该方案旨在描述一种基于诱导化疗反应动力学的小鼠急性淋巴细胞白血病复发模型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种起源于未成熟淋巴样前体细胞的肿瘤，也是最常见的儿童恶性肿瘤之一。尽管儿童ALL的治愈率接近90%，但复发和药物耐药仍是临床面临的挑战。在此背景下，体内研究癌症生物学至关重要，而利用小鼠模型建立的患者来源异种移植瘤（PDX）被广泛用于此类研究。然而，来自复发样本的PDX——或与诊断期样本相比——并不能完全揭示白血病复发启动与进展的潜在机制。本实验方案通过在小鼠体内建立B-ALL PDX的复发模型，可在白血病细胞获得药物耐药性的整个过程中动态收集白血病细胞。将B-ALL PDX细胞移植至小鼠后，采用四种常用于ALL治疗的药物联合方案进行处理，这些药物分别代表不同的作用机制：地塞米松、长春新碱、L-门冬酰胺酶和柔红霉素。经过为期4周的缓解诱导阶段后，动物进入休止期并持续监测是否出现复发。治疗与复发的循环过程重复进行，直至复发时间逐渐缩短，以此作为体内药物耐药性增强的替代指标。为探究复发和耐药的潜在机制，在每次治疗周期前后均采集白血病细胞，用于表型和遗传学分析。为验证该模型的有效性，测试了多种儿童ALL样本，包括对治疗反应良好和不良的病例，其分类依据为糖皮质激素治疗7天后外周血中原始细胞的存在情况，以及在第15、33和78/96天检测的微小残留病（MRD）水平。小鼠模型中观察到的结果与患者临床数据一致，证实该模型能够准确模拟患者对化疗的临床反应。该方法可实现对B-ALL复发及药物耐药的动态研究，有助于深入的机制探索以及新型治疗策略的开发。
引言
急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童中最常见的癌症。尽管近几十年来在高收入国家通过治疗已实现较高的治愈率，5年总生存率可达90%1，且在探索新治疗策略方面也投入了大量努力，但在发达国家仍有15%–20%的患者会复发，其生存率根据首次复发时间的早晚（诊断后18个月内为早期，36个月后为晚期）在30%–60%之间波动2,3。鉴于此，难治性及复发性ALL仍是亟待解决的临床难题。在诊断上，难治性ALL与复发性ALL的区别在于其对化疗药物敏感性差，而复发性ALL则指疾病在经历一段缓解期后再次出现。与其他癌症类似，ALL的特征是存在多种遗传学异常，包括非整倍体、染色体重排以及多种基因突变，这些异常与不同的治疗反应和复发风险相关4。由于ALL复发更常见于高危患者（这些患者已接受最大强度的化疗），进一步调整药物剂量或组合很可能不足以改善预后。因此，研究重点应转向揭示药物耐药和疾病复发的潜在机制。
鉴于此，研究人员试图了解化疗施加的选择压力如何促进耐药细胞的出现。现有大多数文献将复发归因于在诊断时已存在的耐药性恶性亚克隆的扩增5。然而，最近一项研究提示可能存在其他机制，例如调控转录程序的表观遗传学修饰，也可能导致复发
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均按照博尔德里尼儿童中心动物使用伦理委员会（CEUA/Boldrini 0047-2024）的规定和伦理准则进行。本研究中使用的白血病样本来自在博尔德里尼儿童中心接受治疗的患者的生物样本库冻存管，患者通过签署知情同意书同意其细胞用于研究。该项目已获得机构伦理委员会批准（CAAE 34601120.7.0000.5376）。
1. 白血病细胞移植与植入监测
- 小鼠移植用白血病样本的制备
- 解冻先前自患者骨髓穿刺液中获取并冻存的急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞样本。使用设定为37°C的水浴锅，通过在水中做圆周运动移动冻存管来解冻样本。
- 将解冻后的样本转移至15 mL离心管中。向样本中加入14 mL 1×无菌PBS，以洗涤细胞并去除冷冻保存液。在300 × g条件下离心该离心管 g 5 分钟后去除上清液。
- 移植液的制备
- 将解冻的细胞重悬于无菌的1×PBS中。每5-10 × 10⁶个细胞使用1 mL PBS。6 每只待移植动物使用100 µL PBS重悬活细胞。移植前将移植液置于冰上保存。
注意：细胞计数采用半自动方法进行13.
