一致，证实该模型能够准确模拟患者对化疗的临床反应。该方法可实现对B-ALL复发及药物耐药的动态研究，有助于深入的机制探索以及新型治疗策略的开发。

引言

急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童中最常见的癌症。尽管近几十年来在高收入国家通过治疗已实现较高的治愈率，5年总生存率可达90%1，且在探索新治疗策略方面也投入了大量努力，但在发达国家仍有15%–20%的患者会复发，其生存率根据首次复发时间的早晚（诊断后18个月内为早期，36个月后为晚期）在30%–60%之间波动2,3。鉴于此，难治性及复发性ALL仍是亟待解决的临床难题。在诊断上，难治性ALL与复发性ALL的区别在于其对化疗药物敏感性差，而复发性ALL则指疾病在经历一段缓解期后再次出现。与其他癌症类似，ALL的特征是存在多种遗传学异常，包括非整倍体、染色体重排以及多种基因突变，这些异常与不同的治疗反应和复发风险相关4。由于ALL复发更常见于高危患者（这些患者已接受最大强度的化疗），进一步调整药物剂量或组合很可能不足以改善预后。因此，研究重点应转向揭示药物耐药和疾病复发的潜在机制。

鉴于此，研究人员试图了解化疗施加的选择压力如何促进耐药细胞的出现。现有大多数文献将复发归因于在诊断时已存在的耐药性恶性亚克隆的扩增5。然而，最近一项研究提示可能存在其他机制，例如调控转录程序的表观遗传学修饰，也可能导致复发6。

已投入大量努力以构建精确的 体内 用于研究急性淋巴细胞白血病（ALL）复发的模型。免疫缺陷小鼠已成功用于ALL的移植，能够保留原始疾病的特征7,8，从而建立患者来源的异种移植模型（PDXs）。该模型可实现原始肿瘤/白血病细胞在相容性微环境中的移植与增殖。其主要优势之一在于能够评估移植的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞对化疗的反应9.

PDX 模型还被用于模拟和研究急性淋巴细胞白血病（ALL）的复发。例如，Samuels 等人建立的一项方案10采用移植了患者白血病细胞的非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，以研究对类似诱导化疗方案的耐药机制。作者描述了使用长春新碱、地塞米松、L-门冬酰胺酶和柔红霉素（VXLD）进行治疗的过程，并提供了治疗周期次数及复发时间点的示例。然而，该模型主要关注治疗后立即分析存活下来的细胞——即在初始治疗后仍存活的细胞——这更可能代表微小残留病（MRD），而非真正的复发。

一项较近的研究评估了在急性淋巴细胞白血病（ALL）移植的NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NOD scid gamma，或NSG）免疫缺陷小鼠中进行短期治疗是否能够预测相应患者的复发情况11。将来自复发和非复发患者的中危型ALL样本移植到小鼠体内，并采用类似诱导治疗方案（包含长春新碱、地塞米松和左旋门冬酰胺酶，即VXL方案）进行治疗。研究人员测量并比较了肿瘤细胞植入时间和治疗后的复发情况。结果表明，该PDX模型可作为预测患者预后的工具。这一发现支持了PDX小鼠模型在研究ALL复发生物学机制中的应用价值。例如，可在不同时间点检测复发细胞，以揭示潜在的复发机制。

本文中，我们介绍了对用于研究B-ALL复发的PDX小鼠模型的改进。我们的目标是研究诱导化疗作用后疾病复发以及复发细胞的特征。我们采用NSG小鼠品系，建立了一种包含四种药物的、类似诱导治疗的标准化方案——长春新碱、地塞米松、L-门冬酰胺酶和柔红霉素。该品系由于Prkdcscid突变以及对基因毒性应激的敏感性增加，耐受反复化疗周期的能力有限12。因此，动物体重被监测作为治疗毒性的指标。B-ALL复发模型可分为三个主要步骤：（1）将ALL细胞移植到小鼠体内，目标是外周血中人源CD45⁺细胞的植入率达到0.2-1%；（2）进行4周的化疗处理，随后进入静息期，直至首次复发（R1）发生；（3）在检测到R1后，重复进行为期1周的诱导样治疗周期。后续可能相继出现多次复发（R2、R3……RN），并记录每次治疗与复发之间的间隔时间（Δt）。Δt的进行性缩短被解释为获得性耐药的迹象。作为对复发机制更深入研究的一部分，可在实验方案的不同阶段前后收集B-ALL细胞。需要特别强调的是，由于复发发生与细胞回收之间的时间间隔不同，该现象的内在机制可能无法保持不变。鉴于此，在确认复发后必须迅速收集复发细胞。所收集的细胞可用于后续的表型和遗传学分析，包括细胞周期动态、细胞迁移、白血病起始细胞频率、染色体改变以及表观遗传修饰等多种评估。

本文旨在重点描述复发小鼠模型。我们将详细介绍三个实验阶段：移植、治疗至首次复发（R1），以及循环治疗至多次复发（R2、R3……）。我们希望该模型能够帮助研究人员从不同亚型中获得耐受化疗的B-ALL细胞，从而更深入地研究与复发相关的细胞和分子变化。最终，这可能有助于更好地理解耐药机制，并推动更有效、个体化治疗策略的开发。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均按照博尔德里尼儿童中心动物使用伦理委员会（CEUA/Boldrini 0047-2024）的规定和伦理准则进行。本研究中使用的白血病样本来自在博尔德里尼儿童中心接受治疗的患者的生物样本库冻存管，患者通过签署知情同意书同意其细胞用于研究。该项目已获得机构伦理委员会批准（CAAE 34601120.7.0000.5376）。

1. 白血病细胞移植与植入监测

  1. 小鼠移植用白血病样本的制备
    1. 解冻先前自患者骨髓穿刺液中获取并冻存的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞样本。使用设定为37°C的水浴锅，通过在水中做圆周运动移动冻存管来解冻样本。
    2. 将解冻后的样本转移至15 mL离心管中。向样本中加入14 mL 1×无菌PBS，以洗涤细胞并去除冷冻保存液。在300 × g条件下离心该离心管 g 5 分钟后去除上清液。
  2. 移植液的制备
    1. 将解冻的细胞重悬于无菌的1×PBS中。每5-10 × 10⁶个细胞使用1 mL PBS。6 每只待移植动物使用100 µL PBS重悬活细胞。移植前将移植液置于冰上保存。
      注意：细胞计数采用半自动方法进行13.
  3. 小鼠移植
    1. 选择2月龄的雄性或雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl用于白血病移植的/SzJ（NSG）小鼠
      注意：为了维持同质的实验设计并避免动物性别的干扰，所有急性淋巴细胞白血病（ALL）样本均被移植到两种性别的小鼠体内，以确保在两种性别中均等代表应答良好和应答较差的白血病类型。结果发现，雌性小鼠的移植发生时间早于雄性小鼠。鉴于此，为避免小鼠性别可能对未来分析（如移植动力学）造成干扰，建议在处理同一种白血病样本时仅使用单一性别的小鼠。未采用其他参数来优先选择某一性别。
    2. 每次将一只小鼠放入经过认证且安全的小鼠捕获器中，以确保动物被妥善固定。确保小鼠尾巴位于捕获器外，便于进行移植操作。
      注意：白血病细胞通过静脉内（i.v.）注射移植到小鼠体内。已有成熟方案采用尾部侧静脉进行此操作。11.
    3. 使用红外光确保静脉充分扩张。使用无菌、锋利的一次性注射针头注入100 µL移植液。将移植后的小鼠饲养于特定病原体阴性设施中，静置休息15天。
      1. 使用红外光时，将已固定的动物置于笼外，距离光源30 cm。根据光源的功率调整照射时间。使用中等功率光源时，照射5分钟足以确保静脉扩张。若尾部暴露时间过长，可能导致动物灼伤和应激反应。
      2. 注射时使用带针头的胰岛素注射器，容量为1 mL，针头规格为12.7 mm × 0.33 mm。所用针头的规格可在 材料表. 将小鼠维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下。此外，将本研究中使用的小鼠饲养在可高压灭菌的半透明琥珀色聚碳酸酯笼具中，并提供环境丰富化材料以供筑巢。
  4. 外周血采集
    1. 在接种后2周及此后每周，从每只小鼠采集50 µL外周血样本。
    2. 用左手手动固定动物，确保其头部被牢固地固定。用右手持无菌、锋利的一次性采血针，穿刺动物下颌丛的面静脉。
      注意：该操作对小鼠可能具有危害性，必须谨慎进行。
      1. 确保动物在固定期间能够顺畅呼吸，密切观察其呼吸频率的变化（如呼吸急促）以及口腔颜色的变化（不应变为紫色或深蓝色）。如果下颌下丛未被正确穿刺，可能因耳道穿刺而导致耳朵出血。为指导后续实验操作者， 补充图1 可提供以确保神经丛的准确定位。
        注意：作为替代方法，也可通过尾静脉采血来收集血液样本。
    3. 采集后不得使动物无人看管。动物必须保持活跃且无损伤。若小鼠出现下垂（头部或身体）及活动减少的迹象，应实施安乐死。采血量不得超过50 µL，因血量过多可能导致动物死亡。
    4. 将采集的血液样本置于含有8 µL 50 mM EDTA的1.5 mL离心管中，以防止样本凝固。
      注意：此处我们使用了预先配制的EDTA溶液作为抗凝剂。如有需要，也可在此步骤使用市售的低容量EDTA采血管进行血液采集。血液样本必须在当天完成处理。
  5. 外周血样本处理前的制备
    1. 用EDTA抗凝全血并混匀。取50 µL混合液转移至流式细胞管中。
    2. 配制抗体混合液，每份样品中加入抗小鼠CD45抗体（mCD45）、抗人CD45抗体（hCD45）、抗人CD19抗体（hCD19）以及无菌1×PBS作为稀释液。
  6. 血液样本处理
    1. 向每份血样中加入10 µL抗体混合液，用食指轻轻敲击混匀。室温避光孵育30分钟。