- 将解冻的细胞重悬于无菌的1×PBS中。每5-10 × 10⁶个细胞使用1 mL PBS。6 每只待移植动物使用100 µL PBS重悬活细胞。移植前将移植液置于冰上保存。
- 小鼠移植
-
....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在本研究中，前体B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）样本选自两类患者：一类为治疗反应良好者，其判断标准为第8天外周血中无白血病细胞，且在第15、33及78/96天骨髓中无残留白血病细胞；另一类为临床反应较差者，其最小残留病（MRD）评估结果不佳，且分子亚型与前一类患者相匹配，如表1所示。
通过尾静脉将选定的急性淋巴细胞白血病（ALL）样本移植到NSG小鼠体内，并通过对外周血进行流式细胞术分析，每周监测一次。流式细胞仪的数据采用流式细胞术分析软件进行处理，具体步骤如1.7至1.10所述。如步骤1.11所述，使用绘图与图形分析软件分析动物外周血中hCD45+细胞的百分比，并将相关的流式细胞术数据纳入该分析过程。
为了确保实验结果的准确性，必须分析白血病随时间推移的发展进程，该进程可通过动物体内移植成功的时.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
了解肿瘤性疾病背后的生物学机制，对于开发更有效的治疗方法以及改善患者预后至关重要。在儿童急性淋巴细胞白血病等疾病中，这些研究方法不仅有助于提高治愈率，而且对于那些标准治疗已达到治疗强度和耐受性极限的患者尤其具有价值。在疾病复发和治疗耐药的情况下，仅调整化疗方案已无法应对这一挑战。相反，必须揭示耐药的分子和细胞机制，从而为开发能够克服当前局限性的新型治疗药物提供依据。
为了阐明复发和治疗耐药的潜在机制，建立稳健且具有生理相关性的实验模型至关重要。在这些模型中，动物模型——尤其是小鼠系统——提供了一个独特的平台，可在体内微环境中研究白血病的进展，从而探索在体外无法获得的生物学动态。患者来源的异种移植（PDX）模型的出现极大地推动了该领域的发展，因其能够保留原始白血病的关键病理和遗传特征，并允许直接移植患者样本7,8。然而，对从复发性急性淋巴细胞白血病（ALL）样本中获得的PDX细胞进行研究，并不能捕捉驱动复发和治疗耐药的复杂生物学事件.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢巴西博尔德里尼儿童中心（Centro Infantil Boldrini）以及所有为本研究捐赠样本的患者。Manuella M. Hoff 获得了巴西高等教育人员进修协调办公室（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil, CAPES）和圣保罗研究基金会（FAPESP，2024/03383-2）提供的博士后资助。José A. Yunes 获得了国家科学技术发展委员会（CNPq，308399/2021-8）授予的生产力研究奖学金。本研究得到了巴西卫生部 PRONON 项目（国家肿瘤诊疗支持计划，Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica，项目编号 NUP 25000.211174/2019-45）的研究经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD | #309628 | 器官收获 |
| 10 mL 注射用无菌水 | Halex Istar Indústria Farmaceutica LTDA | https://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/ | 药物重悬 |
| 10X 红细胞裂解液 | BioLegend | #420302 | 小鼠血液样本处理 |
| 5通道细胞分析仪 | BD Biosciences | 658226R1 | 流式细胞仪 |
| 70 µm 细胞筛 | Falcom | #352350 | 器官收获 |
| 马来酸乙酰丙嗪注射液 | Vetnil LTDA | https://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1 | 小鼠麻醉 |
| APC 抗人 CD45 — 同型对照小鼠 IgG1 — HI30 克隆 | BioLegend | #304037 | 淋巴细胞染色 |
| 天冬酰胺酶 10000 U | Aginase/medac | #88660100 | 小鼠治疗 |
| Brilliant-Violet 605 抗小鼠 CD45 — 同型对照小鼠 IgG2 — 30-F11 克隆 | BioLegend | #103139 | 淋巴细胞染色 |
| 柔红霉素 | Farmarin | #116880025 | 小鼠治疗 |
| 地塞米松 | Aché | #00000066 | 小鼠治疗 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | #589569 | 淋巴细胞冷冻保存 |
| 一次性针头 — 0.60 × 25 mm (23G × 1’’) | BD | #300388 | 器官收获 |
| 无菌一次性采血针 | Yancheng Huida Medical Instruments | https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/ | 小鼠血液采集 |
| 乙二胺四乙酸 | Life technologies | #15576-O28 | EDTA 溶液 |
| 胎牛血清 | Cultilab | #F083 | 淋巴细胞冷冻保存 |
| 流式细胞术数据分析软件 — 版本 10.10.0 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/ | 流式细胞术分析 |
| 图形绘制与数据分析软件 — 版本 9.5.1 | Dotmatics | https://www.graphpad.com/features | 图形绘制与分析 |
| 带固定针头的胰岛素注射器 1 mL FX 12.7 mm × 0.33 mm | Descarpack | e0342101 | 小鼠移植与药物给药 |
| 氯胺酮注射液 | Sespo Indústria e Comércio LTDA | https://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/ | 小鼠麻醉 |
| 啮齿类动物多功能手术平台 | Kent Scientific Corporation | https://www.kentscientific.com/products/surgisuite/ | 小鼠手术操作 |
| PE 抗人 CD19 — 同型对照小鼠 IgG1 — HIB19 克隆 | BioLegend | #302208 | 淋巴细胞染色 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | PBS 溶液 |
| 磷酸氢二钾 | Sigma-Aldrich | P0662-1KG | PBS 溶液 |
| 淋巴细胞分离试剂 | Cytiva | #17-1440-02，6 × 100 mL/盒 | 从收获器官中分离淋巴细胞 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | PBS 溶液 |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | PBS 溶液 |
| 无菌解剖镊 — 12 cm ABC 0170 | Lab Líder | 120 | 小鼠外科手术 |
| 无菌剪刀 — 12 cm ABC 0321 | Lab Líder | 136 | 小鼠外科手术 |
| 长春新碱 | Libbs | #7896094208483 | 小鼠治疗 |
| 赛拉嗪注射液 | Sespo Indústria e Comércio LTDA | https://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/ | 小鼠麻醉 |
参考文献
- Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
- Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Pre....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