      注意：选择上述描述的合适抗体时，需考虑流式细胞仪可用的检测通道。为确定每份样本所用抗体的用量，建议针对每种抗体进行滴定曲线实验。本研究中所使用的抗体、荧光染料及样本选用的体积列于下表： 补充表1完整的抗体目录编号和克隆名称列表见于 材料表.
    2. 向每个样品中加入1 mL商用1×红细胞（RBC）裂解液。用食指剧烈振荡混匀。室温避光孵育15分钟。
      ​注意：本步骤中使用的裂解液为市售的10倍浓缩红细胞裂解液（10x RBC Lysis Solution）。若使用其他试剂，需调整至相应的1倍工作浓度用于裂解。
    3. 向每个样本中加入 2 mL 无菌 1x PBS，进行第一次洗涤步骤。以 200 x g 离心样本 g （在摆动转子中）室温下离心5分钟。轻轻倒置以弃去上清液，并用纸巾轻拍管口顶部，吸干残留液体。
      注意：在洗涤步骤中，白血病细胞将沉淀在流式管底部，弃去上清液。处理样本时务必小心，因为在某些情况下沉淀可能不可见。为确保沉淀完整，避免摇动样本，以免造成沉淀丢失。
    4. 重复步骤1.6.3。用食指轻弹流式管，以200 µL无菌1x PBS重悬白血病细胞。样本现可进行流式细胞术分析。移植监测必须在血液采集当天进行。
  7. 通过流式细胞术监测移植情况
    1. 采用标准的流式细胞术方法9,14 用于确定外周血中人源CD45+细胞占小鼠CD45+细胞的百分比（% hCD45+）。
    2. 使用流式细胞术分析软件，收集流式细胞术生成的数据，用于后续分析hCD45+细胞占总CD45细胞（hCD45+与mCD45+）的百分比。
      注意：为确保准确监测移植情况，以下分析步骤应在同一天内完成。当考虑未来治疗方案的起始时间时，此每日操作顺序尤为重要，我们建议从周一开始。若无法在周一开始，可根据外周血中hCD45+%（0.2%–1%）的达到情况，在一周中的任意一天开始治疗。
  8. 流式细胞术数据分析的环境准备
    1. 启动流式细胞术分析软件。导入采集的数据，并等待软件识别。
    2. 打开初始样本数据，创建名为“Lymphocytes”的门。验证坐标轴设置：选择 FSC-A X轴 SSC-A 用于Y轴。在上方门控创建面板中，选择多边形工具并圈出主要细胞群。
      注意：淋巴细胞通常在X轴50,000-100,000和Y轴0-50,000范围内出现。具体数值可能因不同类型白血病的特征而有所差异。
    3. 双击 门控群体 创建一个新的门控。为排除细胞双联体，将FSC-A设为X轴，FSC-H设为Y轴。使用多边形工具圈选单个细胞群体，紧贴该细胞群绘制门控，排除沿X轴方向距离较远的事件。
      注意：此步骤用于区分单个细胞事件。
  9. 创建细胞流式分析面板以区分细胞群体
    1. 双击 选定群体 以区分人源与鼠源CD45细胞。将X轴设为mCD45荧光信号，Y轴设为SSC-A。使用形状工具，在mCD45阴性群体周围绘制一个方框。
    2. 双击 获得的细胞群体 以区分hCD19+和/或hCD45+细胞。将X轴设为hCD19荧光标记，Y轴设为hCD45。在设门创建面板中，选择 垂直线 以分离不同的细胞群。
      注意：作为替代方案，研究者可以使用门控或方法来区分hCD45和mCD45细胞。该方法将事件总数视为100%，从而为鉴定细胞群体提供更精确的策略。
  10. 将统计学方法应用于所构建的图谱
    1. 计算每种分离的细胞群占所有获取事件的百分比。在主软件窗口中，右键单击 子图 从每个样本的主图中提取图标并选择 创建统计信息在打开的窗口中，单击 频率 并选择 单细胞对每个子图分别执行此步骤。
    2. 选择所有已做的修改，以将设门策略及相关统计数据应用于所有样本。然后，使用鼠标左键将选定的修改拖动至主软件窗口中的“所有样本”选项。
    3. 点击 表格编辑器 在主窗口中生成包含所有计算频率的表格。在弹出窗口中，选择 .xls 文件格式，指定目标文件夹，然后单击 创建表格.
      注意：使用流式细胞术分析软件执行的所有步骤均可在 补充图2此步骤生成的最终表格包含用于绘制随时间分析嵌合进展曲线所需的hCD45+百分比。
  11. 移植进展的绘图分析
    1. 启动图形绘制与分析软件。选择 XY表格格式 在主窗口中，选择 输入或导入数据到新表中将 X 设为数字，Y 设为在并列的子列中输入重复值。
    2. 在打开的表格中，整理列标题：将 X 列的标题设为“移植天数”，将第一组 Y 子列的标题设为“外周血中 hCD45+ 百分比”。在 X 列中填入注射后对应外周血采集时间的天数，用于移植监测。在 Y 子列中手动输入每只小鼠每周采集的 hCD45+ 百分比数据。
    3. 在软件菜单的“家族子集”下，选择 数据 1在弹出窗口中，选择名为第二个图形选项 点 & 带误差线的连接线，并支持绘制均值和误差线。
    4. 调整图形坐标轴至所需范围。点击 导出 在菜单右上角下载最终图表。
      注意：在针对任意一份急性淋巴细胞白血病（ALL）样本的实验过程中所收集的所有数据，必须绘制在同一张图表上，以便于分析自实验开始以来随时间变化的趋势。图表绘制的示例可参见 补充图3.

2. 小鼠处理

  1. 药物工作溶液的配制
    1. 配制浓度为1 mg/mL的长春新碱工作液。配制浓度为4 mg/mL的地塞米松工作液。配制浓度为2,000 IU/mL的门冬酰胺酶工作液。配制浓度为2 mg/mL的柔红霉素工作液。
      注意：本方案中使用的药物与临床治疗患者所用的药物相同15地塞米松工作液的溶剂由肌酐、二水合柠檬酸钠、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和注射用水组成。长春新碱工作液的溶剂由甘露醇、硫酸、氢氧化钠和注射用水组成。左旋门冬酰胺酶和柔红霉素通常以冻干粉形式提供。在此类情况下，推荐使用无菌注射用水进行重悬，以达到正确的药物浓度。为防止因反复冻融导致药物活性丧失，药物必须分装成工作 aliquot，使用次数不得超过3次。
  2. 检测到白血病时的动物体重
    1. 当小鼠外周血中hCD45+细胞百分比达到0.2%至1%的中位范围时，开始治疗。达到该范围后，将移植小鼠分为两个不同组别：一组接受治疗，另一组作为对照。
    2. 达到既定阈值后，继续每周监测白血病进展。持续收集hCD45%数据，以监测治疗反应、复发情况及药物耐药性的出现。
    3. 称重待处理的动物。使用体重的算术平均值确定每只动物给药剂量。称重对照组动物，以比较各组之间的体重增加/减少情况。
      1. 使用以下药物剂量：长春新碱，0.15 mg/kg；地塞米松，5 mg/kg；L-门冬酰胺酶，1,000 IU/kg；柔红霉素，1.2 mg/kg。每周至少称重动物3次：分别在周一、周三和周五。根据体重调整药物治疗剂量，并监测治疗毒性的程度。
  3. 从工作溶液分装液配制给药溶液
    注意：药物给药溶液由无菌1×PBS作为稀释剂，以及根据动物体重确定的正确体积的工作浓度药物溶液组成，每周每天给药一次（无菌水仅用于药物的重悬，不可用于注射）。腹腔内给药的药物可混合于同一溶液中；然而，若任一药物需静脉给药，则应将其置于单独的溶液中。每只动物的给药体积为100 µL。
    ​注意：上述步骤中使用了一次性无菌胰岛素注射器（带针头，1 mL，针头尺寸为12.7 mm × 0.33 mm）。该注射器的完整说明见于 材料表.
    1. 周一，配制含有地塞米松、长春新碱和PBS的药物给药溶液，腹腔注射给药。
    2. 在周二和周四，配制含有地塞米松、L-天冬酰胺酶和PBS的药物给药溶液，通过腹腔注射给药。
    3. 周三，配制含有地塞米松和PBS的给药溶液，并进行腹腔注射。另配制含有柔红霉素和PBS的第二种给药溶液，通过静脉注射给药。
    4. 周五制备由地塞米松和PBS组成的给药溶液，通过腹腔注射给药。
    5. 让动物在周末休息。重复治疗周期，持续4周。
      注意：完整治疗方案见于 补充表 2需要明确的是，尽管已有其他小鼠处理方案被测试，但这些方案对NSG品系小鼠表现出较高的毒性。因此，本方案中提出的处理程序首先经过标准化优化以降低毒性，最终确定了本方案所列的给药剂量和给药频率。预期经处理组中hCD45+细胞的比例相较于对照组会因治疗干预而下降。
  4. 药物给药及白血病治疗反应监测
    1. 用左手手动固定动物，以便进行腹腔给药。保持动物腹部朝上。在腹部区域，定位右下象限。
    2. 用右手持无菌、锋利的一次性注射针头，将100 µL给药溶液注入小鼠右下腹区域。
      注意：固定动物时需小心谨慎，操作不得对小鼠造成伤害。与采血过程相同，需注意是否存在任何呼吸系统并发症。进行腹腔注射时，务必垂直持针，以避免刺伤内脏器官。
    3. 按照移植白血病细胞的相同操作步骤进行药物的静脉注射。在给予治疗4周后，让小鼠休息，直至ALL细胞再次出现，此处称为首次复发（R1）。
      注意：尽管给药途径不同，静脉注射所用体积与腹腔注射相同。若任何动物出现白血病负荷导致的痛苦迹象，例如表现出疼痛的面部表情、食欲减退、突然体重下降或活动能力降低，可实施人道的早期终点。安乐死应遵循后文步骤 4.4.1 至 4.4.2 中所述的安乐死程序。
  5. 白血病治疗反应的监测及首次复发（R1）的检测
    1. 在治疗或休止阶段，不得中断每周对白血病的流式细胞术监测。
      注意：考虑到每周五天的治疗方案，强烈建议在每周开始时进行监测。在本研究中，血液采集、样本处理和分析均在每周一进行。
    2. 按照步骤 1.4 - 1.11 执行血液采集及监测所需的任何后续操作。
      注意：经过指定的静息期后，可通过小鼠外周血中hCD45+细胞比例的突然升高来检测R1细胞。治疗结束至复发出现之间的时间具有变异性，不同白血病模型的复发时间可能各不相同。一旦检测到R1，应启动所提出的小鼠复发模型的第三阶段，即最终阶段。为提高监测和反应分析的准确性，建议采用客观的疗效评估指标，如疾病进展、疾病稳定、反应水平（部分缓解、完全缓解或持续缓解）、缓解及耐药性，具体参照Randall等（2024）所述指南。16.

3. 持续进行多轮处理直至耐药细胞出现

  1. 首次复发的检测
    1. 对任何出现白血病复发（称为R1）的小鼠，即外周血中人源CD45+细胞比例达到0.2%阈值时，给予为期一周的诱导样治疗。在1周内，从周一至周五，遵循4周诱导样治疗所用的药物给药方案。
      注意：此处仅给予1周的治疗旨在进行测试 体内 无论白血病细胞在化疗压力下是否随着时间推移获得对化疗的耐药性，最终导致白血病进展并连续复发。我们选择不实施第二个为期4周的给药方案，以避免过高的毒性及动物丢失。
    2. 在完成为期一周的药物给药后，让小鼠休息。继续通过流式细胞术按照步骤1.4–1.11每周监测白血病反应。
      注意：此时白血病细胞应仍对治疗有反应。因此，在监测白血病时，小鼠体内hCD45+细胞的比例应下降，并在一定时间内保持阴性。
  2. 监测 R2 的出现
    1. 等待复发R2出现（hCD45+细胞 ≥ 0.2%）。当R2出现时，记录从治疗结束至R2出现之间经过的时间，将该时间段记为Δt1。
    2. 进入诱导型治疗的第二个完整周。遵循与该治疗方案首次给药相同的指导原则。
    3. 治疗结束后让小鼠休息。继续进行白血病监测。
  3. 监测 R3 的出现
    1. 等待复发 R3 出现。以与步骤 3.2.1 相同的方式计时。将其记为 Δt2。
    2. 比较 Δt1 与 Δt2。若 Δt 间隔保持不变，重复上述步骤 N 次，以获得多次白血病复发（R1、R2……RN）。一旦 Δt 间隔缩短，即停止治疗周期。
      注意：Δt 缩短至复发表明白血病细胞获得了耐药性。该结果进一步证明了复发小鼠模型能够产生耐药性急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞。
    3. 按照下文步骤4所述回收白血病细胞。通过冷冻保存或任何与后续预期分析相容的保存方法，将细胞保持活性储存。
      注意：根据近期文献报道，白血病细胞回收的最佳时机为外周血中hCD45+细胞比例达到25%以内16.

4. 通过器官采集回收白血病细胞

  1. 使用过量化学麻醉剂对小鼠实施安乐死
    1. 通过注射过量化学麻醉剂使小鼠安乐死，随后进行颈椎脱位以确认死亡，具体操作如下所述。
    2. 配制含有三种麻醉剂的混合液，用无菌1×PBS稀释以实现深度麻醉。每只待处死的小鼠使用150 µL商品化马来酸乙酰丙嗪、50 µL商品化赛拉嗪、80 µL商品化氯胺酮和220 µL PBS混合。
    3. 通过腹腔注射给予500 µL上述配制的混合液。注射时遵循与步骤2.4中相同的固定和注射规范。
    4. 在过量化学麻醉剂作用下，小鼠将侧卧于笼底。数分钟后观察小鼠是否出现呼吸停止。若已停止，需等待呼吸努力完全消失。为验证安乐死是否有效，可通过按压动物后肢之一来检查是否存在非自主反射。确认无反应后，进行颈椎脱位以最终确认安乐死完成。
  2. 颈椎脱位
    1. 将动物尾部朝上固定于笼具喂食格栅处。用左手拇指和食指呈镊子状，将此“镊形”手指置于动物头部正下方，用力按压脊柱颈椎部位。
    2. 用右手握住动物尾巴，以稳定而有力的动作向后拉拽，直至动物头部与身体完全分离。
      注：颈椎脱位是公认的确认安乐死的有效方法之一17,18,19。其他替代方法包括在呼吸停止后继续暴露于CO2环境中至少15分钟。
  3. 器官采集前的动物准备
    1. 用70%酒精擦拭小鼠全身进行消毒。将动物仰卧置于啮齿类手术平台之上，剃除腹部区域的毛发。
      注：有关啮齿类动物手术平台的完整描述，请参见材料表。
  4. 脾脏采集
    1. 使用无菌手术剪和镊子在腹部皮肤上做一小切口，剥离皮肤以暴露腹膜。
    2. 在腹膜上做一小切口，并继续剪开直至完全暴露腹腔内器官。
    3. 定位脾脏，其位于动物胃部正下方。取出脾脏并置于含有无菌1×PBS的容器中，以备后续处理。
  5. 股骨采集
    1. 打开腹膜腔以暴露动物后肢。
    2. 定位股骨，通过切断其与骨盆、胫骨及腓骨连接的关节将其完整取出。对两侧股骨均执行此操作。
    3. 清除残留的肌肉、皮肤或其他组织，将股骨置于含有无菌1×PBS的容器中以备后续处理。根据动物伦理委员会的指导原则妥善处理动物尸体。
      注：根据研究目的，也可从肝脏、中枢神经系统、胸腺、淋巴结等部位收集所有白血病细胞（ALL细胞）。本文中以脾脏和骨髓为例进行描述。
  6. 器官处理前准备
    1. 准备一个50 mL无菌离心管、两个1 mL无菌注射器、一根无菌25 mm × 0.6 mm皮下注射针头以及两个无菌70 µm细胞筛。
  7. 脾脏处理
    1. 将一个细胞筛置于打开的50 mL离心管口上，将脾脏放置于细胞筛表面。用注射器活塞的平坦部分碾磨器官，直至无明显大块组织残留。
    2. 向碾磨后的脾脏中加入无菌1×PBS，用注射器活塞的平坦部分做环形运动，确保细胞充分滤过。
      注：PBS可逐步加入，但最终总体积不得超过6 mL。脾脏处理完成后，细胞筛应清晰无残留组织。若细胞筛发生堵塞，可更换新的细胞筛，将原筛中内容物转移至新筛后继续处理。为评估该器官内的肿瘤负荷，可保留部分脾脏组织用于组织病理学分析。
  8. 骨髓处理
    1. 将一个新的细胞筛用于骨髓处理，并置于已使用的离心管上。剪除股骨两端，使骨髓腔暴露。将皮下注射针头插入一支新的注射器中，并向注射器内加入1 mL无菌1×PBS。
      注：根据研究目的，若需分别收集脾脏和骨髓中的ALL细胞，则应使用不同的离心管分别处理各组织。此外，可保留部分股骨用于组织病理学评估，以分析该器官内的肿瘤负荷。
    2. 在细胞筛上进行骨髓冲洗操作。将针头插入股骨一端的骨髓腔开口，以稳定且持续的动作推动注射器活塞。对另一侧股骨重复相同操作。
    3. 取下针头，使用注射器活塞的平坦部分碾磨已冲洗出的骨髓。向碾磨后的骨髓中加入无菌1×PBS，并用注射器活塞做环形运动以确保细胞充分滤过。处理完成后，50 mL离心管中总液体体积应为10 mL，包含悬浮于PBS中的脾脏与骨髓细胞混合物。
      注：PBS的添加可分步进行，但必须确保最终加入体积不超过2 mL。

5. 通过梯度离心法分离白血病细胞

  1. 白血病细胞分离的准备工作
    1. 准备一个15 mL离心管、无菌一次性巴斯德吸管、已处理组织的50 mL离心管以及用于淋巴细胞分离的密度梯度介质。
      注意：该介质通过离心形成密度梯度，有助于单个核细胞的分离。单个核细胞（包括淋巴细胞、单核细胞和急性淋巴细胞白血病细胞）将在介质与血浆之间的界面处形成一层。
  2. 白血病细胞的分离
    1. 使用一次性巴斯德吸管向15 mL离心管中加入5 mL用于淋巴细胞分离的密度梯度介质。随后，将10 mL脾脏和骨髓细胞混合液缓慢加至介质层上方。将离心管倾斜至约30°或更小的角度，沿管壁缓慢加入细胞混合液，以避免扰动密度介质层。
      注意：此步骤需谨慎操作，确保细胞不与密度介质混合。操作过程中的扰动可能导致离心时密度梯度无法正常形成。
    2. 将15 mL离心管置于水平转子中，在420 × g 条件下离心30分钟，不启用加速和刹车功能，以避免破坏已形成的分层。
      注意：白血病细胞将在密度介质与水相之间形成一层。
    3. 使用无菌一次性巴斯德吸管移除并弃去上层水相。用另一支无菌一次性巴斯德吸管收集白血病细胞层，并转移至一个新的15 mL离心管中。
      注意：若少量低密度介质随白血病细胞一同被吸出，无需担心。
  3. 白血病细胞的洗涤
    1. 向含有收集细胞的离心管中加入无菌1×PBS，直至总体积达到15 mL。
    2. 在300 × g 条件下离心5分钟，恢复最大加速度和制动。移除并弃去上清液。将细胞重悬于新的无菌冷1×PBS中。进行细胞计数及细胞活力检测。遵循标准细胞计数操作指南13。洗涤后的细胞可使用抗小鼠CD45抗体（mCD45）、抗人CD45抗体（hCD45）和抗人CD19抗体（hCD19）进行染色，随后进行洗涤步骤和数据采集。
      注意：若脾脏细胞和骨髓细胞分别在不同离心管中处理，可取部分样本通过流式细胞术评估这些器官中的肿瘤负荷。
  4. 白血病细胞的冷冻保存
    1. 在300 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，将细胞置于冰上保存。
    2. 配制冻存液，包含90%无菌冷胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）。每支冻存管使用1 mL该溶液。
    3. 在冰上将细胞重悬于上述冻存液中，浓度为2 × 107 个细胞/mL。将细胞分装至冻存管中。按照标准细胞培养冻存操作指南20进行冷冻保存。
      注意：这些细胞可用于后续分析。除冻存活细胞外，也可将细胞分装并用不同保存剂保存，用于后续DNA、RNA、蛋白质和代谢物分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在本研究中，前体B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）样本选自两类患者：一类为治疗反应良好者，其判断标准为第8天外周血中无白血病细胞，且在第15、33及78/96天骨髓中无残留白血病细胞；另一类为临床反应较差者，其最小残留病（MRD）评估结果不佳，且分子亚型与前一类患者相匹配，如表1所示。

通过尾静脉将选定的急性淋巴细胞白血病（ALL）样本移植到NSG小鼠体内，并通过对外周血进行流式细胞术分析，每周监测一次。流式细胞仪的数据采用流式细胞术分析软件进行处理，具体步骤如1.7至1.10所述。如步骤1.11所述，使用绘图与图形分析软件分析动物外周血中hCD45+细胞的百分比，并将相关的流式细胞术数据纳入该分析过程。

为了确保实验结果的准确性，必须分析白血病随时间推移的发展进程，该进程可通过动物体内移植成功的时...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

了解肿瘤性疾病背后的生物学机制，对于开发更有效的治疗方法以及改善患者预后至关重要。在儿童急性淋巴细胞白血病等疾病中，这些研究方法不仅有助于提高治愈率，而且对于那些标准治疗已达到治疗强度和耐受性极限的患者尤其具有价值。在疾病复发和治疗耐药的情况下，仅调整化疗方案已无法应对这一挑战。相反，必须揭示耐药的分子和细胞机制，从而为开发能够克服当前局限性的新型治疗药物提供依据。

为了阐明复发和治疗耐药的潜在机制，建立稳健且具有生理相关性的实验模型至关重要。在这些模型中，动物模型——尤其是小鼠系统——提供了一个独特的平台，可在体内微环境中研究白血病的进展，从而探索在体外无法获得的生物学动态。患者来源的异种移植（PDX）模型的出现极大地推动了该领域的发展，因其能够保留原始白血病的关键病理和遗传特征，并允许直接移植患者样本7,8。然而，对从复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）样本中获得的PDX细胞进行研究，并不能捕捉驱动复发和治疗耐药的复杂生物学事件...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢巴西博尔德里尼儿童中心（Centro Infantil Boldrini）以及所有为本研究捐赠样本的患者。Manuella M. Hoff 获得了巴西高等教育人员进修协调办公室（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil, CAPES）和圣保罗研究基金会（FAPESP，2024/03383-2）提供的博士后资助。José A. Yunes 获得了国家科学技术发展委员会（CNPq，308399/2021-8）授予的生产力研究奖学金。本研究得到了巴西卫生部 PRONON 项目（国家肿瘤诊疗支持计划，Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica，项目编号 NUP 25000.211174/2019-45）的研究经费支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL  注射器BD #309628器官收获
10 mL 注射用无菌水Halex Istar Indústria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/药物重悬
10X 红细胞裂解液BioLegend#420302小鼠血液样本处理
5通道细胞分析仪BD Biosciences658226R1流式细胞仪 
70 µm 细胞筛Falcom#352350器官收获
马来酸乙酰丙嗪注射液 Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1小鼠麻醉
APC 抗人 CD45 — 同型对照小鼠 IgG1 — HI30 克隆BioLegend#304037淋巴细胞染色
天冬酰胺酶 10000 UAginase/medac#88660100小鼠治疗
Brilliant-Violet 605 抗小鼠 CD45 — 同型对照小鼠 IgG2 — 30-F11 克隆BioLegend#103139淋巴细胞染色
柔红霉素Farmarin#116880025小鼠治疗
地塞米松Aché#00000066小鼠治疗
二甲基亚砜Sigma-Aldrich#589569淋巴细胞冷冻保存
一次性针头 — 0.60 × 25 mm (23G × 1’’)BD#300388器官收获
无菌一次性采血针 Yancheng Huida Medical Instruments https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/小鼠血液采集
乙二胺四乙酸Life technologies#15576-O28EDTA 溶液
胎牛血清Cultilab#F083淋巴细胞冷冻保存
流式细胞术数据分析软件 — 版本 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/流式细胞术分析
图形绘制与数据分析软件 — 版本 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/features图形绘制与分析
带固定针头的胰岛素注射器 1 mL FX 12.7 mm × 0.33 mmDescarpacke0342101小鼠移植与药物给药
氯胺酮注射液Sespo Indústria e Comércio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/小鼠麻醉
啮齿类动物多功能手术平台Kent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/小鼠手术操作
PE 抗人 CD19 — 同型对照小鼠 IgG1 — HIB19 克隆BioLegend#302208淋巴细胞染色
氯化钾Sigma-AldrichP3911-1KGPBS 溶液
磷酸氢二钾Sigma-AldrichP0662-1KGPBS 溶液
淋巴细胞分离试剂Cytiva#17-1440-02，6 × 100 mL/盒从收获器官中分离淋巴细胞
氯化钠Sigma-AldrichS9888-1kgPBS 溶液
磷酸氢二钠 Sigma-AldrichS9763-1KGPBS 溶液
无菌解剖镊 — 12 cm ABC 0170Lab Líder120小鼠外科手术
无菌剪刀 — 12 cm ABC 0321Lab Líder136小鼠外科手术
长春新碱Libbs#7896094208483小鼠治疗
赛拉嗪注射液Sespo Indústria e Comércio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/小鼠麻醉

参考文献

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。